CN114150072A - 用于脑胶质瘤诊断的生物标志物及其检测引物组和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于生物医学技术领域，提供了一种用于脑胶质瘤诊断的生物标志物及其检测引物组和试剂盒，本发明将脑胶质瘤与正常组织表达差异明显的7种hsa‑miR‑376c，hsa‑miR‑378，hsa‑miR‑3177，hsa‑miR‑126，hsa‑miR‑4286，hsa‑miR‑1305和hsa‑miR‑4298作为生物标志物，并进行血清学表达分析，结果表明这7种miRNA在血清中稳定表达，血清的表达与组织芯片具有很好的一致性；因此，这七种miRNA可以作为脑胶质瘤诊断的生物标志物，且联合诊断的灵敏度与特异性显著高于单一诊断的灵敏度和特异性。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种用于脑胶质瘤诊断的生物标志物及其检测引物组和试剂盒。
背景技术
脑胶质瘤是成年人脑部肿瘤中最致命的一类恶性肿瘤，发生于神经细胞和胶质细胞（如：星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经胶质细胞和室管膜细胞，约占颅内原发肿瘤的78%。近年来，胶质瘤的临床治疗主要依靠手术的切除，并结合放疗和化疗的联合疗法治疗，但由于脑胶质瘤具有血管富集性，高度侵袭性特点，手术难以彻底清除侵入周围脑组织的肿瘤细胞，这些残留肿瘤细胞对后续放疗、化疗等措施的显著抵抗性，容易导致复发，中位存活率仅11-15个月，所以疗效仍旧很不理想。miRNA的出现为脑胶质肿瘤的发生机制研究提供了全新的思路，miRNA芯片技术以高通量，操作简便的特点己越来越多地应用于肿瘤研究中。已有研究发现特异性的miRNAs表达谱可用于肿瘤的基因诊断和分型。差异表达miRNAs参与了肿瘤的发生、发展、转移等分子机制，并且用于肿瘤的预后评估。
脑瘤的诊断主要依靠侵入性检查，该检查费用较高且病人依从性差，不适于脑瘤的早期诊断，因此探寻简单有效且具有较高诊断价值的方法迫切重要。因此，临床上急需新的无创性的有效的脑瘤诊断标志物。miRNA 因其片段较小，耐RNA酶降解，酸碱环境，长期保存不易降解，稳定存在于各种组织，甚至在石蜡样本和血清样本中稳定存在，血清循环miRNA由于其检测的无创性，只需抽取患者静脉血，操作简便，而被视为是一类理想的肿瘤的分子标志物。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种用于脑胶质瘤诊断的生物标志物，旨在解决背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的，用于脑胶质瘤诊断的生物标志物，其包括hsa-miR-376c，hsa-miR-378，hsa-miR-3177，hsa-miR-126，hsa-miR-4286，hsa-miR-1305和hsa-miR-4298。
作为一种优选的方案：
hsa-miR-376c的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1所示；
hsa-miR-378的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2所示；
hsa-miR-3177的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3所示；
hsa-miR-126的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4所示；
hsa-miR-4286的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5所示；
hsa-miR-1305的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6所示；
hsa-miR-4298的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7所示。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述用于脑胶质瘤诊断的生物标志物的检测引物组，其包括：
hsa-miR-376c的反转录引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8所示；
hsa-miR-378的反转录引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9所示；
hsa-miR-3177的反转录引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10所示；
hsa-miR-126的反转录引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11所示；
hsa-miR-4286的反转录引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.12所示；
hsa-miR-1305的反转录引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13所示；
hsa-miR-4298的反转录引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14所示。
作为一种优选的方案，所述检测引物组还包括：
hsa-miR-376c的PCR前引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.15所示；
hsa-miR-378的PCR前引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.16所示；
hsa-miR-3177的PCR前引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.17所示；
hsa-miR-126的PCR前引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.18所示；
hsa-miR-4286的PCR前引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.19所示；
hsa-miR-1305的PCR前引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.20所示；
hsa-miR-4298的PCR前引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.21所示；
通用PCR后引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.22所示。
作为一种优选的方案，所述检测引物组还包括：
U6的反转录引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.23所示。
作为一种优选的方案，所述检测引物组还包括：
U6的PCR前引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.24所示。
本发明实施例的另一目的在于提供一种用于脑胶质瘤诊断的试剂盒，其包含如上述的检测引物组。
本发明为了了解在脑胶质瘤组织及正常组织中miRNAs的差异表达情况，寻找特异的脑胶质瘤差异表达谱，了解其发生机制，本发明采用芯片技术检测脑胶质瘤差异表达，芯片结果分析发现有7个miRNAs在脑胶质瘤与正常组织中差异表达，其中5个miRNAs在脑胶质瘤中表达上调，表达水平下调的有2条miRNAs。在脑瘤组织中的表达与正常组织相比趋势是一致的。据文献检索这7个miR-376c，miR-378，miR-3177，miR-126，miR-4286，miR-1305，miR-4298在脑胶质瘤中是首次被发现，具有作为无创脑胶质瘤筛查的巨大潜在价值。
本发明人以标准操作程序采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等这些资料可用于判断疾病进展，并控制疾病分期、患者性别、年龄等因素对于发病的影响，并进行诊断试剂盒的研制开发。具体如下：
（1）提前准备好采血人员名单、性别、年龄，开好检查申请单，并编上编号。
（2）严格遵守操作规程抽血时带上手套，工作人员对每位操作前用迅干消毒液消毒手，做到一人一针一带一纸，使用的是一次性双向采血针，就是每抽1位查体者给予更换1条止血带，更换针头，每位查体者手臂下垫上1张消毒的卫生纸，用后给予废弃，止血带用后用500 mg/L氯消净浸泡消毒。
（3）血标本采集后血液标本的保存与运送，采集后的血标本用真空试管的泡沫垫付插稳后经静置约10 min放入4~8℃低温冰箱冷藏运送，采集好的血标本应立即放入冰箱保存，以防溶血。所有纳入人群均取清晨空腹静脉血3 mL，并立即用水平离心机离心，离心半径6 cm，以2 000 r/min 离心8 min 分离血清，吸出的上清置于离心管中，于4 ℃条件下离心半径3 cm 14 000 r/min离心10 min，吸出的上清液置新的离心管中，放到 -80 ℃冰箱低温保存以便用于总RNA 的提取。
血清差异表达分析选择脑瘤以及与病例性别、年龄匹配的健康对照，检测其血清表达含量，分析脑瘤和健康对照间血清血浆的共性和特性，对已筛选的血清差异表达基因miR-376c，miR-378，miR-3177，miR-126，miR-4286，miR-1305，miR-4298在大样本人群中进行定量分析，确定与脑瘤发病相关。血清筛查和诊断试剂盒的研制根据脑瘤和非肿瘤对照的特异血清血浆开发用于脑瘤辅助诊断试剂盒。这七种hsa-miRNA为我们首次在脑胶质瘤中发现差异表达，且可以作为检测脑胶质瘤的试剂盒进行开发。
本发明实施例提供的一种用于脑胶质瘤诊断的生物标志物，由hsa-miR-376c，hsa-miR-378，hsa-miR-3177，hsa-miR-126，hsa-miR-4286，hsa-miR-1305和hsa-miR-4298构成。具体的，本发明将脑胶质瘤与正常组织表达差异明显（差异表达量大于2倍，RT-PCR中CT值小于30）的7种hsa-miR-376c，hsa-miR-378，hsa-miR-3177，hsa-miR-126，hsa-miR-4286，hsa-miR-1305和hsa-miR-4298进行血清学表达分析，结果表明这7种miRNA在血清中稳定表达，血清的表达与组织芯片具有很好的一致性；因此，这七种miRNA可以作为脑胶质瘤诊断的生物标志物，且联合诊断的灵敏度与特异性显著高于单一诊断的灵敏度和特异性。
附图说明
图1为本发明实施例中所使用微流体芯片技术检测脑胶质瘤差异表达示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
该实施例提供了一种用于脑胶质瘤诊断的生物标志物，其包括hsa-miR-376c，hsa-miR-378，hsa-miR-3177，hsa-miR-126，hsa-miR-4286，hsa-miR-1305和hsa-miR-4298。其中，hsa-miR-376c的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1所示；hsa-miR-378的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2所示；hsa-miR-3177的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3所示；hsa-miR-126的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4所示；hsa-miR-4286的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5所示；hsa-miR-1305的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6所示；hsa-miR-4298的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7所示。
另外，该实施例还提供一种上述用于脑胶质瘤诊断的生物标志物的检测引物组，其包括：hsa-miR-376c的反转录引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8所示；hsa-miR-378的反转录引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9所示；hsa-miR-3177的反转录引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10所示；hsa-miR-126的反转录引物，其核苷酸序列分别如SEQID NO.11所示；hsa-miR-4286的反转录引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.12所示；hsa-miR-1305的反转录引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13所示；hsa-miR-4298的反转录引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14所示；hsa-miR-376c的PCR前引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.15所示；hsa-miR-378的PCR前引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.16所示；hsa-miR-3177的PCR前引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.17所示；hsa-miR-126的PCR前引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.18所示；hsa-miR-4286的PCR前引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.19所示；hsa-miR-1305的PCR前引物，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO.20所示；hsa-miR-4298的PCR前引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.21所示；通用PCR后引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.22所示；U6的反转录引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.23所示；U6的PCR前引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.24所示。其中，通用引物，含义为克隆位点两旁的序列匹配，目的是引扩出DNA片段，主要用来测序。U6的引物，是人体内部表达的类试管家基因，表达比较稳定，常用来做一个内部参考比对。
具体的，上述各序列如表1所示：
表1
实施例2
该实施例以标准操作程序采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等这些资料可用于判断疾病进展，并控制疾病分期、患者性别、年龄等因素对于发病的影响，并进行诊断试剂盒的研制开发。具体如下：
（1）提前准备好采血人员名单、性别、年龄，开好检查申请单，并编上编号。
（2）严格遵守操作规程抽血时带上手套，工作人员对每位操作前用迅干消毒液消毒手，做到一人一针一带一纸，使用的是一次性双向采血针，就是每抽1位查体者给予更换1条止血带，更换针头，每位查体者手臂下垫上1张消毒的卫生纸，用后给予废弃，止血带用后用500 mg/L氯消净浸泡消毒。
（3）血标本采集后血液标本的保存与运送，采集后的血标本用真空试管的泡沫垫付插稳后经静置约10 min放入4~8℃低温冰箱冷藏运送，采集好的血标本应立即放入冰箱保存，以防溶血。所有纳入人群均取清晨空腹静脉血3 mL，并立即用水平离心机离心，离心半径6 cm，以2 000 r/min 离心8 min 分离血清，吸出的上清置于离心管中，于4 ℃条件下离心半径3 cm 14 000 r/min离心10 min，吸出的上清液置新的离心管中，放到 -80 ℃冰箱低温保存以便用于总RNA 的提取。
RNA 提取及定量逆转录聚合酶链反应：总RNA提取采用miRcute Serum/PlasmamiRNA isolation kit (北京天根公司)，反转录及cDNA扩增采用miRcute Plus miRNAFirst-Strand cDNA Synthesis kit 和miRcute Plus miRNA qPCR Detection kit(北京天根公司)，上表1中的各个引物、miRNA 标准品均由北京天根生物公司合成，采用 ABI7500 实时荧光定量 PCR 仪进行检测。
血清样本的处理：所有纳入人群均取清晨空腹静脉血3 mL，并立即用水平离心机以2 000 rpm 离心8min 分离血清，吸出的上清置于离心管中，于4 ℃条件下14 000x rpm离心10 min，吸出的上清液置新的离心管中，放到 -80 ℃冰箱低温保存以便用于总RNA的提取。总RNA 的提取：按miRcuteSerum/Plasma miRNA isolation kit说明书进行操作，提取得到的总RNA放于-80 ℃冰箱保存备用。反转录：解冻2×miRNA RT（上表1中的各个反转录引物） Reaction Buffer并混匀， miRNA RT Enzyme Mix放于冰中备用， 在冰上预冷的反应管内加入2×miRNA RT Reaction Buffer 10μL、miRNA RT Enzyme Mix 2μL，总RNA 5μL，RNase-Free ddH2O 3μL至总体积20μl后进行反应，得到的cDNA进行荧光定量检测，所有实验操作均在冰上进行。miRNA的实时荧光定量PCR 反应：按照miRcute Plus miRNA qPCRDetection kit说明书进行操作，每次实验设置3个副孔，使用ABI 7500 实时荧光定量 PCR仪进行检测。所得实验结果采用相对定量法进行分析，miRNA表达量以2-△Ct表示。ΔCt=(Ct实验组-Ct内参)。
临床实验资料与方法验证：
临床资料：收集从2014年到2017年在内蒙古自治区肿瘤医院就诊经手术病理确诊为脑胶质瘤患者的血清样本80例，其中平均年龄为（62.12±12.06）岁，年龄范围（24-82）岁，男性47例，女性为33例；35名体检健康对照者血清样本，平均年龄为（61.34±14.88）岁，年龄范围（28-76）岁，男性19例，女性为16例，共计150例样本。各组一般资料差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。此项基础研究获得内蒙古医科大学附属人民医院伦理委员会的批准，受试实验成员在了解知情同意书的内容后签字同意。纳入脑胶质瘤患者均经病理明确诊断，且未经任何抗肿瘤治疗。
RNA 提取及定量逆转录聚合酶链反应：
检测的芯片实验及分析方法：随机选取6个样品进行初步的全基因组微阵列筛选。
实验材料准备：
研磨、匀浆过程中使用的器具（研钵、匀浆器、镊子、铝箔等）放入八四消毒液中浸泡消毒一天后，再用洗涤灵洗刷干净晾干后泡酸过夜，洗刷晾干后包上铝箔高压灭菌后，180℃烘烤4小时以备用。
随机选取6个样品进行初步的全基因组微阵列筛选。在Paraflo微阵列芯片检测平台进行筛选，Paraflo微阵列芯片由美国（LC Sciences，休斯敦，TX）提供。用YM-100型微孔离心过滤器(GE Millipore，Billerica，MA)对起始量5mg的总RNA进行大小分级，用聚(A)聚合酶将小RNA(300nt)的3′端用聚(A)尾部延伸。将寡核苷酸标记物连接到每个聚（A）尾部进行荧光染色。RNA样品用两种不同的标签进行双样品实验。
用具有微循环泵的mParaflo微流控芯片上进行过夜杂交。微流控芯片上的每个检测探针由与其目标互补的化学修饰的核苷酸编码区段组成(探针序列来自MiRBase;http://microrna.sanger.ac.uk//)，对照MIRNA 8.1版本中的1145条人类miRNA[hsa-miRNA]条目。检测探针包含聚乙烯甘露醇的间隔区段，以将编码区段从本底延伸开。利用发光试剂原位化学合成法合成检测探针。通过检测探针的化学修饰，平衡杂交熔化温度。在含25%甲酰胺的66SSPE缓冲液（0.90M NaCl，60mM Na2HPO4，6mM EDTA，pH 6.8）中，在34℃下进行100mL溶液中杂交。用激光扫描仪（GenePix 4000B）采集杂交图像，用Array-Pro图像分析软件（MediaContrbernetics）数字化分析。通过先减去背景，然后使用局部加权回归滤波器对信号进行归一化来分析数据。对于双色实验，计算两组检测信号（log2变换，均衡）的比例，并通过t检验确定差异的显著性。P值小于0.05的信号差异显著。利用平均连锁度和欧氏距离度量，采用层次分析法进行多阵列归一化和聚类分析。使用来自基因组研究所的多实验分析软件（v4.0，2006）对总信号密度超过1000的差异miRNA生成聚类图。其中。图1 是本发明实施例中所使用微流体芯片技术检测脑胶质瘤差异表达示意图。从图可以看从出，上述7种miRNA在血清中稳定表达，血清的表达与组织芯片具有很好的一致性；因此，这七种miRNA可以作为脑胶质瘤诊断的生物标志物，且联合诊断的灵敏度与特异性显著高于单一诊断的灵敏度和特异性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 内蒙古医科大学附属人民医院（内蒙古自治区肿瘤医院）
<120> 用于脑胶质瘤诊断的生物标志物及其检测引物组和试剂盒
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 21
<212> RNA
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序列表
<110> 内蒙古医科大学附属人民医院（内蒙古自治区肿瘤医院）
<120> 用于脑胶质瘤诊断的生物标志物及其检测引物组和试剂盒
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<400> 24
acactccagc tgggtagcag cacgtaaata 30
Claims (7)
1.用于脑胶质瘤诊断的生物标志物，其特征在于，包括hsa-miR-376c，hsa-miR-378，hsa-miR-3177，hsa-miR-126，hsa-miR-4286，hsa-miR-1305和hsa-miR-4298。
2.根据权利要求1所述的用于脑胶质瘤诊断的生物标志物，其特征在于：
hsa-miR-376c的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1所示；
hsa-miR-378的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2所示；
hsa-miR-3177的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3所示；
hsa-miR-126的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4所示；
hsa-miR-4286的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5所示；
hsa-miR-1305的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6所示；
hsa-miR-4298的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7所示。
3.如权利要求1或2所述的用于脑胶质瘤诊断的生物标志物的检测引物组，其特征在于，包括：
hsa-miR-376c的反转录引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8所示；
hsa-miR-378的反转录引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9所示；
hsa-miR-3177的反转录引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10所示；
hsa-miR-126的反转录引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11所示；
hsa-miR-4286的反转录引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.12所示；
hsa-miR-1305的反转录引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13所示；
hsa-miR-4298的反转录引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14所示。
4.根据权利要求3所述的用于脑胶质瘤诊断的生物标志物的检测引物组，其特征在于，还包括：
hsa-miR-376c的PCR前引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.15所示；
hsa-miR-378的PCR前引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.16所示；
hsa-miR-3177的PCR前引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.17所示；
hsa-miR-126的PCR前引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.18所示；
hsa-miR-4286的PCR前引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.19所示；
hsa-miR-1305的PCR前引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.20所示；
hsa-miR-4298的PCR前引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.21所示；
通用PCR后引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.22所示。
5.根据权利要求3所述的用于脑胶质瘤诊断的生物标志物的检测引物组，其特征在于，还包括：
U6的反转录引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.23所示。
6.根据权利要求4所述的用于脑胶质瘤诊断的生物标志物的检测引物组，其特征在于，还包括：
U6的PCR前引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.24所示。
7.用于脑胶质瘤诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求3~6中任一项所述的检测引物组。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN111321222A (zh) * | 2018-12-17 | 2020-06-23 | 内蒙古医科大学附属人民医院 | 用于结直肠癌无创诊断的血清piRNA标志物及检测试剂盒 |
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2021
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