CN110951870A - miRNA表达量在预测氯吡格雷治疗疗效中的应用 - Google Patents

miRNA表达量在预测氯吡格雷治疗疗效中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了miRNA表达量在预测氯吡格雷治疗疗效中的应用。本发明首先公开了检测miRNA表达量或相对表达量的系统在制备预测或辅助预测氯吡格雷治疗疗效的产品中的应用；所述miRNA为miR‑126、miR‑223和miR‑150中的三种、两种或一种。本发明进一步公开了预测或辅助预测氯吡格雷治疗疗效的产品。本发明通过检测miRNA的表达量或相对表达量，结合临床、环境和遗传因素，能够准确预测氯吡格雷治疗疗效，即氯吡格雷抗血小板反应性。当氯吡格雷抗血小板反应性极差，调整抗血小板药物的剂量或用药的种类，达到有效治疗急性冠状动脉综合征的目的。

Description

miRNA表达量在预测氯吡格雷治疗疗效中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，具体涉及miRNA表达量在预测氯吡格雷治疗疗效中的应用。
背景技术
急性冠状动脉综合征(ACS)是以冠脉内血栓形成导致急性心肌缺血为特征的严重危害人类健康的常见心血管疾病。血小板ADP受体抑制剂联合阿司匹林抗血小板治疗是目前公认的ACS标准治疗和预防经皮冠脉介入(PCI)术后支架内血栓形成的金标准(NeumannFJ，Sousa-Uva M，Ahlsson A et al.2018 ESC/EACTS Guidelines on myocardialrevascularization.EUr Heart J.2019；40(2)：87-165)。尽管新型ADP受体抑制剂(如：替格瑞洛，普拉格雷)已问世，但由于出血风险更高，新药仍无法完全取代氯吡格雷在ACS和PCI术后患者中抗栓治疗的地位(中华医学会心血管病学分会，中华心血管病杂志编辑委员会.抗血小板治疗中国专家共识.中华心血管病杂志，2013；41(3)：183-94.)。然而，由于氯吡格雷抗血小板反应存在多样性，即使经过充分的抗血小板治疗，仍有近15％的高危ACS患者因高血小板反应性发生严重的心血管事件(Bonello L，Tantry US，Marcucci R，etal.Consensus and future directions on the definition of high on-treatmentplatelet reactivity to adenosine diphosphate.Journal of the American Collegeof Cardiology.2010；56(12)：919-933.)。因此，如何在临床预测氯吡格雷抗栓反应性差异，实现ACS患者个性化的抗血小板药物治疗，一直是心血管临床药理领域研究的热点和亟待解决的难题。
研究表明，除了药物相互作用、合并疾病等临床环境因素外，遗传因素很大程度上(遗传度为73％)影响了氯吡格雷的抗血小板反应性(Shuldiner AR，O′Connell JR，BlidenKP，et al.Association of cytochrome P450 2C 19 genotype with the antiplateleteffect and clinical efficacy of clopidogrel therapy.JAMA：the journal of theAmerican Medical Association.2009；302(8)：849-857.)。目前对氯吡格雷反应性和临床转归相关的药物基因组学研究发现，CYP2C19功能缺失型变异型与氯吡格雷抗血小板反应性密切相关，但是该变异型仅能解释约12％的反应性个体间差异，并且该变异型对ACS和PCI术后患者临床转归的预测能力十分有限。由此可知：单纯药物基因组学研究难以为氯吡格雷治疗患者提供充分的个体化用药信息，有必要探索新的生物标记物弥补药物基因组学研究中基因型、表型和疾病之间关联性的缺失。
近年来，对血小板的表观遗传学研究发现，血小板中除了信使RNA(mRNA)外，还含有丰富的非编码RNA，尤其是小RNA(microRNA)。microRNA作为转录后调控因子，可通过对靶基因mRNA 3’UTR区域的miRNA反应元件(miRNA response element，MRE)识别，诱导基因沉默复合物RISC的装配，进而调控多个靶基因的活性或稳定性。2011年，血小板内存在的microRNA-mRNA共表达谱首次被发现后，针对血小板microRNA的探索日渐升温。目前尚未发现与影响氯吡格雷的抗血小板反应性相关的血小板microRNAs。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为如何预测或辅助预测氯吡格雷治疗疗效，具体的为氯吡格雷抗血小板反应性。
为解决上述问题，本发明首先公开了检测miRNA表达量或相对表达量的系统在制备预测或辅助预测氯吡格雷治疗疗效的产品中的应用；
所述miRNA为miR-126、miR-223和miR-150中的三种、两种或一种。
上述应用中，所述miR-126是SEQ ID NO.1所示的RNA，所述miR-223为SEQ ID NO.2所示的RNA，所述miR-150为SEQ ID NO.3所示的RNA。
上述应用中，所述检测miRNA表达量或相对表达量的系统为利用荧光定量PCR检测所述miRNA表达量或相对表达量的系统。
上述应用中，所述miRNA表达量或相对表达量为血小板中miRNA的表达量或相对表达量。
上述应用中，所述系统可包括引物和/或试剂和/或试剂盒和/或仪器，具体的：
所述利用荧光定量PCR检测所述miRNA的表达量或相对表达量的系统为如下1)或2)或3)或4)：
1)用于扩增上述miRNA的引物；
2)包含1)的荧光定量PCR所需的试剂；
3)包含1)或2)的试剂盒；
4)荧光定量PCR所需的仪器。
上述应用中，所述检测miRNA表达量或相对表达量的系统包括检测miR-126表达量或相对表达量的系统、检测miR-223表达量或相对表达量的系统、检测miR-150表达量或相对表达量的系统中的一个、两个或三个单独或组合在一起的系统。
其中，所述检测miR-126表达量或相对表达量的系统可包括检测miR-126表达量或相对表达量的引物和/或试剂和/或试剂盒和/或仪器，如通过荧光定量PCR检测miR-126表达量或相对表达量所需的引物和/或试剂和/或试剂盒和/或仪器。
具体的，通过荧光定量PCR检测miR-126表达量或相对表达量的系统可以为：
1)用于扩增miR-126的引物；
2)包含1)的荧光定量PCR所需的试剂；
3)包含1)或2)的试剂盒；
4)荧光定量PCR所需的仪器。
其中，所述扩增miR-126的引物可为SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子。所述用于扩增miR-126的引物也可为由SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子和miRNA通用反向引物组成。所述miRNA通用反向引物可来源于商业试剂盒，如天根生化科技(北京)有限公司生产的miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒中提供的通用反向引物。所述用于扩增miR-126的引物和进行荧光定量PCR反应所需要的其它试剂均可独立包装。
所述检测miR-223表达量或相对表达量的系统可包括检测miR-223表达量或相对表达量的引物和/或试剂和/或试剂盒和/或仪器，如通过荧光定量PCR检测miR-223表达量或相对表达量所需的引物和/或试剂和/或试剂盒和/或仪器。
具体的，通过荧光定量PCR检测miR-223表达量或相对表达量的系统可以为：
1)用于扩增miR-223的引物；
2)包含1)的荧光定量PCR所需的试剂；
3)包含1)或2)的试剂盒；
4)荧光定量PCR所需的仪器。
其中，所述用于扩增miR-223的引物可为SEQ ID NO.5所示的单链DNA分子；所述用于扩增miR-223的引物也可为由SEQ ID NO.5所示的单链DNA分子和miRNA通用反向引物组成。所述miRNA通用反向引物可来源于商业试剂盒，如天根生化科技(北京)有限公司生产的miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒中提供的通用反向引物。所述用于扩增miR-223的引物和进行荧光定量PCR反应所需要的其它试剂均可独立包装。
所述检测miR-150表达量或相对表达量的系统可包括检测miR-150表达量或相对表达量的引物和/或试剂和/或试剂盒和/或仪器，如通过荧光定量PCR检测miR-150表达量或相对表达量所需的引物和/或试剂和/或试剂盒和/或仪器。
具体的，通过荧光定量PCR检测miR-150表达量或相对表达量的系统可以为：
1)用于扩增miR-150的引物；
2)包含上述引物的荧光定量PCR所需的试剂；
3)包含1)或2)的试剂盒；
4)荧光定量PCR所需的仪器。
其中，所述用于扩增miR-150的引物可为SEQ ID NO.6所示的单链DNA分子；所述用于扩增miR-150的引物也可为由SEQ ID NO.6所示的单链DNA分子和miRNA通用反向引物组成。所述miRNA通用反向引物可来源于商业试剂盒，如天根生化科技(北京)有限公司生产的miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒中提供的通用反向引物。所述用于扩增miR-150的引物和进行荧光定量PCR反应所需要的其它试剂均可独立包装。
上述应用中，所述检测miRNA表达量或相对表达量的系统还包括数据处理装置，所述数据处理装置用于将来自待测对象的所述miRNA表达量或相对表达量转换为所述待测对象的预测结果。
上述应用中，所述数据处理装置包括数据输入模块、数据比较模块和结论输出模块；所述数据输入模块用于将待测对象的所述miRNA表达量或相对表达量值输入；所述数据比较模块用于将待测对象的所述miRNA表达量或相对表达量值与特定数值进行比较；结论输出模块用于输出结论：若miR-223相对表达量高于0.68和/或miR-126相对表达量高于5.94和/或miR-150相对表达量低于0.99，预示氯吡格雷抗栓反应性极强，出血风险极高；若miR-223相对表达量低于0.34和/或miR-126相对表达量低于1.27和/或miR-150相对表达量高于1.60，预示氯吡格雷抗栓反应性极差，缺血风险极高。
上述应用中，所述待测对象为ACS患者。具体的为ACS中国患者，更具体的为服用氯吡格雷的ACS中国患者。
以上述miRNA作为标志物的预测或辅助预测氯吡格雷治疗疗效的系统在制备预测或辅助预测氯吡格雷治疗疗效的产品中的应用也在本发明的保护范围之内。
上述应用中，所述预测或辅助预测氯吡格雷治疗疗效的系统为上述检测miRNA表达量或相对表达量的系统。
本发明进一步提供了预测或辅助预测氯吡格雷治疗疗效的产品。
本发明预测或辅助预测氯吡格雷治疗疗效的产品为上述检测miRNA表达量或相对表达量的系统。
本发明中，所述氯吡格雷治疗疗效是以氯吡格雷抗血小板反应性为指标的氯吡格雷治疗疗效。
本发明中，所述miRNA的相对表达量值是所述miRNA相对于内参U6的表达量。
本发明通过检测miR-126、miR-223和/或miR-150中的表达量或相对表达量，结合临床、环境和遗传因素，能够准确预测ACS患者氯吡格雷抗血小板反应性。当氯吡格雷抗血小板反应性不佳(即血小板反应性极高，缺血风险极高)，再结合ACS患者缺血风险相关临床因素和药物代谢酶CYP2C19基因变异等因素的情况下，调整抗血小板药物的剂量或用药的种类，如增加氯吡格雷的用量或者更换为强效抗血小板药物(如替格瑞洛，普拉格雷)，达到有效治疗ACS的目的。
附图说明
图1为血小板源性microRNAs与氯吡格雷抗血小板反应性的相关性。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明发明人研究发现，血小板microRNAs能够影响氯吡格雷的抗血小板反应性，通过在健康志愿者中的筛查以及经氯吡格雷抗栓治疗的ACS患者中的验证，证实血小板中的miR-126(5′-UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG-3′)、miR-223(5′-UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA-3′)和miR-150(5′-UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG-3′)的表达水平与ACS患者中氯吡格雷抗血小板反应性密切相关。
实施例1 miR-223、miR-126和miR-150的表达水平与ACS患者中氯吡格雷抗血小板反应性的相关分析试验
一、病例收集及全血标本血小板采集
一)氯吡格雷稳定治疗的ACS病例的收集：
入选标准：自愿参加本项目并签署人类遗传学检测相关知情同意书，年龄在18周岁以上，经氯吡格雷抗栓治疗的ACS患者，能够提供外周血并用于基因组DNA提取的患者。为了减少人群分层的影响，所有患者均为中国汉族人，相互间无血缘关系及异族通婚史。总计募集了430例患者(病例基线见表1)。
排除标准：1.已知有抗血小板治疗禁忌症者；2.急、慢性炎症疾病者；3.应用非甾体类抗炎药、阿片类药物者；4.肝肾功能障碍，预期寿命小于1年者；5.近期有出血倾向、潜在出血危险或血液系统疾病者；6.近4周用过氯吡格雷、阿司匹林、普通肝素或低分子肝素者；7.近4周内有深部穿刺及大手术史者；8.其它危重疾病者。
血小板反应性呈极端值的病例收集：应用血栓弹力图法(TEG)在氯吡格雷稳定治疗3日后检测ADP诱导的血小板反应性(以TEG-MAADP值表示)。选择氯吡格雷治疗期间血小板反应性呈极端高值(HTPR)TEG-MAADP＞53mm，和血小板反应性呈极端低值(LTPR)TEG-MAADP＜8mm的病例各10例(病例基线见表1)，即分为血小板反应性呈极高值组(HTPR组)和血小板反应性呈极低值组(LTPR组)。
表1氯吡格雷稳定治疗的急性冠脉综合征(ACS)患者人群临床基线特征
Figure BDA0002354580860000061
二、全血血小板及其RNA提取：
一)血小板提取
取存于枸橼酸钠抗凝真空采血管中的外周血3ml。100g/min，室温，离心15min，用无RNA酶无菌枪头取上清700ul。2000g/min，室温，离心15min，弃上清，得沉淀。用去白细胞磁珠(DynabeadsTM CD45，Invitrogen，货号：11153D)处理管中沉淀后，室温，2000g/min，离心20min，弃上清，沉淀即为去白细胞的血小板。
二)血小板RNA提取
采用miRNeasy Serum/Plasma Kit试剂盒(QIAGEN，货号：217184)提取血小板中的总RNA，并利用Nano-Drop 2000测RNA核酸质量，记录RNA浓度及纯度。
三、利用荧光定量PCR法检测血小板microRNAs(miR-223，miR-126和miR-150)
一)逆转录
应用天根生化科技(北京)有限公司提供的miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR211-02)，对步骤二提取的血小板RNA进行逆转录，得到第一链cDNA。
其中，逆转录反应体系为：
Figure BDA0002354580860000071
逆转录反应条件如下：
反应温度 反应时间
42℃ 60min
95℃ 3min
二)合成荧光定量PCR反应的引物(由上海生工生物有限公司设计合成)。
miR-126
正向引物：5′-gcgcgTCGTACCGTGAGTAATAATGCG-3′(SEQ ID NO.4)
反向引物：为天根生化科技(北京)有限公司生产的miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒中提供通用反向引物。
miR-223
正向引物：5′-GCGCGCTGTCAGTTTGTCAAATACCCCA-3′(SEQ ID NO.5)
反向引物：为天根生化科技(北京)有限公司生产的miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒中提供通用反向引物。
miR-150
正向引物：5′-cgcTCTCCCAACCCTTGTACCAGTG-3′(SEQ ID NO.6)
反向引物：为天根生化科技(北京)有限公司生产的miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒中提供通用反向引物。
内参：U6
正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′
反向引物：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′
三)利用步骤二)的引物，以步骤二)的cDNA为模板，采用天根生化科技(北京)有限公司的miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green，货号：FP411)对microRNA-126、microRNA-223、microRNA-150和内参U6进行扩增(具体操作过程见说明书)，分别得到Ct值(cycle threshold)，通过公式：Ct值＝2-ΔΔCt(其中：ΔΔCt＝ΔCt(试验样品)-ΔCt(基准样品)，ΔCt(试验样品)＝Ct(试验样品，目的基因)-Ct(试验样品，内参基因)，ΔCt(基准样品)＝Ct(基准样品，目的基因)-Ct(基准样品，内参基因))，分别计算HTPR组和LTPR组的microRNA-126、microRNA-223、microRNA-150的相对表达量(即表达水平)，每个样本重复三次实验。
其中，荧光定量PCR的反应体系为：
Figure BDA0002354580860000081
荧光定量PCR的反应条件为：
Figure BDA0002354580860000082
利用两独立样本均数T检验分析microRNA-126、microRNA-223、microRNA-150在HTPR组和LTPR组ACS患者血小板中的相对表达量与氯吡格雷抗血小板反应性的相关性(p＜0.05为有意义)。
结果如表2和图1所示，结果表明HTPR组病例中血小板miR-223、miR-126的相对表达量显著低于LTPR组病例中血小板miR-223、miR-126的相对表达量；HTPR组病例中血小板miR-150的相对表达量显著高于LTPR组病例中血小板miR-150的相对表达量。
另外，从表和图中可以看出对于服用氯吡格雷抗栓治疗的ACS患者而言，当miR-223相对表达量低于0.34或miR-126相对表达量低于1.27或miR-150相对表达量高于1.60，预示着氯吡格雷抗栓反应性极差(即血小板反应性极高)，缺血风险极高，在结合ACS患者缺血风险相关临床因素、血小板反应性、药物代谢酶CYP2C19基因变异等因素的情况下，应该考虑将抗血小板药物氯吡格雷增量，或者更换为强效抗血小板药物如替格瑞洛，普拉格雷。
当miR-223相对表达量高于0.68或miR-126相对表达量高于5.94或miR-150相对表达量低于0.99，预示氯吡格雷抗栓反应性极强(血小板反应性极低)，出血风险极高，说明抗栓作用强，出血风险高，临床不一定停药，但应密切监测出血风险。
表2三种microRNA在HTPR组和LTPR组ACS患者血小板中的相对表达量
Figure BDA0002354580860000091
注：*p值为HTPR组和LTPR组每种microRNA相对表达量的比较
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军总医院
<120> miRNA表达量在预测氯吡格雷治疗疗效中的应用
<130> GNCFY200018
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ucguaccgug aguaauaaug cg 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ugucaguuug ucaaauaccc ca 22
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ucucccaacc cuuguaccag ug 22
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgcgtcgta ccgtgagtaa taatgcg 27
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcgcgctgtc agtttgtcaa atacccca 28
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgctctccca acccttgtac cagtg 25

Claims (10)

1.检测miRNA表达量或相对表达量的系统在制备预测或辅助预测氯吡格雷治疗疗效的产品中的应用；
所述miRNA为miR-126、miR-223和miR-150中的三种、两种或一种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测miRNA表达量或相对表达量的系统为利用荧光定量PCR检测所述miRNA表达量或相对表达量的系统。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述miRNA表达量或相对表达量为血小板中miRNA的表达量或相对表达量。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述利用荧光定量PCR检测所述miRNA的表达量或相对表达量的系统为如下1)或2)或3)或4)：
1)用于扩增权利要求1-3中任一所述的miRNA的引物；
2)含有1)的荧光定量PCR所需的试剂；
3)含有1)或2)的试剂盒；
4)荧光定量PCR所需的仪器。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：
所述扩增miR-126的引物由SEQ ID NO.4所示的单链DNA分子和miRNA通用反向引物组成；
所述扩增miR-223的引物由SEQ ID NO.5所示的单链DNA分子和miRNA通用反向引物组成；
所述扩增miR-150的引物由SEQ ID NO.6所示的单链DNA分子和miRNA通用反向引物组成。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述检测miRNA表达量或相对表达量的系统还包括数据处理装置，所述数据处理装置用于将来自待测对象的所述miRNA表达量或相对表达量转换为所述待测对象的预测结果。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述待测对象为急性冠状动脉综合征患者。
8.以权利要求1中所述miRNA作为标志物的预测或辅助预测氯吡格雷治疗疗效的系统在制备预测或辅助预测氯吡格雷治疗疗效的产品中的应用；所述预测或辅助预测氯吡格雷治疗疗效的系统为权利要求1-7中任一所述的检测miRNA表达量或相对表达量的系统。
9.预测或辅助预测氯吡格雷治疗疗效的产品，其特征在于：所述产品为权利要求1-7中任一所述的检测miRNA表达量或相对表达量的系统。
10.权利要求1-8任一所述的应用，或权利要求9所述的产品，其特征在于：所述氯吡格雷治疗疗效是以氯吡格雷抗血小板反应性为指标的氯吡格雷治疗疗效。
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