CN108220416B - 一种用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒及其应用 - Google Patents

一种用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒，属于血清生物学标志物领域。所述试剂盒包括3条血清miRNA的PCR引物。本发明提供的用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒，采用3条血清miRA作为诊断标志物，并通过对上述标志物进行定量，鉴别阴虚上火体质，可以代替传统望、闻、问、切的中医诊断方法，将中医证候的诊断与现代分子生物学相结合，达到诊断的标准化；并且该用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒，通过对3条血清miRNA同时定量，鉴别阴虚上火体质，诊断的灵敏度达到95.7%、特异性达到73.6%，并且高于单个miRNA的诊断特性。

Description

一种用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒及其 应用
技术领域
本发明涉及血清生物学标志物领域，具体涉及一种用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒及其应用。
背景技术
阴虚上火是一种常见的亚健康状态，表现为口干舌燥、目干涩痛、大便干结、心烦易怒，或伴有复发性口舌生疮、牙龈肿痛、咽喉肿胀等炎性症状，俗称上火。阴虚上火虽然尚未达到疾病的临床诊断标准，但作为一种亚健康状态严重影响人们的正常生活与工作，降低生活质量。据报道，阴虚上火体质主要发生在工作、学业压力较大的公司白领和大学生群体中。15至30岁年龄段人群阴虚上火的发生率远远高于其他年龄段，阴虚上火体质的诊断、预防与治疗尤为重要。目前，临床判断阴虚上火的主要方法是通过问诊并且观察舌象、脉象进行，缺乏量化的诊断指标。
系统生物学的特点是整体性、时效性，与中医学整体观念、辩证施治的思想较为一致，系统生物学技术的发展为中医学中复杂生命现象的研究提供了可行条件。miRNA稳定存在于血清和血浆中，适合作为疾病的候选生物学标记物，而且从血清中寻找疾病生物标志物一直以来是人们研究的热点，但是miRNA用于中医证候的生物学标志物还鲜有报道。miRNA测序是系统生物学的一种重要手段，其目的在于发现对基因转录调控有重要作用的全部miRNA，可以通过筛选并鉴定与阴虚上火体质相关的miRNA，应用生物信息学方法构建与基因、miRNA以及蛋白的网络联系，对阴虚上火的本质作出全面解释。
因此，研究一种能够检测与阴虚上火体质相关的miRNA的试剂盒具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒及其应用，该试剂盒能够代替传统的中医诊断方法，将中医证候的诊断与现代分子生物学相结合，达到诊断的标准化，具有灵敏度高、特异性高的特点。
基于上述目的，本发明提供的一种用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒，所述试剂盒包括3条血清miRNA的PCR引物，3条血清miRNA分别为hsa-miR-221-3p、hsa-miR-30b-5p和hsa-miR-142-3p，所述3条血清miRNA的PCR引物包括hsa-miR-221-3p的PCR引物、hsa-miR-30b-5p的PCR引物和hsa-miR-142-3p的PCR引物；
所述3条血清miRNA的PCR引物序列分别如下所示：
hsa-miR-221-3p的引物：5’-GCGCAGCTACATTGTCTGCTGGGTTTC-3’，
hsa-miR-30b-5p的引物：5’-CGCGCGTGTAAACATCCTACACTCAGCT-3’，
hsa-miR-142-3p的引物：5’-CCGCGTGTAGTGTTTCCTACTTTATGGA-3’。
本发明中，3条血清miRNA的PCR引物即hsa-miR-221-3p的PCR引物、hsa-miR-30b-5p的PCR引物和hsa-miR-142-3p的PCR引物由发明人自己设计，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成；3条血清miRNA的序列分别如下所示：
hsa-miR-221-3p：AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC
hsa-miR-30b-5p：UGUAAACAUCCUACACUCAGCU
hsa-miR-142-3p：UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA
本发明筛选出3个血清miRNA作为阴虚上火体质人群判定的生物学标志物，这3个血清miRNA在阴虚上火质人群、平和质人群血清中有显著性差异表达，这3个血清miRNA在阴虚上火质人群血清中的相对表达量均低于在平和质人群血清中的相对表达量，因此，可将该3个血清miRNA作为阴虚上火体质判定的生物学标志物；本发明应用Solexa测序技术研究阴虚上火体质人群、平和质人群血清中表达差异的miRNA，并通过生物信息学分析，获得在阴虚上火体质人群中显著变化miRNA作为诊断标志物，代替传统的问诊、观察舌象脉象来鉴别阴虚上火体质，增加中医证候诊断的科学性。
优选地，所述试剂盒还包括1条内参miRNA的PCR引物，内参miRNA为hsa-miR-16-5p；所述内参miRNA的PCR引物序列为5’-CGCGCTAGCAGCACGTAAAT-3’。
本发明中的内参miRNA的PCR引物即hsa-miR-16-5p的PCR引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司，内参miRNA的序列为：UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG。
优选地，所述试剂盒还包括RNA提取液、反转录反应液、荧光定量RT-PCR反应液和小RNA吸附柱。
更优选地，所述RNA提取液包括裂解液、去蛋白液、漂洗液、氯仿、无水乙醇和无RNA酶双蒸水；
所述反转录反应液包括反转录酶和反转录缓冲液，所述反转录酶包括E.coliPoly(A)Polymerase、RTase和RNasin；
所述荧光定量RT-PCR反应液包括Master mix、通用下游引物和无RNA酶双蒸水。
本发明中，反转录酶与反转录缓冲液均购自天根生化科技(北京)有限公司；Master mix、和无RNA酶双蒸水均购自罗氏诊断产品(上海)有限公司，通用下游引物购自天根生化科技(北京)有限公司，目录号为：CD109；裂解液、去蛋白液、漂洗液和小RNA吸附柱均购自天根生化科技(北京)有限公司。
优选地，反转录反应体系以20.0μL计包括：
总RNA：8.0μL；
反转录缓冲液：10.0μL；
反转录酶：2.0μL。
优选地，荧光定量RT-PCR反应体系以10.0μL计为：
cDNA模板：2.5μL；
Master mix：5μL；
miRNA上游引物：0.5μL；
通用下游引物：0.5μL；
无RNA酶双蒸水：1.5μL；
其中，所述miRNA上游引物的浓度为10μM，所述miRNA上游引物为hsa-miR-221-3p的PCR引物、hsa-miR-30b-5p的PCR引物、hsa-miR-142-3p的PCR引物或hsa-miR-16-5p的PCR引物。
基于相同的发明构思，本发明还提供了一种所述的用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)采集外周血，离心，取血清；
(2)将步骤(1)中所得血清采用RNA提取液提取总RNA；
(3)将步骤(2)中所得的总RNA加入反转录反应液中形成20.0μL的反转录反应体系，42℃反应60min，95℃酶失活反应3min，得cDNA模板反应液；
(4)取2.5μL步骤(3)中所得的cDNA模板反应液、0.5μL miRNA上游引物加入荧光定量RT-PCR反应液中以形成10.0μL的荧光定量RT-PCR反应体系，95℃预变性10min，95℃模板变性10秒，60℃淬火20秒，72℃延伸15秒，40～45个循环；
其中，所述miRNA上游引物的浓度为10μM，所述miRNA上游引物的浓度为10μM，所述miRNA上游引物为hsa-miR-221-3p的PCR引物、hsa-miR-30b-5p的PCR引物、hsa-miR-142-3p的PCR引物或hsa-miR-16-5p的PCR引物。
(5)分别计算3个血清miRNA和内参miRNA的相对表达量，带入Logistic逐步模型的回归方程，经计算后评估检测阴虚上火体质的灵敏度和特异性。
优选地，所述Logistic逐步模型的回归方程为：
Logit(p)＝8.4960–86.1493×(hsa-miR-142-3p相对表达量)+394.9771×(hsa-miR-30b-5p相对表达量)+187.4910×(hsa-miR-221-3p相对表达量)
获得Logit(p)值，通过P＝exp[Logit(p)]/(1+exp[Logit(p)])换算得到P值，以0.5为界，判断阴虚上火情况。在本发明中，如果P值接近于1，则可判定为阴虚上火体质，如果P值接近于0，则可判定不是阴虚上火体质。
基于相同的发明构思，本发明还提供了一种所述的用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒在制备检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂中的应用。
本发明中，运用MedCalc软件计算单个血清hsa-miR-221-3p、hsa-miR-30b-5p、hsa-miR-142-3p鉴别阴虚上火体质的ROC曲线，包括灵敏度、特异性和曲线下面积(AUC)，结果显示hsa-miR-221-3p、hsa-miR-30b-5p和hsa-miR-142-3p的AUC分别是0.626、0.710、0.761，敏感性分别是41.30％、60.87％、79.35％，特异性分别是85.00％、76.00％、65.00％，说明单个miRNA鉴别阴虚“上火”的敏感性和特异性不高。
运用Logistic逐步回归模型计算血清hsa-miR-221-3p、hsa-miR-30b-5p和hsa-miR-142-3p组合物鉴别阴虚上火体质的ROC曲线，通过数据计算和分析，构建二分类Logistic逐步模型的回归方程：
Logit(p)＝8.4960–86.1493×(hsa-miR-142-3p相对表达量)+394.9771×(hsa-miR-30b-5p相对表达量)+187.4910×(hsa-miR-221-3p相对表达量)，曲线下面积(AUC)是0.929(P<0.0001，95％Confidence Interval＝0.874-0.965)，灵敏度为95.7％、特异性为73.6％，高于单个血清miRNA作为诊断模型的特异性与敏感性，表明该血清miRNAs组合物诊断阴虚上火体质具有较高的准确性。
从上面所述可以看出，本发明的优点和有益效果是：
(1)本发明提供的用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒，采用血清hsa-miR-221-3p、hsa-miR-30b-5p和hsa-miR-142-3p作为诊断标志物，并通过对上述标志物进行相对定量，鉴别阴虚上火体质，可以代替传统望、闻、问、切的中医诊断方法，将中医证候的诊断与现代分子生物学相结合，达到诊断的标准化。
(2)经大样本量验证，在阴虚上火群体中，单个血清hsa-miR-221-3p、hsa-miR-30b-5p或hsa-miR-142-3p均是显著性低表达，本发明提供的用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒，通过对血清hsa-miR-221-3p、hsa-miR-30b-5p或hsa-miR-142-3p的同时相对定量，鉴别阴虚上火体质，诊断的灵敏度达到95.7％、特异性达到73.6％，具有较高的准确性，并且高于单个miRNA的诊断特性。
附图说明
图1为本发明实施例中阴虚上火体质人群、平和质人群血清中hsa-miR-221-3p的表达水平比较示意图；
图2为本发明实施例中阴虚上火体质人群、平和质人群血清中hsa-miR-30b-5p的表达水平比较示意图；
图3为本发明实施例中阴虚上火体质人群、平和质人群血清中hsa-miR-142-3p的表达水平比较示意图；
图4为本发明实施例中血清hsa-miR-221-3p、hsa-miR-30b-5p、hsa-miR-142-3p和组合物的ROC曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
实施例1用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒的组成
在本实施例中，所述用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒包括3条血清miRNA的PCR引物、1条内参miRNA的PCR引物、RNA提取液、反转录反应液、荧光定量RT-PCR反应液和小RNA吸附柱。
在本实施例中，3条血清miRNA分别为hsa-miR-221-3p、hsa-miR-30b-5p和hsa-miR-142-3p，所述3条血清miRNA的PCR引物包括hsa-miR-221-3p的PCR引物、hsa-miR-30b-5p的PCR引物和hsa-miR-142-3p的PCR引物；
所述3条血清miRNA的PCR引物序列分别如下所示：
hsa-miR-221-3p的引物：5’-GCGCAGCTACATTGTCTGCTGGGTTTC-3’，
hsa-miR-30b-5p的引物：5’-CGCGCGTGTAAACATCCTACACTCAGCT-3’，
hsa-miR-142-3p的引物：5’-CCGCGTGTAGTGTTTCCTACTTTATGGA-3’。
在本实施例中，3条血清miRNA的PCR引物由发明人自己设计，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成；3条血清miRNA的序列分别如下所示：
hsa-miR-221-3p：AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC
hsa-miR-30b-5p：UGUAAACAUCCUACACUCAGCU
hsa-miR-142-3p：UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA。
在本实施例中，内参miRNA为hsa-miR-16-5p，内参miRNA的PCR引物序列为5’-CGCGCTAGCAGCACGTAAAT-3’，内参miRNA的PCR引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司，内参miRNA即hsa-miR-16-5p的序列为：UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG。
在本实施例中，所述RNA提取液包括裂解液、去蛋白液、漂洗液、氯仿、无水乙醇和无RNA酶双蒸水；裂解液、去蛋白液、漂洗液和小RNA吸附柱均购自天根生化科技(北京)有限公司；
所述反转录反应液包括反转录酶、反转录缓冲液和无RNA酶双蒸水，所述反转录酶包括E.coliPoly(A)Polymerase、RTase和RNasin；其中，反转录酶与反转录缓冲液均购自天根生化科技(北京)有限公司，无RNA酶双蒸水购自罗氏诊断产品(上海)有限公司；
所述荧光定量RT-PCR反应液包括Master mix、通用下游引物和无RNA酶双蒸水；Master mix购自罗氏诊断产品(上海)有限公司，通用下游引物购自天根生化科技(北京)有限公司，目录号为：CD109；
实施例2检测阴虚上火体质血清特异性miRNA试剂盒Logistic逐步回归模型建立
采用检测阴虚上火体质血清特异性miRNA试剂盒分别检测阴虚上火质人群、平和质人群血清中hsa-miR-221-3p、hsa-miR-30b-5p和hsa-miR-142-3p的表达水平。
(1)样本采集
依据1994年发布的中华人民共和国中医药行业标准《中医病证诊断疗效标准》中口疮的中医疾病诊断标准和证候分类诊断标准，对符合以下临床症状的列为阴虚上火体质：1)以口腔粘膜出现单个或数个直径3～5mm的溃疡，灼热疼痛为主要症状；2)起病较快，一般7天左右愈合，若此伏彼起，则病程延长。愈后常易复发；3)口腔检查：口腔粘膜溃疡较表浅，圆形或椭圆形，数量少则1～2个，多则10余个，表面有淡黄色分泌物附着，溃疡周围粘膜大多充血；4)证候诊断(阴虚型)：口内疼痛，口干，手足心热，乏力。口疮1～2个或2～3个，周围轻微充血。舌红，苔少，脉细数。
阴虚上火体质人群纳入和排除标准：根据《中医体质分类与判定表》判定，纳入阴虚型易上火(易发生口疮，每年发作≥8次)的人群；年龄在18周岁至65周岁之间者。收集阴虚上火质人群46例，收集平和质人群55例，排除合并各系统靶器官严重病变、精神病、肿瘤、结核病等疾病的患者，及怀孕、哺乳期妇女。
所有参加者血样均为空腹抽取，采用一次性真空不抗凝采血管，抽取外周血5ml，4℃、12000rpm离心15min，取上层血清，以每管200μL进行分装，保存于-80℃冰箱中。
(2)血清样本总RNA提取
S1.在200μL血清样本中加入700μL裂解液，室温放置5min，然后加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置5min，然后4℃、12000rpm离心15min；
S2.取上层水相，然后转移至新的1.5mL离心管中，加入两倍体积的无水乙醇，混合均匀，然后将得到的混合物转入小RNA吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心30s，离心完后弃掉流出液，保留小RNA吸附柱；
S3.向小RNA吸附柱中加入700μL去蛋白液，室温静置2min，然后12000rpm离心30s，离心完后弃掉废液，保留小RNA吸附柱；
S4.然后向小RNA吸附柱中加入500μL漂洗液，室温静置2min，12000rpm离心30s，离心完后弃掉废液，重复两次，保留小RNA吸附柱；
S5.将小RNA吸附柱放入收集管中，室温12000rpm离心2min，弃收集管，并将小RNA吸附柱于室温放置5min，以充分晾干小RNA吸附柱；
S6.将小RNA吸附柱转入新的1.5mL的无RNase-Free离心管中，向吸附膜中心位置加入30μL无RNA酶双蒸水，室温放置2min，然后12000rpm离心2min，收集总RNA。
(3)cDNA第一链合成
将总RNA加入反转录反应液中形成20.0μL的反转录反应体系，反转录反应体系以20.0μL计包括：
总RNA：8.0μL；
反转录缓冲液：10.0μL；
反转录酶：2.0μL；
将反转录反应体系42℃下进行加A尾反应和逆转录反应60min，95℃下酶失活反应3min，得到cDNA模板反应液。
(4)荧光定量RT-PCR
取2.5μL cDNA模板反应液加入荧光定量RT-PCR反应液中以形成10.0μL的荧光定量RT-PCR反应体系，荧光定量RT-PCR反应体系以10.0μL计为：
cDNA模板：2.5μL；
Master Mix：5μL；
miRNA上游引物：0.5μL；
通用下游引物：0.5μL；
无RNA酶双蒸水：1.5μL；
其中，所述miRNA上游引物的浓度为10μM，所述miRNA上游引物为hsa-miR-221-3p的PCR引物、hsa-miR-30b-5p的PCR引物、hsa-miR-142-3p的PCR引物或hsa-miR-16-5p的PCR引物；
将荧光定量RT-PCR反应体系95℃预变性10min，95℃模板变性10秒，60℃淬火20秒，72℃延伸15秒，40～45个循环。
优选地，将荧光定量RT-PCR反应体系95℃预变性10min，95℃模板变性10s，60℃淬火20秒，72℃延伸15秒，43个循环。
设置阴性对照组，取2.5μL双蒸水加入荧光定量RT-PCR反应液中以形成10.0μL的对照组荧光定量RT-PCR反应体系，对照组荧光定量RT-PCR反应体系以10.0μL计为：
双蒸水：2.5μL；
Master Mix：5μL；
miRNA上游引物：0.5μL；
通用下游引物：0.5μL；
无RNA酶双蒸水：1.5μL；
其中，所述miRNA上游引物的浓度为10μM，所述miRNA上游引物为hsa-miR-221-3p的PCR引物、hsa-miR-30b-5p的PCR引物、hsa-miR-142-3p的PCR引物或hsa-miR-16-5p的PCR引物；
阴性对照组荧光定量RT-PCR反应体系进行上述相同的反应过程。
记录目的miRNAs、内参miRNA及阴性对照组的CT值。
所有的荧光定量RT-PCR测定重复两次，以提高测定准确度。
(5)数据统计
根据样本miRNAs CT值，取平均值换算各样本miRNAs的相对表达量。miRNA的相对表达量为2-ΔCT，ΔCT(疾病组)＝CT miRNA(疾病组)-CT miR-16，ΔCT(正常组)＝CT miRNA(正常组)-CT miR-16。用GraphPad Prism 5软件Mann-Whitney test对miRNA在不同组别中进行统计分析(p<0.05时，具有显著性差异，p<0.01时，具有极显著性差异)，并绘制点状图，如图1～3所示。
运用MedCalc软件计算单个血清hsa-miR-221-3p、hsa-miR-30b-5p、hsa-miR-142-3p鉴别阴虚上火体质的ROC曲线，包括灵敏度、特异性和曲线下面积(AUC)，结果显示hsa-miR-221-3p、hsa-miR-30b-5p和hsa-miR-142-3p的AUC分别是0.626、0.710、0.761，敏感性分别是41.30％、60.87％、79.35％，特异性分别是85.00％、76.00％、65.00％，说明单个miRNA鉴别阴虚“上火”的敏感性和特异性不高。
运用Logistic逐步回归模型计算血清hsa-miR-221-3p、hsa-miR-30b-5p和hsa-miR-142-3p组合物鉴别阴虚上火体质的ROC曲线，通过数据计算和分析，构建二分类Logistic逐步模型的回归方程：
Logit(p)＝8.4960–86.1493×(hsa-miR-142-3p相对表达量)+394.9771×(hsa-miR-30b-5p相对表达量)+187.4910×(hsa-miR-221-3p相对表达量)，其ROC曲线如图4所示，曲线下面积(AUC)是0.929(P<0.0001，95％Confidence Interval＝0.874-0.965)，参见图4，灵敏度为95.7％、特异性为73.6％，高于单个血清miRNA作为诊断模型的特异性与敏感性，表明该血清miRNAs组合物诊断阴虚上火体质具有较高的准确性。
获得Logit(p)值，通过P＝exp[Logit(p)]/(1+exp[Logit(p)])换算得到P值，以0.5为界，判断阴虚上火情况。在本发明中，如果P值接近于1，则可判定为阴虚上火体质，如果P值接近于0，则可判定不是阴虚上火体质。
从上面所述可以看出，本发明的优点和有益效果是：
(1)本发明提供的用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒，采用血清hsa-miR-221-3p、hsa-miR-30b-5p和hsa-miR-142-3p作为诊断标志物，并通过对上述标志物进行定量，鉴别阴虚上火体质，可以代替传统望、闻、问、切的中医诊断方法，将中医证候的诊断与现代分子生物学相结合，达到诊断的标准化。
(2)经大样本量验证，在阴虚上火群体中，单个血清hsa-miR-221-3p、hsa-miR-30b-5p或hsa-miR-142-3p均是显著性低表达，本发明提供的用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒，通过对血清hsa-miR-221-3p、hsa-miR-30b-5p或hsa-miR-142-3p的同时定量，鉴别阴虚上火体质，诊断的灵敏度达到95.7％、特异性达到73.6％，具有较高的准确性，并且高于单个miRNA的诊断特性。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>李继承
<120>一种用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒及其应用
<130>FI170595
<160>4
<170>PatentIn version 3.5
<210> 1
<211>23
<212> hsa-miR-221-3p
<400> 1
agcuacauug ucugcugggu uuc 23
<210>2
<211>22
<212> hsa-miR-30b-5p
<400>2
uguaaacauc cuacacucag cu 22
<210>3
<211>23
<212> hsa-miR-142-3p
<400> 3
uguaguguuu ccuacuuuau gga 23
<210>4
<211>22
<212>内参miRNA
<400> 4
uagcagcacg uaaauauugg cg 22

Claims (8)

1.一种用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒在制备检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括3条血清miRNA的PCR引物，3条血清miRNA分别为hsa-miR-221-3p、hsa-miR-30b-5p和hsa-miR-142-3p，所述3条血清miRNA的PCR引物包括hsa-miR-221-3p的PCR引物、hsa-miR-30b-5p的PCR引物和hsa-miR-142-3p的PCR引物；
所述3条血清miRNA的PCR引物序列分别如下所示：
hsa-miR-221-3p的引物：5’-GCGCAGCTACATTGTCTGCTGGGTTTC-3’，
hsa-miR-30b-5p的引物：5’-CGCGCGTGTAAACATCCTACACTCAGCT-3’，
hsa-miR-142-3p的引物：5’-CCGCGTGTAGTGTTTCCTACTTTATGGA-3’。
2.根据权利要求1所述的用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒在制备检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂中的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括1条内参miRNA的PCR引物，内参miRNA为hsa-miR-16-5p；所述内参miRNA的PCR引物序列为5’-CGCGCTAGCAGCACGTAAAT-3’。
3.根据权利要求1所述的用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒在制备检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂中的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括RNA提取液、反转录反应液、荧光定量RT-PCR反应液和小RNA吸附柱。
4.根据权利要求3所述的用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒在制备检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂中的应用，其特征在于，所述RNA提取液包括裂解液、去蛋白液、漂洗液、氯仿、无水乙醇和无RNA酶双蒸水；
所述反转录反应液包括反转录酶和反转录缓冲液，所述反转录酶包括E.coliPoly(A)Polymerase、RTase和RNasin；
所述荧光定量RT-PCR反应液包括Master mix、通用下游引物和无RNA酶双蒸水。
5.根据权利要求1所述的用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒在制备检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂中的应用，其特征在于，反转录反应体系以20.0μL计包括：
总RNA：8.0μL；
反转录缓冲液：10.0μL；
反转录酶：2.0μL。
6.根据权利要求1所述的用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒在制备检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂中的应用，其特征在于，荧光定量RT-PCR反应体系以10.0μL计为：
cDNA模板：2.5μL；
Master Mix：5μL；
miRNA上游引物：0.5μL；
通用下游引物：0.5μL；
无RNA酶双蒸水：1.5μL；
其中，所述miRNA上游引物的浓度为10μM，所述miRNA上游引物为hsa-miR-221-3p的PCR引物、hsa-miR-30b-5p的PCR引物、hsa-miR-142-3p的PCR引物或hsa-miR-16-5p的PCR引物。
7.根据权利要求1所述的用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒在制备检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集外周血，离心，取血清；
(2)将步骤(1)中所得血清采用RNA提取液提取总RNA；
(3)将步骤(2)中所得的总RNA加入反转录反应液中形成20.0μL的反转录反应体系，42℃反应60min，95℃酶失活反应3min，得cDNA模板反应液；
(4)取2.5μL步骤(3)中所得的cDNA模板反应液、0.5μL miRNA上游引物加入荧光定量RT-PCR反应液中以形成10.0μL的荧光定量RT-PCR反应体系，95℃预变性10min，95℃模板变性10秒，60℃淬火20秒，72℃延伸15秒，40～45个循环；
其中，所述miRNA上游引物的浓度为10μM，所述miRNA上游引物的浓度为10μM，所述miRNA上游引物为hsa-miR-221-3p的PCR引物、hsa-miR-30b-5p的PCR引物、hsa-miR-142-3p的PCR引物或hsa-miR-16-5p的PCR引物。
(5)分别计算3个血清miRNA和内参miRNA的浓度，带入Logistic逐步模型的回归方程，经计算后评估检测阴虚上火体质的灵敏度和特异性。
8.根据权利要求7所述的用于检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂盒在制备检测阴虚上火体质血清特异性miRNA的试剂中的应用，其特征在于，所述Logistic逐步模型的回归方程为：
Logit(p)＝8.4960–86.1493×(hsa-miR-142-3p相对表达量)+394.9771×(hsa-miR-30b-5p相对表达量)+187.4910×(hsa-miR-221-3p相对表达量)
获得Logit(p)值，通过P＝exp[Logit(p)]/(1+exp[Logit(p)])换算得到P值，以0.5为界，判断阴虚上火情况。
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