CN116042834B - 一种用于结直肠癌早期诊断的血浆piRNA组合及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于结直肠癌早期诊断的血浆piRNA组合及应用，本发明基于中国人群的血浆piRNA表达谱，得到了用于结直肠癌早期诊断的血浆piRNA组合，并基于血浆piRNA组合建立了结直肠癌早期诊断模型，该模型能够较为准确的预测结直肠癌发病风险，有助于降低检测的成本，同时本发明使用了Lasso Logistic回归模型，使模型纳入的变量数目大幅度降低，便于模型的应用推广。

Description

一种用于结直肠癌早期诊断的血浆piRNA组合及应用
技术领域
本发明涉及生物信息技术领域，特别涉及一种用于结直肠癌早期诊断的血浆piRNA组合及应用。
背景技术
结直肠癌是我国的高发恶性肿瘤，并且近年来我国的结直肠癌发病率正逐渐升高。筛查与早期诊断能够使结直肠癌诊治前移，降低结直肠癌疾病负荷。
传统的结直肠癌筛查与诊断模式为：粪便隐血初筛、初筛阳性者通过肠镜确诊。但是在传统的结直肠癌筛查与与诊断模式中，粪便隐血检测诊断结直肠癌的灵敏度不足，仅约40-73.8％。多靶点粪便DNA检测是基于KRAS基因突变状态、BMP3/NDRG4基因甲基化与粪便隐血联合检测的肠癌筛查试剂盒，其相较于粪便隐血，检测结直肠癌的灵敏度显著提升。但是粪便检测具有患者依从性差等因素，影响结直肠癌筛查项目的参与率。因此，亟需研发新的、更加准确的生物标志物用于结直肠癌的筛查与早期诊断。
血液标志物具有非侵袭性、患者依从性高等特点。目前已有某些研究报道特定的血液标志物在结直肠癌筛查与早期诊断中的价值，例如国外有研究者报道外周血Septin9甲基化可作为结直肠癌早期诊断的标志物，但是在中国人群中外周血Septin9甲基化对于结直肠癌早期诊断的价值接近粪便隐血检测。因此，有必要鉴定符合中国人群遗传特征的结直肠癌外周血早期诊断标志物。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种用于结直肠癌早期诊断的血浆piRNA组合及应用。本发明提供了用于结直肠癌早期诊断的血浆piRNA组合，并依据其结果建立并验证了一种用于结直肠癌早期诊断模型，便于早期筛查。
本发明的技术方案：一种用于结直肠癌早期诊断的血浆piRNA组合，所述血浆piRNA组合中的血浆piRNA包括：piR-hsa-18001-1、piR-hsa-11146、piR-hsa-3100-1、piR-hsa-3100-2、piR-hsa-3100-3、piR-hsa-3100-4、piR-hsa-3100-5、piR-hsa-3100-6、piR-hsa-3110-1、piR-hsa-3110-2、piR-hsa-3110-3、piR-hsa-3110-4、piR-hsa-3110-5、piR-hsa-3110-6、piR-hsa-31395、piR-hsa-14100、piR-hsa-2801、piR-hsa-18001-2、piR-hsa-5435、piR-hsa-6391、piR-hsa-4548、piR-hsa-30005-1、piR-hsa-30005-2、piR-hsa-29730和piR-hsa-26246。
上述的用于结直肠癌早期诊断的血浆piRNA组合在构建结直肠癌早期诊断模型中的应用。
前述的应用，所述结直肠癌早期诊断模型为Lasso Logistic回归模型。
前述的应用，所述Lasso Logistic回归模型的数学表达式如下：结直肠癌发病风险评分＝∑(血浆piRNA表达值×回归系数)。前述的应用，所述回归系数见表1所示：
前述的应用，所述Lasso Logistic回归模型构建方法如下：
(1)收集结直肠癌患者与健康对照的血浆，分别提取血浆游离小RNA；(2)采用小RNA转录组测序获得血浆piRNA表达谱；(3)将结直肠癌患者与健康对照随机分为训练集与测试集，在训练集中建立Lasso Logistic回归模型，获得纳入模型的piRNA回归系数；(4)基于在训练集中建立的Lasso Logistic回归模型，在测试集中采用ROC曲线、灵敏度和特异度指标评估模型的预测准确性。
与现有技术相比，本发明的创新点在于基于中国人群的血浆piRNA表达谱，得到了用于结直肠癌早期诊断的血浆piRNA组合，并基于血浆piRNA组合建立了结直肠癌早期诊断模型，该模型预测结直肠癌的ROC曲线下面积(area Tnder the ROC cTrve,ATC)为0.832，敏感度为0.795，特异度为0.815，能够有效地区分结直肠癌患者与健康对照。此外，本发明使用了Lasso Logistic回归模型，使模型纳入的变量数目大幅度降低，将有助于降低检测的成本及模型的应用推广。
附图说明
图1为本发明结直肠癌早期诊断模型建立流程示意图。
图2为Lasso Logistic回归模型中正则化参数λ与部分似然估计偏差关系图；
图3为模型在训练集的ROC曲线示意图。
图4为模型在测试集的ROC曲线示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
实施例：基于血浆piRNA表达谱的结直肠癌早期诊断模型构建及验证。
本实施例分为4个部分：收集血浆样本、磁珠法提取血浆小RNA、小RNA转录组测序、基于血浆piRNA表达矩阵建立Lasso Logistic回归模型。该实施例的流程如图1所示。
(1)收集血浆样本；
采集219例结直肠癌患者与202例健康对照的5ml全血，置于含有EDTA抗凝剂的采血管内。采集完成后反复颠倒采血管，使EDTA抗凝剂与血液充分混匀。以3000rpm，4℃离心10min，上清液即为血浆。取2ml血浆置于EP管内，-80℃冰箱保存。
(2)磁珠法提取血浆小RNA；
细胞裂解与磁珠结合：从4℃冰箱中取出磁珠放置于室温备用、GHH裂解液60℃加热混匀。取5ml EP管，按顺序加入500TL血浆、1mL GHH裂解液、100TL蛋白酶K、100TL磁珠。震荡混匀15秒后60℃孵育10分钟。孵育结束后，向离心管中加入2.55mL无水乙醇，震荡混匀15秒后置于磁力架上，待磁珠全部吸附贴壁后(约5分钟)，弃上清。向离心管中加入400TL GHH裂解液及600TL无水乙醇，震荡混匀15秒。
磁珠清洗：将上一步中的产物全部转移至1mL EP管中，置于磁力架上。待磁珠全部吸附贴壁后弃上清，向EP管中加入800TL 80％乙醇溶液，震荡混匀后短暂离心，置于磁力架上。待磁珠全部吸附贴壁后弃上清，向EP管中加入800TL 80％乙醇溶液，震荡混匀后短暂离心，置于磁力架上。待磁珠全部吸附贴壁后弃上清，向EP管中加入800TL无水乙醇溶液，震荡混匀后短暂离心，置于磁力架上。将离心管短暂离心后，弃废液，打开EP管盖干燥5分钟。
小RNA洗脱：向管内加入30TL不含核酸酶的DEPC水(nTclease-free DEPC water),震荡混匀后静置5分钟。将离心管置于磁力架上，静置5分钟。将上清液转移至新的EP管中，得到目标产物。
(3)小RNA转录组测序；
小RNA定量：用于建库的小RNA样本首先用QTbit 4.0来进行定量，使用QTbitmicroRNA测定试剂盒来进行定量。对于建库的小RNA部分可用50pg-20ng作为起始量。
将小RNA分子与3’端接头连接：将小RNA分子样本与3’端接头混合，70℃反应2分钟，然后使用连接酶在连接反应体系中进行连接。连接反应体系包括：70℃反应的热变性产物，3’端接头，连接酶，连接酶反应缓冲液和RNA酶抑制剂。反应条件为37℃反应30分钟。
将连接有3’端接头的小RNA分子与5’端接头连接：将连接有3’端接头的小RNA分子样本与5’端接头混合，70℃反应2分钟，然后使用连接酶在连接反应体系中进行连接。反应条件为25℃反应2小时。
延伸反应：以上一步得到的连接产物为模板，利用根据3’端接头已知序列设计的延伸引物进行延伸，获得延伸产物。延伸反应体系包括：上一步得到的连接产物，延伸引物，延伸反应缓冲液，逆转录酶。反应条件为42℃反应30分钟。在逆转录酶的作用下，水解RNA链获得延伸产物cDNA。
二链合成反应：以上一步得到的延伸产物为模板，利用cDNA已知序列设计的二链合成引物合成包含cDNA互补链的二链合成产物。反应体系包括：上一步得到的延伸产物，二链合成引物，DNA聚合酶缓冲液和DNA聚合酶。反应条件为98℃变性2分钟，60℃反应30秒，72℃反应5分钟。
PCR扩增：以上一步的产物为模板，利用根据延伸引物和二链合成引物已知序列设计的正反向引物，进行PCR扩增，所述正反向引物中可引入一定个数的随机碱基用于在高通量测序中区分不同的样本。反应体系包括：上一步得到的产物，正反向PCR引物，高保真DNA聚合酶，DNA聚合酶缓冲液。反应条件为98℃变性2分钟，98℃反应15秒，60℃反应30秒，72℃反应30秒。该过程循环反应15-18个循环，然后72℃反应5分钟。
PCR产物纯化：磁珠法进行PCR产物纯化，得出目的产物，回收得到文库。
上机测序及数据分析：使用DNBSEQ-T7高通量测序仪对文库进行双端测序。在获得下机测序的原始数据后，使用fastp软件进行清洗、去除接头、低质量序列等。然后再使用bowtie软件比对到人类基因组(hg38)上，并使用TMI进行矫正，再将reads比对到piRBase数据库，计算获得血浆piRNA表达矩阵。
(4)基于血浆piRNA表达矩阵建立Lasso Logistic回归模型；
在获得血浆piRNA表达矩阵后，我们将所有样本按照70％、30％的比例随机分为训练集、测试集，并在训练集中构建Lasso Logistic回归模型，然后在训练集和测试集中采用ATC、灵敏度、特异度等指标评估模型的预测准确性。所使用的软件为R语言程序的glmnet包。
Lasso Logistic回归模型与传统的Logistic回归模型相比，最大的不同在于Lasso Logistic回归模型引入了回归系数的正则化参数λ。通过调整参数λ值，可以使得某些变量的回归系数等于0(使除了表2所示piRNA之外的其他piRNA的回归系数等于0)，达到了变量筛选的目的，有利于模型的应用推广。
最优的λ值是根据在训练集中采用20折交叉验证的方法确定的，在该λ取值时Lasso Logistic回归模型的部分似然估计偏差最小，见图2，并得出在该λ取值时，179个piRNA的回归系数等于0，25个piRNA的回归系数不为0，这25个piRNA的序列及其回归系数见表2。
每个piRNA表达值的回归系数值表示该piRNA的表达量每变化1个单位，受试者的结直肠癌发病风险评分的改变值。若回归系数为正数，则表示该piRNA表达值升高时结直肠癌发病风险增加；类似的，若回归系数为负数，则表示该piRNA表达值升高时结直肠癌发病风险降低。结直肠癌发病风险评分的数学计算公式为：
结直肠癌发病风险评分(Lasso_Logistic_Score)＝∑(血浆piRNA表达值*回归系数)。
在训练集中采用Lasso Logistic回归模型构建结直肠癌发病风险预测模型后，该模型在训练集中的ATC为0.891，敏感度为0.781，特异度为0.838，如图3所示。将上述模型应用至测试集中，该模型在测试集中的ATC为0.832，敏感度为0.795，特异度为0.815，如图4所示。以上结果表明了本发明的方法以及构建的模型能够较为准确的预测结直肠癌发病风险。
综上所述，本发明基于中国人群的血浆piRNA表达谱，得到了用于结直肠癌早期诊断的血浆piRNA组合，并基于血浆piRNA组合建立了结直肠癌早期诊断模型，该模型能够较为准确的预测结直肠癌发病风险，有助于降低检测的成本，同时本发明使用了LassoLogistic回归模型，使模型纳入的变量数目大幅度降低，便于模型的应用推广。
以上所述了本发明的一个实施例，本领域的普通技术人员可以理解，应当指出，在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例、方法学、模型进行多种变化、修改、替换和补充，这些变化、修改、替换和补充也应该视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种用于结直肠癌早期诊断的血浆piRNA组合，其特征在于：所述血浆piRNA组合中的血浆piRNA由以下组成：piR-hsa-18001-1、piR-hsa-11146、piR-hsa-3100-1、piR-hsa-3100-2、piR-hsa-3100-3、piR-hsa-3100-4、piR-hsa-3100-5、piR-hsa-3100-6、piR-hsa-3110-1、piR-hsa-3110-2、piR-hsa-3110-3、piR-hsa-3110-4、piR-hsa-3110-5、piR-hsa-3110-6、piR-hsa-31395、piR-hsa-14100、piR-hsa-2801、piR-hsa-18001-2、piR-hsa-5435、piR-hsa-6391、piR-hsa-4548、piR-hsa-30005-1、piR-hsa-30005-2、piR-hsa-29730和piR-hsa-26246；
piR-hsa-18001-1的碱基序列：AGCTGTGGATAGCGGTG；
piR-hsa-11146的碱基序列：AGTGGATGTGGTGGAT；
piR-hsa-3100-1的碱基序列：CCACTGCTAAATTTGTCTGGCTA；
piR-hsa-3100-2的碱基序列：CCACTTCTAAATTTGACTGGCTA；
piR-hsa-3100-3的碱基序列：CCCACTGCTAAATTTNACTGGCTA；
piR-hsa-3100-4的碱基序列：CCCCACTGCTAAATTTGACTGTCTA；
piR-hsa-3100-5的碱基序列：CCCCCACTGCTAAATNTGACTGGCTA；
piR-hsa-3100-6的碱基序列：CCCCCACTGCTAAATTTGANTGGCTA；
piR-hsa-3110-1的碱基序列：CCCCCCACGGCTAAATTTGACTGGCTA；
piR-hsa-3110-2的碱基序列：CCCCCCACTGCTAAATTTGACNGGCTA；
piR-hsa-3110-3的碱基序列：CCCCCCACTGCTAAATTTGACTGGGTA；
piR-hsa-3110-4的碱基序列：CCCCCCACTGCTAAATTTGACTGNCTA；
piR-hsa-3110-5的碱基序列：CCCCCCACTGCTAGATTTGACTGGCTA；
piR-hsa-3110-6的碱基序列：CGCACTGCTAAATTTGACTGGCTA；
piR-hsa-31395 的碱基序列：CTGGGAGAGCGCGTGCCTT；
piR-hsa-14100的碱基序列：CTGGTCTAGTGGTTAGGATTCGGCAC；
piR-hsa-2801的碱基序列：GCCGGGGTGGCCGAAT；
piR-hsa-18001-2的碱基序列：GCTGTGGATAGCGGTG；
piR-hsa-5435的碱基序列：GGTCGGGGGTTCGGTCCC；
piR-hsa-6391的碱基序列：GGTGGGTGTAGCTCAG；
piR-hsa-4548的碱基序列：GTGGCCGAGTGGTTAAGGCAAA；
piR-hsa-30005-1的碱基序列：GTTCGTTCCTGGGCAG；
piR-hsa-30005-2的碱基序列：GTTCGTTCCTGGGCAGA；
piR-hsa-29730的碱基序列：TCGCCTTCGGCAGTTC；
piR-hsa-26246的碱基序列：TTTTGGAGCACGGAGAG。
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