CN108796066A

CN108796066A - 与克罗恩病相关的miRNA标志物及其应用

Info

Publication number: CN108796066A
Application number: CN201810686991.1A
Authority: CN
Inventors: 石岩; 姚俊; 许亚平; 周勇; 王涛
Original assignee: Zhenjiang First Peoples Hospital
Current assignee: Zhenjiang First Peoples Hospital
Priority date: 2018-06-28
Filing date: 2018-06-28
Publication date: 2018-11-13
Anticipated expiration: 2038-06-28
Also published as: CN108796066B

Abstract

本发明公开了一组与克罗恩病相关的miRNA标志物及其应用。该标志物为miR‑219a‑1‑3p和/或miR‑219a‑5p，采用qRT‑PCR对miR‑219a‑1‑3p和/或miR‑219a‑5p在克罗恩病中的表达水平进行检测，对克罗恩病的临床诊断和靶向治疗提供参考价值。该标志物用于克罗恩病临床诊断的准确性、灵敏度及特异度均较高，具有方便、快捷的优点，同时在一定程度上避免了肠镜检查的局限性。

Description

与克罗恩病相关的miRNA标志物及其应用

技术领域

本发明属于医学分子生物学技术领域，具体涉及一组与克罗恩病相关的miRNA标志物及其应用。

背景技术

克罗恩病(Crohn’s disease,CD)是一种累及胃肠道的慢性、复发性、非特异性炎症性疾病。目前CD的病因和发病机制仍不清楚，但是越来越多的研究表明，CD4⁺T细胞过度激活介导的炎症免疫反应在CD发病过程中具有至关重要作用。近年来，CD在我国的发病率呈逐年上升趋势，该疾病常迁延不愈，病情易复发，有致残、癌变等风险，严重影响了患者生存质量，给社会造成了沉重的医疗经济负担。因此，阐明CD的具体发病机制，找到能够用于CD临床诊断标志物和治疗的新靶点，对我国CD临床防治研究具有重要意义。

目前用于CD临床诊断的重要检查方法主要为内镜检查和组织病理学检查，创伤性较大。许多患者因病变导致肠腔严重狭窄，出现难以耐受肠镜检查或肠镜检查范围受限制等情况，且临床上目前仍缺乏与CD及其疾病活动性明显相关的特异性指标，使得CD临床诊断面临许多困难。由于缺乏特异性诊断标志物，部分CD常常难以与肠结核、缺血性肠炎和肠道肿瘤等疾病相鉴别，其治疗亦面临巨大挑战。因此，寻找CD的诊断标志物对临床上的诊疗过程来说是极其重要的，且对于CD的靶向治疗也具有积极意义。

microRNA(miRNA)是一类由18-24个核苷酸组成的内源性非编码单链小分子RNA，具有高度的保守性、表达多样性等特点。miRNA通过其5’端2-7个核苷酸(种子区)与靶基因mRNA的3’-UTR完全或不完全互补配对，导致靶基因转录抑制或降解，广泛参与细胞分化、成熟、增殖、凋亡、代谢等生物学过程。目前研究已发现多种miRNA在CD患者CD4⁺T细胞中表达异常，这些miRNA表达水平的改变与CD炎症反应严重程度密切相关，表明miRNA在CD诊断与治疗新型方法的开发应用上具有广阔的前景。

依据3’端和5’端序列不同，miR-219a-1可分别编码产生成熟的miR-219a-1-3p和miR-219a-5p分子。此外，miR-219a-2亦可编码产生成熟的miR-219a-5p分子。研究证实，miR-219a-1-3p和miR-219a-5p在多种慢性炎症、自身免疫性疾病、肿瘤(结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、恶性胶质瘤)等人体病理生理过程中发挥重要作用。但是，miR-219a-1-3p和miR-219a-5p在CD患者CD4⁺T细胞中的表达水平及作用均未有报道。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的是提供一组与克罗恩病相关的miRNA标志物及其应用，该miRNA标志物对于克罗恩病诊断具有很高的灵敏度和特异性，可以作为新型的生物标志物用于克罗恩病的检测，为克罗恩病临床诊断提供参考依据。

技术方案：与克罗恩病相关的miRNA标志物，该标志物为miR-219a-1-3p和/或miR-219a-5p，miR-219a-1-3p的RNA序列如SEQ ID NO.1所示，miR-219a-5p的RNA序列如SEQ IDNO.2所示。

上述与克罗恩病相关的miRNA标志物在制备检测克罗恩病诊断试剂盒中的应用。

上述与克罗恩病相关的miRNA标志物在筛选或制备治疗克罗恩病靶向药物中的应用。

用于检测上述miRNA标志物的引物对，对miR-219a-1-3p来说，上游引物序列如SEQID NO.3所示，下游引物为通用反向引物；对miR-219a-5p来说，上游引物序列如SEQ IDNO.4所示，下游引物为通用反向引物。

上述引物对在制备检测克罗恩病诊断试剂盒中的应用。

一种检测克罗恩病的诊断试剂盒，含有上述引物对。

进一步地，上述诊断试剂盒还包含PCR反应常用的试剂和酶。

有益效果：

1、本发明采用qRT-PCR对miR-219a-1-3p和miR-219a-5p在克罗恩病中的表达水平进行检测，对克罗恩病的临床诊断和靶向治疗提供参考价值。

2、miR-219a-1-3p和miR-219a-5p对克罗恩病均有一定的诊断价值，两者作为标志物用于克罗恩病诊断的特异性强，敏感性高，操作简单，结果稳定，具有广泛的临床应用前景。其联合诊断的AUC、灵敏度和特异度均优于单项miRNA测定，AUC曲线下面积最大，灵敏度和特异度都达到90％以上，是诊断克罗恩病的比较可靠的特异性生物标志物。

附图说明

图1为实施例1中miR-219a-1-3p在对照组和克罗恩病组的表达差异分析；

图2为实施例1中miR-219a-5p在对照组和克罗恩病组的表达差异分析；

图3为实施例1中miR-219a-1-3p表达水平对克罗恩病诊断的ROC曲线分析；

图4为实施例1中miR-219a-5p表达水平对克罗恩病诊断的ROC曲线分析；

图5为实施例1中miR-219a-1-3p和miR-219a-5p表达水平对克罗恩病诊断的ROC曲线分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步说明。

实施例1

miR-219a-1-3p和miR-219a-5p对克罗恩病的诊断

1.化合物：miR-219a-1-3p和miR-219a-5p特异性逆转录及qRT-PCR引物。

2.组合物：

(1)miRNA逆转录试剂：5×Reverse Transcription Buffer，RTase Mix，RNase-free H₂O，逆转录引物。

(2)miRNA qRT-PCR反应试剂：2×SYBR Green Mix(Taq酶、dNTP mix、PCR Buffer、SYBR GreenⅠ)；ddH₂O；ROX染料；miR-219a-1-3p和miR-219a-5p特异性qRT-PCR上游引物(miR-219a-1-3p上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，miR-219a-5p上游引物序列如SEQ IDNO.4所示)和通用下游引物。该方法基于特异性的茎环状RT引物及正反向引物，并采用SYBRGreen染料检测，无需荧光探针，具有高灵敏度和高特异性的优点。

3.方法：

(1)外周血CD4⁺T细胞分离：用肝素抗凝管采集克罗恩病患者和健康对照者外周静脉血5-10mL，按1:1比例与PBS混匀，缓慢加入等体积淋巴细胞分离液上层，注意液面分层，2000rpm梯度离心20分钟。细胞分层后，缓慢抽取中间云雾层细胞，使用PBS清洗、离心沉淀后即为外周血单个核细胞。使用CD4⁺T细胞分选磁珠(购自BD Biosciences)从外周血单个核细胞中提取CD4⁺T细胞，重复该步骤三次纯化CD4⁺T细胞即为所需样本。加入1ml Trizol后置于-80℃冰箱中保存。

(2)RNA提取：取出预先准备好的克罗恩病患者和健康对照者CD4⁺T细胞标本，加入200μL氯仿，剧烈震荡15s，置于室温下静置5min后离心，离心条件为4℃、12000rpm、15min。取出标本，缓慢吸取上层清液400mL，然后加入500mL异丙醇，缓慢混匀。室温下静置10min后离心，离心条件为4℃、12000rpm、10min。吸出全部液体，加入75％乙醇混匀后离心，离心条件为4℃、7500rpm、5min。离心结束后吸出乙醇，室温下迅速烘干RNA。加入适量DEPC水，使用Experion Automated Electrophoresis System(美国Bio-Rad Laboratories)检测RNA浓度及纯度，A260/280介于1.8-2.0的RNA样本用于后续PCR实验。

(3)miR-219a-1-3p和miR-219a-5p逆转录：

使用广东锐博公司miRNA逆转录试剂盒(5×Reverse Transcription Buffer，RTase Mix，RNase-free H₂O，内参5S逆转录引物)，miR-219a-1-3p和miR-219a-5p逆转录引物(miR-219a-1-3p逆转录引物序列如SEQ ID NO.5所示，miR-219a-5p逆转录引物序列如SEQ ID NO.6所示)进行逆转录。

具体步骤及方法如下：将上述试剂分别放置在冰上进行融解，待溶解完全后按照下表所示配制所需的反应体系。

试剂组分	体积
		RNA模版	1μg
MiR-219 RT primer(5uM)	1μL
		5×Reverse Transcription Buffer	2μL
RTase Mix	1μL
		RNase-free H₂O	5μL

以上体系混匀后，瞬时离心，置于逆转录PCR仪中，设定逆转录反应程序为：42℃60min，70℃10min。反应结束后，将所得克罗恩病NA迅速置于冰上冷却，用于以下qRT-PCR实验。

(4)miR-219a-1-3p和miR-219a-5p qRT-PCR实验

miR-219a-1-3p和miR-219a-5p qRT-PCR检测使用锐博公司的miRNA检测剂盒(2×SYBR Green Mix、miRNA通用下游引物、内参5S引物)、sigma公司的ROX染料、miR-219a-1-3p和miR-219a-5p特异性上游引物(miR-219a-1-3p上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，miR-219a-1-5p上游引物序列如SEQ ID NO.4所示)。定量仪器为ABI公司的7500型实时PCR仪。具体步骤及方法如下：将上述试剂分别放置在冰上进行融解，待溶解完全后按照如下表格配制所需的反应体系。

试剂组分	体积
		miRNA/cDNA	2μL
2×SYBR Green Mix	10μL
		MiR-219/Forward primer	0.8μL
Reverse primer	0.8μL
		ROX	0.4μL
ddH₂O	6μL

按照上述体系配置反应液，加入96孔板中，每个实时定量PCR反应分别做三个重复。反应条件为95℃10分钟，95℃2秒，60℃34秒，40个循环。反应结束后，将每个样本的目的基因(miR-219a-1-3p和miR-219a-5p)及内参基因5S的CT值拷贝后置于Excel表中分析。CT值表示每个样本荧光强度达到阈值时所用的循环数。

计算公式如下：ΔCT＝目的基因CT值-内参基因5S CT值，

ΔΔCT＝实验组目的基因ΔCT-对照组目的基因ΔCT，

相对值＝2^-ΔΔCT。

按照上述原理及公式处理实验结果，用于分析miR-219a-1-3p和miR-219a-5p在克罗恩病和健康对照者外周血CD4⁺T细胞中表达差异。

(5)统计学分析：

应用prism5统计软件，采用非配对样本t检验的方法分析克罗恩病与健康对照者外周血CD4⁺T细胞中miRNA表达差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

诊断价值评价应用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析，应用prism5绘制ROC曲线并计算曲线下面积AUC，来评价这两个miRNA分别诊断克罗恩病以及合并诊断克罗恩病的敏感性和特异性。AUC＜0.5时，表示诊断无意义；AUC＝0.5-0.7时，表示诊断准确性较低；AUC＝0.7-0.9时，表示诊断准确性中等；AUC＞0.9时，表示诊断准确性高。

4.结果分析：

(1)如图1和图2所示，miR-219a-1-3p和miR-219a-5p在克罗恩病患者外周血CD4⁺T细胞中表达均升高，差异有统计学意义(p<0.05)。

(2)miR-219a-1-3p、miR-219a-5p单独与联合检测对克罗恩病的诊断价值：

利用ROC曲线分析克罗恩病患者CD4⁺T细胞miR-219a-1-3p、miR-219a-5p的表达水平对克罗恩病诊断的检验效能，如图3、图4和图5所示，分析结果显示：miR-219a-1-3p和miR-219a-5p的曲线下面积(area undercurve，AUC)分别为0.7604、0.8715，若将miR-219a-1-3p和miR-219a-5p组合形成联检标志谱，则AUC为0.9688，大于单一miRNA的AUC，提示miR-219a-1-3p和miR-219a-5p的联合检测有助于提高对克罗恩病诊断的效能。

(3)以最大约登指数(约登指数＝灵敏度+特异度-1)所对应的miRNA表达水平作为最佳诊断界点，进一步分析miR-219a-1-3p、miR-219a-5p对克罗恩病诊断的灵敏度和特异度。结果表明，克罗恩病CD4⁺T细胞miR-219a-1-3p的灵敏度较高(83.33％)、但特异度低(59.38％)；克罗恩病CD4⁺T细胞miR-219a-5p的灵敏度较高(86.11％)，特异度较高(78.13％)；2个miRNA联合检测时，诊断的灵敏度可提高至97.68％，特异度为91.12％。如下表所示：

分子	AUC	灵敏度	特异度
				miR-219a-1-3p	0.7604	83.33％	59.38％
miR-219a-5p	0.8715	86.11％	78.13％
				2miRNAs	0.9688	97.68％	91.12％

综上所述，miR-219a-1-3p和miR-219a-5p在克罗恩病患者CD4⁺T细胞表达水平均显著降低，两者对克罗恩病均有一定的诊断价值，其联合诊断的AUC、灵敏度和特异度均优于单项miRNA测定，AUC曲线下面积最大，灵敏度和特异度都达到90％以上，是诊断克罗恩病的比较可靠的特异性生物标志物。

通常由于肠道病变较重导致肠腔狭窄，许多患者出现难以耐受肠镜检查或肠镜检查范围受限制等情况，使得克罗恩病临床诊断面临许多困难。本发明利用qRT-PCR检测方法发现克罗恩病患者外周血CD4⁺T细胞中miR-219a-1-3p和miR-219a-5p表达水平均降低，两者均可作为标志物用于克罗恩病的临床诊断，当两者联合使用时其准确性、灵敏度及特异度均有所提高。相对于现在所用的内镜检查方法，该检测方法更加方便、快捷，同时避免了肠镜检查的局限性，受试范围更加广泛。该检测方法中所用的qRT-PCR技术操作简便，所用试剂及引物针对性强，结果稳定，可重复性强，有利于推广。

序列表

<110> 镇江市第一人民医院

<120> 与克罗恩病相关的miRNA标志物及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agaguugagu cuggacgucc cg 22

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ugauugucca aacgcaauuc u 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcgcgagagt tgagtctgga c 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcgtgattg tccaaacgc 19

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaccgggac 50

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacagaatt 50

Claims

1.与克罗恩病相关的miRNA标志物，其特征在于：该标志物为miR-219a-1-3p和/或miR-219a-5p，所述miR-219a-1-3p的RNA序列如SEQ ID NO .1所示，所述miR-219a-5p的RNA序列如SEQ ID NO .2所示。

2.权利要求1所述的miRNA标志物在制备检测克罗恩病诊断试剂盒中的应用。

3.权利要求1所述的miRNA标志物在筛选或制备治疗克罗恩病靶向药物中的应用。

4.用于检测权利要求1所述的miRNA标志物的引物对，其特征在于：对miR-219a-1-3p来说，上游引物序列如SEQ ID NO .3所示，下游引物为通用反向引物；对miR-219a-5p来说，上游引物序列如SEQ ID NO .4所示，下游引物为通用反向引物。

5.权利要求4所述的引物对在制备检测克罗恩病诊断试剂盒中的应用。

6.一种检测克罗恩病的诊断试剂盒，其特征在于：含有权利要求3所述的引物对。

7.根据权利要求6所述的诊断试剂盒，其特征在于：还包含PCR反应的试剂和酶。