CN114875146A - 检测血浆中tRF型胃癌分子标记物以及在制备胃癌辅助诊断试剂盒的应用 - Google Patents

检测血浆中tRF型胃癌分子标记物以及在制备胃癌辅助诊断试剂盒的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测血浆中tRF型胃癌分子标记物以及在制备胃癌辅助诊断试剂盒的应用，其特征在于：包括用于检测血浆样本中tRF‑18‑79MP9P04、tRF‑30‑87R8WP9N1EWJ、tRF‑21‑V2989UV3B以及tRF‑33‑P4R8YP9LON4VDP的试剂，与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的试剂盒将tRF‑18‑79MP9P04、tRF‑30‑87R8WP9N1EWJ、tRF‑21‑V2989UV3B以及tRF‑33‑P4R8YP9LON4VDP联合作为早期胃癌辅助诊断的标志物，能准确地完成靶标分子的绝对定量检测，及胃早癌的筛查与鉴别。

Description

检测血浆中tRF型胃癌分子标记物以及在制备胃癌辅助诊断 试剂盒的应用
技术领域
本发明涉及一种血浆中转运RNA的检测方法，尤其涉及一种血浆中tRF型胃癌分子标记物的检测及其应用。
背景技术
根据世界卫生组织2021年报告的流行病学统计数据，2020年世界范围内胃癌的新发病例超过100万例，因胃癌死亡病例超过76万，胃癌是全球排名第五位的恶性肿瘤。在我国，根据2020年发布的流行病学调查显示，2015年胃癌相关性死亡是仅次于肺癌、肝癌的癌症相关性死亡原因。
早诊断早治疗对于改善胃癌的高死亡率具有重大意义。目前对于胃癌诊断的金标准是内窥镜取组织进行病理检查，但由于其有创性在一定程度上限制了它的推广，而传统的肿瘤标志物如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、糖类抗原125(carbohydrateantigen 125,CA125)和糖类抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9,CA19-9)等敏感性和特异性均不高。因此，开发新型胃癌相关标志物对于提高胃癌的早期诊断效率，具有重要的临床意义。
近年来，随着高通量测序技术的发展，人们逐渐发现一类新型非编码RNA——tRNA衍生片段(tRNA derived fragment，tRF)，是由tRNA前体(pre-tRNA)或成熟tRNA在特异性核糖核酸酶(如Dicer酶或血管生成素等)作用下裂解而成。tRF具有多种生物学功能，如参与逆转录调控、逆转录后调控、翻译调控和表观遗传调控等。另外，它们还参与多种癌症的发生发展。因此，它们作为胃癌诊断标志物具有较大潜力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种用于胃癌辅助诊断的检测试剂盒。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该用于胃癌辅助诊断的检测试剂盒，其特征在于：包括用于检测血浆样本中tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B以及tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的其中一个或是四个联合的试剂，其中：
tRF-18-79MP9P04的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，GUUUCCGUAGUGUAGUGG，所述tRF-18-79MP9P04在胃早癌患者血浆中显著下调；所述引物为：F1：5'-GTCCCTGTTGTGTTTCCGTAG 3'；R1：5'-GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT-3'；
tRF-30-87R8WP9N1EWJ的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，UCCCUGGUGGUCUAGUGGUUAGGAUUCGGC，所述tRF-30-87R8WP9N1EWJ在胃早癌患者血浆中显著上调；F2：5'-GTGTCCCTGGTGGTCTAGTGGTT-3'；R2：5'-GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT-3'；
tRF-21-V2989UV3B的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，UAGGAUGGGGUGUGAUAGGUA，所述tRF-21-V2989UV3B在胃早癌患者血浆中显著上调；F3：5'-CGTTGGTAGGATGGGGTGTGA-3'；R3：5'-GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT-3'；
tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，GCAUGGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGCCUG；
所述tRF-33-P4R8YP9LON4VDP在胃早癌患者血浆中显著下调；F4：5'-GCATGGGTGGTTCAGTGGTAGA-3'；R4：5'-GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT-3'。
进一步地，所述试剂盒还包括有tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B以及tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的逆转录引物序列，其中，
tRF-18-79MP9P04的逆转录序列如SEQ ID No.5所示：5'-GCAGACGAGGGTACCTCCTCTCTTCTCTACTCGTGTCCTACCCTCGTCTGCCCACTA-3'；
tRF-30-87R8WP9N1EWJ的逆转录序列如SEQ ID No.6所示：5'-GCAGACGAGGGTACCTCCTCTCTTCTCTACTCGTGTCCTACCCTCGTCTGCGCCGAA-3'；
tRF-21-V2989UV3B的逆转录序列如SEQ ID No.7所示：5'-GCAGACGAGGGTACCTCCTCTCTTCTCTACTCGTGTCCTACCCTCGTCTGCTACCTA-3'；
tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的逆转录序列如SEQ ID No.8所示：5'-ACAGACGAGGGTACCTCCTCTCTTCTCTACTCGTGTCCTACCCTCGTCTGTCAGGCG-3'。
进一步地，所述试剂盒还包括有tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B以及tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的探针引物序列，其中，
tRF-18-79MP9P04的探针引物序列如SEQ ID No.9所示：5'-FAM-TGTCCTACCCTCGTCTGCCCACTA-TAMRA-3'；
tRF-30-87R8WP9N1EWJ的探针引物序列如SEQ ID No.10所示：5'-FAM-GGATTCGGCGCAGACGAGGGTAGGA-TAMRA-3'；
tRF-21-V2989UV3B的探针引物序列如SEQ ID No.11所示：5'-FAM-AGGTAGCAGACGAGGGTAGGACAC-TAMRA-3'；
tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的探针引物序列如SEQ ID No.12所示：5'-FAM-TTCTCGCCTGACAGACGAGGGTAGGA-TAMRA-3'。
本发明还提供一种检测血浆中tRF分子标记物的方法，其特征在于，所述tRF分子标记物为权利要求1中所述的tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B以及tRF-33-P4R8YP9LON4VDP，所述的方法包括如下步骤：
(1)采集血液，提取血浆中的总RNA；
(2)将总RNA逆转录成cDNA；
(3)利用tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B以及tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的特异性扩增引物对步骤(2)的cDNA溶液进行荧光定量PCR检测，反应结束后检测荧光信号值并设定Y值；
(4)获得每个样品的Cq值，也就是y值，并按所检测tRF对应的标准曲线计算出相应的拷贝数x后，将按照400×10x/3计算每个样品对应1mL血浆时的拷贝数，并进行早期胃癌患者1mL血浆内tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B、tRF-33-P4R8YP9LON4VDP拷贝数的统计学分析。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的试剂盒将tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B以及tRF-33-P4R8YP9LON4VDP单独或联合使用以作为早期胃癌辅助诊断的标志物，可根据检测目的选择相应的检测靶标进行绝对定量检测，仅需少量样品即可快速、准确地完成靶标分子的绝对定量检测，及胃早癌的筛查与鉴别，灵敏度高，准确率高，检测快速。
附图说明
图1为本发明实施例一中胃癌血浆中tiRNA下一代测序结果图；
图2为本发明中胃癌辅助诊断的联合检测试剂盒联合检测的ROC曲线图；
图3为本发明实施例3中tRF-18-79MP9P04在健康人血浆和早期胃癌患者血浆中水平的结果图；
图3-1为本发明实施例3中利用tRF-18-79MP9P04单独检测的ROC曲线图；
图4为本发明实施例3中胃癌血浆中tRF-18-79MP9P04的扩增曲线图；
图5为本发明实施例3中tRF-18-79MP9P04的质粒标准品荧光定量标准曲线图；
图6为本发明实施例4中tRF-30-87R8WP9N1EWJ在健康人血浆和早期胃癌患者血浆中水平的结果图；
图6-1为本发明实施例4中利用tRF-30-87R8WP9N1EWJ单独检测的ROC曲线图；
图7为本发明实施例4中胃癌血浆中tRF-30-87R8WP9N1EWJ的扩增曲线图；
图8为本发明实施例4中tRF-30-87R8WP9N1EWJ的质粒标准品荧光定量标准曲线图；
图9为本发明实施例5中tRF-33-P4R8YP9LON4VDP在健康人血浆和早期胃癌患者血浆中水平的结果图；
图9-1为本发明实施例5中利用tRF-33-P4R8YP9LON4VDP单独检测的ROC曲线图；
图10为本发明实施例5中胃癌血浆中tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的扩增曲线图；
图11为本发明实施例5中tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的质粒标准品荧光定量标准曲线图；
图12为本发明实施例6中tRF-21-V2989UV3B在健康人血浆和早期胃癌患者血浆中水平的结果图；
图12-1为本发明实施例6中利用tRF-21-V2989UV3B单独检测的ROC曲线；
图13为本发明实施例6中胃癌血浆中tRF-21-V2989UV3B的扩增曲线图；
图14为本发明实施例6中tRF-21-V2989UV3B的质粒标准品荧光定量标准曲线图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例一
检测tRF-18-79MP9P0、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B和tRF-33-P4R8YP9LON4VDP在胃癌组织和正常胃癌组织中的表达情况：
测序检测：采用美国Arraystar公司的tRF测序试剂采用下一代测序方法检测胃癌组织和正常组织中tRF的水平。
结果分析：结果如图1所示，通过分析胃癌组织和正常胃癌组织获得表达显著上调和下调的tRNA衍生片段的分子标记物tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B和tRF-33-P4R8YP9LON4VDP分别在胃癌组织和正常组织中差异达5.12、8.73和173.11倍，如图1自上而下第二个箭头和表1所示，AS-tDR-008225在MINTbase数据库中命名为tRF-30-87R8WP9N1EWJ，而如图1自上而下第三个箭头和表1所示，AS-tDR-009407在MINTbase数据库中命名为tRF-21-V2989UV3B，而如图1自上而下第一个箭头和表1所示，AS-tDR-001290在MINTbase数据库中命名为tRF-33-P4R8YP9LON4VDP，提示tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B和tRF-33-P4R8YP9LON4VDP在胃癌中可能作为一个重要基因发挥作用。
表1.胃癌血浆中筛选差异表达的tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B和tRF-33-P4R8YP9LON4VDP
Figure BDA0003599937650000051
而tRF-18-79MP9P04是结合tRF和tiRNA数据库MINTbase(https:// cm.jefferson.edu/MINTbase/)挑选出来。
实施例2
本用于胃癌辅助诊断的检测试剂盒，包括用于检测血浆样本中tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B以及tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的试剂，其中：
tRF-18-79MP9P04的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述tRF-18-79MP9P04在胃早癌患者血浆中显著下调；所述引物为：F1：5'-GTCCCTGTTGTGTTTCCGTAG 3'；R1：5'-GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT-3'；
tRF-18-79MP9P04的逆转录序列如SEQ ID No.5所示：5'-GCAGACGAGGGTACCTCCTCTCTTCTCTACTCGTGTCCTACCCTCGTCTGCCCACTA-3'；
tRF-18-79MP9P04的探针引物序列如SEQ ID No.9所示：5'-FAM-TGTCCTACCCTCGTCTGCCCACTA-TAMRA-3'；
tRF-30-87R8WP9N1EWJ的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述tRF-30-87R8WP9N1EWJ在胃早癌患者血浆中显著上调；F2：5'-GTGTCCCTGGTGGTCTAGTGGTT-3'；R2：5'-GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT-3'；
tRF-30-87R8WP9N1EWJ的逆转录序列如SEQ ID No.6所示：5'-GCAGACGAGGGTACCTCCTCTCTTCTCTACTCGTGTCCTACCCTCGTCTGCGCCGAA-3'；
tRF-30-87R8WP9N1EWJ的探针引物序列如SEQ ID No.10所示：5'-FAM-GGATTCGGCGCAGACGAGGGTAGGA-TAMRA-3'；
tRF-21-V2989UV3B的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述tRF-21-V2989UV3B在胃早癌患者血浆中显著上调；F3：5'-CGTTGGTAGGATGGGGTGTGA-3'；R3：5'-GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT-3'；
tRF-21-V2989UV3B的逆转录序列如SEQ ID No.7所示：5'-GCAGACGAGGGTACCTCCTCTCTTCTCTACTCGTGTCCTACCCTCGTCTGCTACCTA-3'；
tRF-21-V2989UV3B的探针引物序列如SEQ ID No.11所示：5'-FAM-AGGTAGCAGACGAGGGTAGGACAC-TAMRA-3'；
tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述tRF-33-P4R8YP9LON4VDP在胃早癌患者血浆中显著下调；F4：5'-GCATGGGTGGTTCAGTGGTAGA-3'；R4：5'-GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT-3'。
tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的逆转录序列如SEQ ID No.8所示：5'-ACAGACGAGGGTACCTCCTCTCTTCTCTACTCGTGTCCTACCCTCGTCTGTCAGGCG-3'。
tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的探针引物序列如SEQ ID No.12所示：5'-FAM-TTCTCGCCTGACAGACGAGGGTAGGA-TAMRA-3'。
具体可以参考如下表1中tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B以及tRF-33-P4R8YP9LON4VDP设计的引物序列；
表1 设计的tRF引物序列
Figure BDA0003599937650000061
Figure BDA0003599937650000071
本实施例选取了宁波大学医学院附属医院的胃癌及健康人血浆样本40例，均从本人或家属获得知情同意，相关病人信息完整并按规定建立临床资料数据库。
(1)所有血液样本均严格按照标本采集规范进行采集。抽取10mL外周血于普通EDTA抗凝的采血管中，立即置于4℃冰箱，静置30min，4℃条件下500g离心20min，以去除血浆中残留的血细胞成分，吸取上层血浆，转移至一个新的离心管中，4℃条件下1500g离心20min，以彻底去除血浆中残存的细胞碎片等物质，将所得血浆分装，于-80℃冰箱冻存；
(2)血浆总RNA提取：采用美国Invitrogen公司的TRIzol LS试剂，吸取250μL血浆样本至一新的无核酸酶的1.5mL离心管，加入750μL的TRIzol LS试剂，扣紧离心管管盖后，旋涡震荡10s，4℃冰箱放置5min；加入200μL三氯甲烷，扣紧离心管管盖后，手摇震荡6次，4℃冰箱放置5min，4℃12000rpm离心15min，使管内液体分为清晰的3层；准备一新的无核酸酶的1.5mL离心管，加入500μL异丙醇，将离心后的标本拿出，小心吸取上层透明液体500μL至另一离心管中，扣紧离心管管盖后，旋涡震荡5s，4℃冰箱放置15min，于4℃12000rpm离心10min，小心吸弃上清液；在离心管中加入1mL预冷后的75％乙醇，扣紧离心管管盖后，上下颠倒离心管以洗涤沉淀；4℃12000rpm离心5min后，吸弃上清液，并将离心管再至离心机，4℃12000rpm离心3min并吸弃上清；干燥3min，加8μL无酶水，扣紧离心管管盖后，旋涡震荡数秒，4℃3000rpm离心30s；吸取1μL RNA溶液，使用美国热电-赛默飞公司NanoDrop One超微量紫外分光光度计检测样品的总RNA浓度和纯度，确保获得的RNA溶液A260/A280数值在1.8-2.1之间，取6μL总RNA进行逆转录。
(3)cDNA的合成：按照北京宝盈同汇生物技术有限公司生产的Polestar1stcDNASynthesis Kit(gDNA removal)的说明书进行操作，按以下组分配制反逆转录反应液：
①逆转录反应体系(20μL)：
Figure BDA0003599937650000072
②cDNA合成反应程序为：37℃30min，85℃5min以失活MLV。获得的cDNA可于-20℃冻存，或是直接进行荧光定量PCR。
③质粒标准品的制作：
tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B、tRF-33-P4R8YP9LON4VDPcDNA扩增产物的重组质粒tRF-18-79MP9P04pUC57、tRF-30-87R8WP9N1EWJpUC57、tRF-21-V2989UV3B pUC57、tRF-33-P4R8YP9LON4VDP pUC57各2.4μg，由通用生物(安徽)股份有限公司制备。
④以紫外分光光度计测量重组质粒：
tRF-18-79MP9P04pUC57、tRF-30-87R8WP9N1EWJ pUC57、tRF-21-V2989UV3BpUC57、tRF-33-P4R8YP9LON4VDP pUC57的OD260、OD280及OD260/OD280值，并重复3次，确定每个质粒DNA的浓度和纯度。
按拷贝数＝质粒浓度×6.02×1023/(660×质粒总长度)，获得质粒的拷贝数，并稀释至1×106拷贝/μL，–20℃保存备用。以1×106拷贝/μL作为质粒原液，进行10-1×质粒原液样本，10-2×质粒原液样本，10-3×质粒原液样本，10-4×质粒原液样本和10-5×质粒原液样本梯度稀释的荧光定量PCR检测。
将已定值的重组质粒稀释至1×105拷贝/μL，再10倍系列稀释，获得1×101拷贝/μL、1×102拷贝/μL、1×103拷贝/μL、1×104拷贝/μL和1×105拷贝/μL稀释液为后续扩增模板。
⑤荧光定量PCR：每个cDNA样品设置3个重复，加样至96孔板的PCR反应板中，按照两步法进行扩增。同时进行阴性对照样本(以等体积的ddH2O代替质粒或cDNA)和梯度稀释的重组质粒标准品的荧光定量PCR扩增。反应程序为95℃预变性30sec；95℃变性10sec，60℃延伸/退火20sec，共40个循环。通过实时定量PCR扩增，荧光定量PCR测定系统根据荧光值的变化规律自动生成重组质粒：
tRF-18-79MP9P04pUC57、tRF-30-87R8WP9N1EWJ pUC57、tRF-21-V2989UV3BpUC57、tRF-33-P4R8YP9LON4VDP pUC57的标准曲线。
重组质粒tRF-18-79MP9P04pUC57曲线的相关系数R2＝0.9993，tRF-30-87R8WP9N1EWJ pUC57曲线的相关系数R2＝0.9994；
tRF-21-V2989UV3B pUC57曲线的相关系数R2＝0.9998；
tRF-33-P4R8YP9LON4VDP pUC57曲线的相关系数R2＝0.9896；
说明在线性质粒稀释质量浓度范围的内具有良好的线性关系：
tRF-18-79MP9P04 pUC57回归方程为y＝-3.590x+43.91；
tRF-30-87R8WP9N1EWJ pUC57回归方程为y＝-3.297x+42.04；
tRF-21-V2989UV3B pUC57回归方程为y＝-3.054x+39.83；
tRF-33-P4R8YP9LON4VDP pUC57回归方程为y＝-3.578x+44.07；
中y为实时定量PCR检测获得的Cq值，10x为检测样本内对应的拷贝数。各曲线的扩增效率为100％，显示各重组质粒建立的标准曲线能准确地反映目的产物的扩增情况。
获得每个样品的Cq值，也就是y值，并按所检测tRF对应的标准曲线计算出相应的拷贝数x后，将按照400×10x/3计算每个样品对应1mL血浆时的拷贝数，并进行早期胃癌患者1mL血浆内tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B、tRF-33-P4R8YP9LON4VDP拷贝数的统计学分析。
⑥结果显示：
tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B、tRF-33-P4R8YP9LON4VDP
在胃早癌血浆中联合诊断价值为：其ROC曲线下面积为0.985，灵敏度为0.925，特异度为0.975，(如图2所示)能有效地可用于胃早癌的筛查和诊断。
实施例3
单独使用tRF-18-79MP9P04作为分子标记物用于胃早癌的筛查和诊断的结果为：
胃早癌患者每毫升血浆中tRF-18-79MP9P04的拷贝数极显著低于健康人群(P<0.001)，具体结果参考图3，截断值为8711997；其在早癌血浆中联合诊断价值为：其ROC曲线下面积为0.851，灵敏度为0.675，特异度为1.000，具体参考图3-1；而图4为本发明实施例3中胃癌组织tRF-18-79MP9P04的扩增曲线图，图5为本发明实施例3中胃癌组织tRF-18-79MP9P04质粒标准品的荧光定量标准曲线图。
实施例4
单独使用tRF-30-87R8WP9N1EWJ作为分子标记物用于胃早癌的筛查和诊断的结果为：胃早癌患者每毫升血浆中的拷贝数极显著高于健康人群(P<0.05)，具体结果参考图6，截断值为840884；其在早癌血浆中联合诊断价值为：其ROC曲线下面积为0.716，灵敏度为0.550，特异度为0.950，具体参考图6-1；而图7为本发明实施例4中胃癌组织tRF-30-87R8WP9N1EWJ的扩增曲线图，图8为本发明实施例4中胃癌组织tRF-30-87R8WP9N1EWJ质粒标准品的荧光定量标准曲线图。
实施例5
单独使用tRF-33-P4R8YP9LON4VDP作为分子标记物用于胃早癌的筛查和诊断的结果为：胃早癌患者每毫升血浆中tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的拷贝数高于健康人群(P<0.05)，具体结果参考图9，截断值为1113632；其在早癌血浆中联合诊断价值为：其ROC曲线下面积为0.740，灵敏度为0.875，特异度为0.500，具体参考图9-1；而图10为本发明实施例5中胃癌组织tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的扩增曲线图，图11为本发明实施例5中胃癌组织tRF-33-P4R8YP9LON4VDP质粒标准品的荧光定量标准曲线图。
实施例6
单独使用tRF-21-V2989UV3B作为分子标记物用于胃早癌的筛查和诊断的结果为：胃早癌患者每毫升血浆中tRF-21-V2989UV3B的拷贝数极显著低于健康人群(P<0.001)，具体结果参考图12，截断值为40823；其在早癌血浆中联合诊断价值为：其ROC曲线下面积为0.631，灵敏度为0.775，特异度为0.475，具体参考图12-1；而图13为本发明实施例6中胃癌组织tRF-21-V2989UV3B的扩增曲线图，图14为本发明实施例6中胃癌组织tRF-21-V2989UV3B质粒标准品的荧光定量标准曲线图。
序列表
<110> 宁波大学
<120> 检测血浆中tRF型胃癌分子标记物以及在制备胃癌辅助诊断试剂盒的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1

Claims (4)

1.一种用于胃癌辅助诊断的检测试剂盒，其特征在于：包括用于检测血浆样本中tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B、tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的其中一个或是四个联合的试剂，其中：
tRF-18-79MP9P04的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述tRF-18-79MP9P04在胃早癌患者血浆中显著下调；所述引物为：F1：5'-GTCCCTGTTGTGTTTCCGTAG 3'；R1：5'-GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT-3'；
tRF-30-87R8WP9N1EWJ的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述tRF-30-87R8WP9N1EWJ在胃早癌患者血浆中显著上调；F2：5'-GTGTCCCTGGTGGTCTAGTGGTT-3'；R2：5'-GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT-3'；
tRF-21-V2989UV3B的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述tRF-21-V2989UV3B在胃早癌患者血浆中显著上调；F3：5'-CGTTGGTAGGATGGGGTGTGA-3'；R3：5'-GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT-3'；
tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述RF-33-P4R8YP9LON4VDP在胃早癌患者血浆中显著下调；F4：5'-GCATGGGTGGTTCAGTGGTAGA-3'；R4：5'-GGTACCTCCTCTCTTCTCTACT-3'。
2.根据权利要求1所述的用于胃癌辅助诊断的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括有tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B以及tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的逆转录引物序列，其中，
tRF-18-79MP9P04的逆转录序列如SEQ ID No.5所示：5'-GCAGACGAGGGTACCTCCTCTCTTCTCTACTCGTGTCCTACCCTCGTCTGCCCACTA-3'；
tRF-30-87R8WP9N1EWJ的逆转录序列如SEQ ID No.6所示：5'-GCAGACGAGGGTACCTCCTCTCTTCTCTACTCGTGTCCTACCCTCGTCTGCGCCGAA-3'；
tRF-21-V2989UV3B的逆转录序列如SEQ ID No.7所示：5'-GCAGACGAGGGTACCTCCTCTCTTCTCTACTCGTGTCCTACCCTCGTCTGCTACCTA-3'；
tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的逆转录序列如SEQ ID No.8所示：5'-ACAGACGAGGGTACCTCCTCTCTTCTCTACTCGTGTCCTACCCTCGTCTGTCAGGCG-3'。
3.根据权利要求1或2所述的用于胃癌辅助诊断的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括有tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B以及tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的探针引物序列，其中，
tRF-18-79MP9P04的探针引物序列如SEQ ID No.9所示：5'-FAM-TGTCCTACCCTCGTCTGCCCACTA-TAMRA-3'；
tRF-30-87R8WP9N1EWJ的探针引物序列如SEQ ID No.10所示：5'-FAM-GGATTCGGCGCAGACGAGGGTAGGA-TAMRA-3'；
tRF-21-V2989UV3B的探针引物序列如SEQ ID No.11所示：5'-FAM-AGGTAGCAGACGAGGGTAGGACAC-TAMRA-3'；
tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的探针引物序列如SEQ ID No.12所示：5'-FAM-TTCTCGCCTGACAGACGAGGGTAGGA-TAMRA-3'。
4.一种检测血浆中tRF分子标记物的方法，其特征在于，所述tRF分子标记物为权利要求1中所述的tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B以及tRF-33-P4R8YP9LON4VDP，所述的方法包括如下步骤：
(1)采集血液，提取血浆中的总RNA；
(2)将总RNA逆转录成cDNA；
(3)利用tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B以及tRF-33-P4R8YP9LON4VDP的特异性扩增引物对步骤(2)的cDNA溶液进行荧光定量PCR检测，反应结束后检测荧光信号值并设定Y值；
(4)获得每个样品的Cq值，也就是y值，并按所检测tRF对应的标准曲线计算出相应的拷贝数x后，将按照400×10x/3计算每个样品对应1mL血浆时的拷贝数，并进行早期胃癌患者1mL血浆内tRF-18-79MP9P04、tRF-30-87R8WP9N1EWJ、tRF-21-V2989UV3B、tRF-33-P4R8YP9LON4VDP拷贝数的统计学分析。
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CN117265117A (zh) * 2023-10-27 2023-12-22 浙江大学 一种新型tRF分子标记物CAT1及其在制备用于癌症诊断和预后试剂盒中的应用

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CN117265117B (zh) * 2023-10-27 2024-08-13 浙江大学 一种tRF分子标记物CAT1及其在制备用于癌症诊断和预后试剂盒中的应用

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