CN106987634B - 血浆外泌体源性miRNAs在制备早期诊断原发性肝癌的试剂盒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了血浆外泌体源性miRNAs在制备早期诊断原发性肝癌的试剂盒中的应用，所述血浆外泌体源性miRNAs由hsa‑miR‑466、hsa‑miR‑296‑5p和hsa‑miR‑613组成。本发明提供的血浆外泌体源性miRNAs hsa‑miR‑466、hsa‑miR‑296‑5p和hsa‑miR‑613联合用于诊断原发性肝癌和非原发性肝癌(包括良性肝病和健康对照)的诊断性能优异，准确度和灵敏度高，特异性强，可以用于开发成早期诊断原发性肝癌的诊断试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于疾病诊断领域，涉及诊断试剂盒的开发，具体涉及血浆外泌体源性miRNAs在制备早期诊断原发性肝癌的试剂盒中的应用。
背景技术
原发性肝癌(primay hepatic cancer，PHC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率在消化系统恶性肿瘤中居第三位，在世界上的发病率居第五位。
原发性肝癌是高侵袭性的恶性肿瘤，早期症状不明显，导致大多数患者就诊较晚。中、晚期主要病征为右上腹疼痛、上腹胀满、发热、乏力、消瘦，晚期常有腹水、黄疸。在确诊时往往已属晚期，只有10％-30％患者能接受根治性切除手术，导致整体预后很差，一般平均存活时间只有3个月左右。这些患者大部分都是家庭经济支柱，因此，对个人、家庭及社会有很大影响，有效的预防、及早的诊断和有效的治疗十分重要。近年来，原发性肝癌治疗效果有所提高，一个很重要的原因就是以甲胎蛋白(AFP)为基础的血清学检测技术提高了早期诊断率，进而提高了患者的早期处理比例。但用AFP进行筛查有局限性，有20％-30％的原发性肝癌患者AFP呈阴性或低浓度水平。
外泌体是由多种细胞分泌的囊泡小体，其组成成分包括蛋白质、mRNA、miRNA等多种物质，能够参与细胞间的物质交换，在细胞的生理、病理过程中发挥重要作用。外泌体在外周血、尿液、唾液等体液中具有很高的丰度，而不同组织来源的外泌体在组成和功能方面存在差异，这就为通过分析外泌体成分的变化来判断疾病的变化提供了基础。肿瘤细胞来源的外泌体是调控肿瘤的发生、发展的重要方式之一，对肿瘤来源的外泌体成分的分析可以辅助肿瘤的早期诊断。最近，多项研究结果提示外周血中异常的miRNA表达谱与某些特征性的肿瘤疾病密切相关，而外周血中相当一部分miRNA是以外泌体形式存在的，因此已有研究人员将外周血中外泌体源性miRNA开发为一种新型的疾病诊断标志物。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术对原发性肝癌早期诊断的不足，以及现有的甲胎蛋白法对部分原发性肝癌患者灵敏度和特异性低的缺陷，提供一组用于早期诊断原发性肝癌的血浆外泌体源性miRNAs标记物，以用于制备早期诊断原发性肝癌的试剂盒。
实现本发明上述目的技术方案如下：
血浆外泌体源性miRNAs联合用于制备早期诊断原发性肝癌的试剂盒的用途，所述血浆外泌体源性miRNAs由hsa-miR-466、hsa-miR-296-5p和hsa-miR-613组成。
一种用于早期诊断原发性肝癌的试剂盒，含有上述血浆外泌体源性miRNAs的引物，所述引物包括将miRNAs逆转录为cDNA的逆转录引物和用于以cDNA为模板进行PCR扩增的上游引物、下游引物。
优选地，hsa-miR-466逆转录引物的序列如SEQ ID NO.5所示，上游引物的序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.13所示。
优选地，hsa-miR-296-5p逆转录引物的序列如SEQ ID NO.6所示，上游引物的序列如SEQ ID NO.10所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.13所示。
优选地，hsa-miR-613逆转录引物的序列如SEQ ID NO.7所示，上游引物的序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.13所示。
优选地，上述试剂盒还含有逆转录反应和PCR扩增反应用到的酶和试剂。
本发明的突出优点：
本发明提供的血浆外泌体源性miRNAs hsa-miR-466、hsa-miR-296-5p和hsa-miR-613联合用于诊断原发性肝癌和非原发性肝癌(包括良性肝病和健康对照)的诊断性能优异，准确度和灵敏度高，特异性强，可以用于开发成早期诊断原发性肝癌的诊断试剂盒。
附图说明
图1为本发明三个目标miRNAs联合用于诊断原发性肝癌和非原发性肝癌(包括良性肝病和健康对照)的ROC曲线图。
具体实施方式
下面就结合实施例具体介绍本发明的实质性内容，由于篇幅原因，实验过程的描述无法做到非常详细，凡是实验中未详细描述的部分均为本领域技术人员熟知的常规操作。
一、实验样本
1、测试集样本
122例各型肝病患者均为2014年3月至2015年3月间江苏省中西医结合医院门诊或住院患者，其中原发性肝癌组(PHC组)78例，良性肝病组44例(肝硬化14例，急性肝炎12例，慢性肝炎12例，脂肪肝6例)，原发性肝癌患者均经病理学或影像学检查证实。健康对照组36例，男20例，女16例，年龄20-84岁，平均年龄55.2±9.6岁，均为同期该院体检正常并排除其他慢性疾病的健康者。
PHC组和非PHC组(包括良性肝病和健康对照)性别年龄无显著差异。
2、验证集样本
134例各型肝病患者均为2014年3月至2015年3月间南京医科大学第二附属医院门诊或住院患者，其中原发性肝癌组(PHC组)82例，良性肝病组52例(肝硬化14例，急性肝炎16例，慢性肝炎14例，脂肪肝8例)，原发性肝癌患者均经病理学或影像学检查证实。健康对照组42例，男20例，女22例，年龄21-82岁，平均年龄54.6±10.2岁，均为同期该院体检正常并排除其他慢性疾病的健康者。
PHC组和非PHC组(包括良性肝病和健康对照)性别年龄无显著差异。
所有样本收集过程中，肝病诊断标准和肿瘤诊断标准符合2000年中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会联合修订的“病毒性肝炎防治方案”中病毒性肝炎诊断标准及中华人民共和国卫生部2011年制定的《原发性肝癌诊疗规范》中的肝癌诊断标准。
二、实验方法
1、血浆样本收集及血浆外泌体分离
用EDTA抗凝管分别采集患者和健康对照的静脉血5ml，静置10min后，常温下以3000r/min离心10min，可见分为两层，用移液枪吸取上层透明淡黄色液体即血浆，分装成1ml于1.5mlEP管后，置于-80℃保存。
使用Invitrogen外泌体提取试剂盒提取血浆外泌体，按说明书操作，具体步骤如下：
(1)样品准备：取出于-80℃存储的血浆样品置37℃水浴至完全液态，并置于冰上；室温下2000×g离心20min去除细胞和碎片；用移液枪吸取上清液至新的离心管，室温下10000×g离心20min以除去碎片；吸取上清液至新的离心管，并将其放置在冰上直至开始分离。
(2)外泌体分离：吸取适当体积血浆至新离心管中，加入0.5×血浆体积的1×PBS，涡旋混匀样本；加入0.2×(血浆体积+1×PBS体积)的外泌体沉淀试剂至样品中，涡旋混匀血浆/试剂混合物；在室温下孵育10min后，室温下10000×g离心5min，用移液枪吸出上清液并丢弃，外泌体是试管底部的颗粒，将所得沉淀置于-80℃存储。
2、外泌体总RNA提取(Trizol法)及浓度测定
往外泌体沉淀中加入1ml Trizol，混匀后于4℃放置10min；按比例(1ml Trizol:200μl氯仿)加入氯仿200μl，剧烈振荡，4℃放置15min，4℃12000×g离心15min后吸取上层水相至新EP管；按比例(1ml Trizol:500μl异丙醇)加入异丙醇500μl，混匀，4℃放置10min，4℃12000×g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；按比例(1ml Trizol:1ml75％乙醇)加入75％乙醇1ml，温和振荡，4℃12000g离心5min，尽量弃上清(重复75％乙醇洗涤一次)，于室温下晾干；加10μl DEPC水溶解RNA，吸取2μl RNA溶液用于测定浓度，其余置于-80℃保存。将2μl RNA溶液在紫外分光光度计中测定RNA浓度，调节OD260/OD280于1.9-2.1间。
3、qRT-PCR法测定目标miRNA相对浓度
按照Thermo Scientific公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行cDNA合成，20μl逆转录PCR反应体系如下：DEPC处理水13.8μl，总RNA1μl，miRNAstem-loop primer 0.25μl，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反应体系包括buffer 4μl，dNTPs 0.5μl，Rnase-inhibitor 0.2μl，M-MLV 0.25μl。置于PCR扩增仪中预变性25℃5min，退火42℃60min，延伸70℃5min。将逆转录产物于-20℃短暂保存，或-70℃长期保存。
上述RNA逆转录后即获得miRNA的cDNA模板。按照美国Roche Applied Science公司的FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)说明书进行实时荧光定量PCR反应，10μl反应体系如下：cDNA 0.2μl，上游引物和下游引物各0.3μl，FastStart UniversalSYBR Green Master 5μl，DEPC处理水4.2μl，反应条件：95℃变性15min，60℃退火延伸30s，50个循环。
目标miRNAs和内参miRNA的逆转录引物和qRT-PCR引物序列如表1所示。
表1目标miRNAs和内参miRNA的逆转录引物和qRT-PCR引物序列
4、数据分析
miRNA表达量的处理方法为ΔCT法。CT为反应达到阈值时所需循环数，各miRNA相对于内参的表达量用方程2-ΔCT表示，其中ΔCT＝CT目标miRNA-CT内参。数据分析采用SPSS20.0软件进行，数据表示方法为均值±标准误差，组间比较采用t检验，P<0.05认为有统计学差异。以目标miRNAs的相对内参表达量为自变量，组别为应变量，建立肝癌诊断的Logistic回归模型，回归模型的拟合度采用似然比检验，回归参数估计值采用Wald检验。根据ROC曲线及曲线下面积(AUC)评估目标miRNAs联合诊断的敏感性和特异性。
三、实验结果
1、目标miRNAs在测试集样本中的表达水平
与健康对照组比，良性肝病组中血浆外泌体源性miRNAs hsa-miR-466、hsa-miR-296-5p和hsa-miR-613的相对内参表达量2-ΔCT均有上调，但上调不显著；与健康对照组和良性肝病组比，原发性肝癌组中三个目标miRNAs的相对内参表达量2-ΔCT均显著上调。于是，进一步将测试集样本分为原发性肝癌组(PHC组)和非原发性肝癌组(非PHC组，包括健康对照和良性肝病)。PHC组相对于非PHC组各miRNAs的相对表达量的变化倍数如表2。
表2PHC组相对于非PHC组各miRNAs的相对内参表达量的变化倍数
| 目标miRNAs | 倍数 | P值 |
| hsa-miR-466 | 3.84 | 0.0005 |
| hsa-miR-296-5p | 2.92 | 0.0017 |
| hsa-miR-613 | 4.26 | ＜0.0001 |
2、测试集目标miRNAs的ROC曲线分析
以测试集PHC组和非PHC组所有样本中hsa-miR-466、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-613的相对内参表达量作为自变量(设X1＝hsa-miR-466相对内参表达量，X2＝hsa-miR-296-5p相对内参表达量，X3＝hsa-miR-613相对内参表达量)，以组别作为应变量(PHC组设为1，非PHC组设为2)，对hsa-miR-466、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-613在PHC组和非PHC组样本中的相对内参表达量进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程；再将各样本中hsa-miR-466、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-613的相对内参表达量代入该二元逻辑回归方程，即可得到各个样本的回归值，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线。
逻辑回归方程为：Logit＝-4.482+0.282X1+0.134X2+1.236X3。模型拟合参数如表3。
表3目标miRNAs联合诊断PHC的Logistic模型拟合参数
| 自变量 | 系数 | 标准误 | Wald检验 | P值 | OR值 |
| hsa-miR-466 | 0.282 | 0.003 | 7.214 | 0.00 | 0.00 |
| hsa-miR-296-5p | 0.134 | 0.008 | 42.187 | 0.01 | 1.02 |
| hsa-miR-613 | 1.236 | 0.137 | 38.526 | 0.00 | 1.68 |
| 截距 | -4.482 | 1.186 | 32.279 | 0.00 | 0.00 |
ROC曲线如图1所示，ROC曲线下面积为0.966，最佳cutoff值为0.638(诊断阈值)，最佳cutoff值处灵敏度为96.24％，特异性为95.82％。ROC曲线下面积AUC作为诊断试验真实性评价的固有准确度指标已被普遍认可，完全无价值的诊断试验AUC为0.5，理想的诊断试验AUC为1；一般认为，AUC在0.5-0.7之间时诊断价值较低，在0.7-0.9之间时具有一定的诊断价值，在0.9以上时诊断价值较高。因此，hsa-miR-466、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-613联合诊断PHC和非PHC具有较高诊断价值，且AUC显著优于hsa-miR-466、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-613单个用于诊断区分PHC和非PHC(AUC分别为0.687、0.545、0.604)。
3、验证集独立验证目标miRNAs联合诊断PHC的准确性
在验证集中，基于二元逻辑回归方程(Logit＝-4.482+0.282X1+0.134X2+1.236X3)将验证集所有样本中3个目标microRNAs的相对内参表达量作二元逻辑回归变换，计算出所有样本中3个目标microRNAs相对内参表达量的逻辑回归值。低于最佳cutoff值0.638(诊断阈值)的预测为非PHC，高于最佳cutoff值0.638的预测为PHC，最后计算出以该3个目标microRNAs表达水平诊断PHC的准确率、灵敏度和特异性。
hsa-miR-466、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-613在验证集中联合诊断PHC的效能如表4。
表4目标miRNAs在验证集中诊断PHC的效能
| 灵敏度 | 特异性 | 诊断准确率 |
| 98.7％(77/78) | 98.8％(79/80) | 98.7％(156/158) |
由上表可以看出，在验证集中，hsa-miR-466、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-613联合用于诊断PHC的准确度极高，达98.7％，158个样本仅有2个样本诊断错误。
上述实验表明，本发明提供的血浆外泌体源性miRNAs hsa-miR-466、hsa-miR-296-5p和hsa-miR-613联合用于诊断原发性肝癌和非原发性肝癌(包括良性肝病和健康对照)的诊断性能优异，准确度和灵敏度高，特异性强，可以用于开发成早期诊断原发性肝癌的诊断试剂盒。
上述实施例是对本发明实质性内容的体现，用于更好地解释本发明，但本领域技术人员应当知晓，不应将本发明的保护范围局限于上述具体的实施例。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京盖斯夫医药科技有限公司
<120> 血浆外泌体源性miRNAs在制备早期诊断原发性肝癌的试剂盒中的应用
<130> 1
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
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auacacauac acgcaacaca cau 23
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cgccgcagtg cgtgtcgtgg agt 23
Claims (2)
1.一种用于早期诊断原发性肝癌的试剂盒，含有血浆外泌体源性miRNAs的引物，其特征在于：所述血浆外泌体源性miRNAs由hsa-miR-466、hsa-miR-296-5p和hsa-miR-613组成，所述引物包括将miRNAs逆转录为cDNA的逆转录引物和用于以cDNA为模板进行PCR扩增的上游引物、下游引物；其中，所述hsa-miR-466的逆转录引物序列如SEQ ID NO.5所示，上游引物序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物序列如SEQ ID NO.13所示；所述hsa-miR-296-5p的逆转录引物序列如SEQ ID NO.6所示，上游引物序列如SEQ ID NO.10所示，下游引物序列如SEQ ID NO.13所示；所述hsa-miR-613的逆转录引物序列如SEQ ID NO.7所示，上游引物序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物序列如SEQ ID NO.13所示。
2.根据权利要求1所述的用于早期诊断原发性肝癌的试剂盒，其特征在于：还含有逆转录反应和PCR扩增反应用到的酶和试剂。
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| Title |
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| MicroRNA-466 inhibits tumor growth and bone metastasis in prostate cancer by direct regulation of osteogenic transcription factor RUNX2;Melissa Colden等;《Cell Death and Disease》;20170126;第8卷;摘要 * |
| miR-296 inhibits proliferation and induces apoptosis by targeting FGFR1 in human hepatocellular carcinoma;Liyan Wang等;《FEBS Letters》;20161021;第590卷(第23期);摘要，图4A * |
| miR-613 inhibits the growth and invasiveness of human;Wenyao Wang等;《Biochemical and Biophysical Research Communications》;20160402;第473卷(第4期);摘要 * |
| RUNX2 promotes hepatocellular carcinoma cell migration and invasion by upregulating MMP9 expression;Qian Wang等;《Oncology Reports》;20160919;第36卷;摘要 * |
| 血清四种microRNAs联合诊断早期原发性肝细胞肝癌的初步分析;左铎;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20160415;摘要第1页第2-3段，摘要第2页1、5-7段 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106987634A (zh) | 2017-07-28 |
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