CN111321222B - 用于结直肠癌无创诊断的血清piRNA标志物及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于结直肠癌无创诊断的piRNA标志物及检测试剂盒。所述piRNA标志物包括hsa_piR_000651和hsa_piR_000291。这两种piRNA在结直肠癌患者血清中的表达量显著高于健康人血清中的表达量，用于诊断结直肠癌时，具有很高的灵敏度和特异性。本发明所提供的试剂盒可以快速准确的区分结直肠癌患者血清样本和健康人血清样本。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及用于人结直肠癌诊断的piRNA生物标志物及基于该标志物构建的检测试剂盒。
背景技术
结直肠癌是严重威胁人类健康和生命的一种疾病。2012年全球男性结直肠癌新发病例为746000例，占所有恶性肿瘤的10％；女性结直肠癌新发病例为614000例，占所有恶性肿瘤的9.2％。在我国，结直肠癌的发病率和死亡率逐年上升，每年新增病例超20万人，死亡病例超10万人。
结直肠癌往往起病隐匿，早期不易被发现，绝大多数患者在出现便血、腹痛等症状三个月到半年后才到医院就诊。此时癌细胞已向周围浸润扩散甚至向远处转移，失去了最佳的手术治疗时机。此外，若发生肠阻塞或肠穿孔，患者的5年生存率会进一步降低。如果能够对结直肠癌患者进行早发现、早诊断和早治疗，他们的预后和生存质量都会大大提高。例如：以国际抗癌联盟(UICC)和美国肿瘤联合会(AJCC)联合制定的最新TNM分期系统为标准，进行统计发现：I、IIa、IIb、IIIa、IIIb、IIIc和IV期结直肠癌患者的5年生存率分别为95.3％、85.7％、82.4％、72.3％、64.8％、43.3％和8.2％。可见结直肠癌患者的早期诊断是十分重要的。
目前，对结直肠癌患者进行普查的主要途径是粪便隐血试验结合肠镜检查。然而，粪便隐血试验缺乏特异性，肠镜检查给患者带来较大痛苦，受检率仅30％左右。血液肿瘤标志物检查具有简便、无创、经济的优点，是对无症状人群进行筛查的理想手段。但目前临床上常用的血液肿瘤标志物，包括CEA、CA-199等，对结直肠癌诊断的灵敏度和特异性均较低，难以用于大规模普查。因此，寻找新的结直肠癌血液肿瘤标志物具有重要的临床意义。
piRNA是新发现的一类单链非编码小RNA，长度24-33nt，至今在人类已鉴定出近3万个成员，不同成员表达于不同组织中，形成该组织特异的“piRNA签名”，它们在抑制转座因子活动、维持基因组印记、调节基因组DNA甲基化模式和组蛋白修饰模式中发挥重要作用，是保持细胞内部稳态的关键因子。piRNA调控的异常可引起转座因子激活、基因组印记丢失、DNA甲基化和组蛋白修饰模式紊乱，进而诱发一系列癌基因、抑癌基因的表达失调和序列改变，导致肿瘤的发生和发展。目前已在胃癌、结肠癌、乳腺癌等一些肿瘤组织中发现piRNA的表达发生了显著的异常改变。特别值得注意的是，在肿瘤发生的早期阶段，肿瘤组织中一些piRNA的表达较之正常组织就有了明显的异常改变。由于肿瘤组织的坏死和肿瘤细胞的主动分泌，肿瘤组织中piRNA表达的异常也可以反映到患者血液当中，指示着肿瘤的发生和发展。
最近的研究证明，人外周血当中存在的piRNA比较稳定，经过体外长期保存和反复冻融基本不发生降解。这一特点使得piRNA很适合作为一种血液标志物分子。寻找到结直肠癌患者血液中表达异常的piRNA，建立起稳定高效的检测方法，就可以为结直肠癌患者的无创快速诊断提供新的有效手段，为结直肠癌的大规模普查、为结直肠癌患者的早诊早治提供便捷有力的武器。
发明内容
本发明的第一个内容是提供一种用于结直肠癌无创诊断的血液分子标志物。
本发明所述的标志物由两种piRNA分子组成：hsa_piR_000651和hsa_piR_000291。所述hsa_piR_000651的核苷酸序列见序列表中SEQ ID NO.1，所述hsa_piR_000291的核苷酸序列见序列表中SEQ ID NO.2。所述piRNA生物标志物在结直肠癌患者血清中的表达显著高于健康人血清中的表达。
本发明的第二个方面是提供一种用于诊断结直肠癌的试剂盒。
所述试剂盒包含上述两种piRNA标志物、对两种piRNA标志物进行荧光定量PCR检测的特异性引物以及DNA聚合酶和反转录酶等辅助试剂。
本发明的优越性在于：
(1)本发明首次发现了血清中的hsa_piR_000651和hsa_piR_000291分子可作为结直肠癌的诊断标志物，确定了新型的结直肠癌无创诊断指标。
(2)hsa_piR_000651和hsa_piR_000291组合作为诊断标志物，具有灵敏度高、特异性强的优点，优于CEA等传统的结直肠癌血清标志物。
(3)一些血液中的microRNA分子也被报道可用于结直肠癌的无创诊断，但它们一般需要四种或五种分子组合使用，才有诊断参考价值，临床应用起来较为繁琐，检测成本较高。本发明提供的标志物，只需要检测两种piRNA分子，临床应用具有简便、快捷、经济的优势。
(4)本发明提供了可用于结直肠癌诊断的试剂盒，使用该试剂盒可以快速、低成本、高灵敏地获得血液样本的检测结果，并且不会对患者造成创伤。其在临床上的应用，将对结直肠癌做到早发现、早诊断、早治疗，可极大提高结直肠癌患者的治愈率。
附图说明
图1和图2分别显示hsa_piR_000651和hsa_piR_000291单独用于区分结直肠癌患者血清和健康人血清的ROC曲线；
图3显示hsa_piR_000651和hsa_piR_000291联合用于区分结直肠癌患者血清和健康人血清的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：结直肠癌患者血清中表达异常的piRNA的初步筛选
1血清样本的收集
选择内蒙古医科大学附属医院2015年9月至2017年9月间诊断明确的结直肠癌患者106例为患者组，选择经体检确认为健康的86人为对照组。所有结直肠癌患者均为初次确诊患者，取血之前未进行手术、放疗及化疗。对照组个体未患有恶性肿瘤及其它疾病，同时年龄、性别与患者组相匹配。
清晨空腹状态下，抽取外周血5ml至促凝采血管中，静置30min，于4℃、3900rmp/min离心10min，吸取上部淡黄色的血清至1.5ml无酶无菌的离心管中，于4℃、12000rmp/min离心10min,吸取上清至新的1.5ml无酶无菌离心管中。-80℃冰箱保存。
2高通量测序
取6名患者和6名年龄、性别匹配的健康人的血清样本，提取总RNA，进行浓度、纯度和完整性检测，合格后送深圳华大基因进行测序。使用的测序方法为BGISEQ-500深度测序，该测序方法可以在短时间内获得大量的小RNA信息。将测得的序列与已知piRNA数据库进行比对，获得结直肠癌患者和健康人血清中的piRNA表达谱，将两者进行比较，得到一系列表达有显著差异的piRNA分子，其中包括hsa_piR_000651和hsa_piR_000291。
实施例2：差异表达的血清piRNA的验证及其作为结直肠癌诊断标志物价值的评估
1RNA提取
取100名结直肠癌患者和80名年龄、性别匹配的健康人的血清样本，用TRIzol法提取血清总RNA：每200μL血清，加入1mL TRIzol，震荡混匀，室温放置5min；加入0.2mL氯仿，剧烈震荡15s，静置3min；4℃、10000rmp/min离心10min，把上层水相转移到新的管中；加入等体积异丙醇，混匀，静置20min；4℃、10000rmp/min离心10min，去上清；用1mL75％乙醇洗涤沉淀；4℃、5000r/mim离心5min，弃去液体；室温晾干后，加入20μL无酶水，溶解RNA，取2μLRNA在微量核酸分析仪上测定RNA浓度及A260/280比值。比值在1.7到2.0之间的样本视为达到质量要求，用于反转录实验。
2反转录
以100ng总RNA为模板，按照TransScript miRNA First-Strand cDNASynthesisSuperMix说明书配制20μL反转录反应体系：2×TS miRNA Reaction Mix 10.0μL，RTEnzyme Mix 2.0μL，RNA模板加无酶水8.0μL。配置过程在冰上进行。37℃，60min；95℃,10min,合成cDNA。cDNA于-20℃保存备用。
3荧光定量PCR检测piRNA表达量
使用天根FP411-02扩增试剂建立20μL荧光定量PCR扩增反应体系：2×miRcutePlusmiRNA PreMix(SYBR&ROX)10μL，PCR正向引物0.4μL，PCR反向通用引物0.4μL，上述cDNA2.0μL，无酶水7.2μL。
反应条件为：95℃15min，(94℃20s，60℃34s)×40个循环，采用ABI7500荧光定量PCR仪进行荧光定量检测，反应结束由计算机自动计算各反应管内的Ct值。
4piRNA表达水平的计算
以U6作为内参，采用△△Ct法分析计算piRNA的相对表达量：ΔCt患者＝Ct患者piRNA-Ct患者内参，ΔCt健康＝Ct健康piRNA-Ct健康内参，ΔΔCt＝ΔCt患者-ΔCt健康。ΔCt值越高表示该piRNA表达水平越低。ΔΔCt值大于0(2-ΔΔCT小于1)，则表示该piRNA在患者血清中为低表达；ΔΔCt值小于0(2-ΔΔCT大于1)，则表示该piRNA在患者血清中为高表达；ΔΔCt值等于0(2-ΔΔCT等于1)，则表示该piRNA在患者血清和健康人血清中表达量相同。
经分析计算，hsa_piR_000651在健康人血清中的平均相对表达量为1.29(0.43，2.20)，在结直肠癌患者血清中的平均相对表达量为9.50(0.55，86.82)；hsa_piR_000291在健康人血清中的平均相对表达量为1.09(0.53,1.83)，在结直肠癌患者血清中的平均相对表达量为15.59(0.04,143.41)。
实施例3：受试者工作特征曲线(ROC)分析
构建ROC曲线来分析两个血清piRNA区分结直肠癌患者和健康人的诊断能力。hsa_piR_000651的曲线下面积为0.866(95％置信区间：0.759-0.974)；在最佳的cutoff值下，其灵敏度和特异性分别为85.2％和64.3％。hsa_piR_000291的曲线下面积为0.876(95％置信区间：0.765-0.987)，在最佳的cutoff值下，其灵敏度和特异性分别为88.9％和71.4％。这两个piRNA联合使用，曲线下面积可以达到0.963(95％置信区间：0.000-1.000)，灵敏度和特异性分别达到96.3％和92.9％。结果表明：hsa_piR_000651和hsa_piR_000291联合起来对结直肠癌检测具有非常高的灵敏度和特异性。该结果显著优于传统肿瘤标志物CEA(参见”Tóth K,Sipos F,Kalmár A,et al.Detection of methylated SEPT9 in plasma isareliable screening method for both left-and right-sided coloncancers.PloSone,2012,7(9):e46000”)，该文献报道，CEA对结直肠癌诊断的敏感性仅有51.8％，特异性约85.2％。
实施例4：人结肠癌诊断用试剂盒
上述实施例表明，血清hsa_piR_000651和hsa_piR_000291联合起来对结直肠癌检测具有非常高的灵敏度和特异性，因此，可基于hsa_piR_000651和hsa_piR_000291制作用于人结直肠癌无创诊断的试剂盒。该试剂盒包括hsa_piR_000651和hsa_piR_000291特异性的扩增引物、DNA聚合酶、反转录酶、缓冲液、无酶水、以及标准品。下面为扩增引物的一种设计。
hsa_piR_000651:5’-AGAGAGGGGCCCGTGCCTTGGAAAGCGTC-3’
hsa_piR_000291:5’-ACAGTAGCATTGGTGGTTCAGTGGTA-3’
引物和探针的设计是本领域常规技术手段，可以设计成其他序列。
序列表
<110> 内蒙古医科大学附属人民医院
<120> 用于结直肠癌无创诊断的血清piRNA标志物及检测试剂盒
<141> 2018-11-25
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> RNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
agagaggggc ccgugccuug gaaagcguc 29
<210> 2
<211> 26
<212> RNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
acaguagcau uggugguuca guggua 26
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 3
agagaggggc ccgtgccttg gaaagcgtc 29
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 4
acagtagcat tggtggttca gtggta 26
Claims (4)
1.一种用于人结直肠癌诊断的piRNA生物标志物，所述piRNA生物标志物由hsa_piR_000651和hsa_piR_000291两种短链RNA分子组成，它们的核苷酸序列分别见序列表中SEQID NO.1和SEQ ID NO.2。
2.一组人结直肠癌诊断用的piRNA特异性扩增引物，由hsa_piR_000651的特异性扩增引物和hsa_piR_000291的特异性扩增引物组成，两者的序列分别见序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
3.权利要求1中所述的piRNA生物标志物和权利要求2中所述的特异性扩增引物在制备人结直肠癌诊断试剂中的用途。
4.一种人结直肠癌诊断试剂盒，该试剂盒包含有权利要求2中所述的piRNA特异性扩增引物。
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