CN105316341B - 一种LncRNA及其在作为前列腺癌检测标记物或前列腺癌预后复发标记物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种LncRNA及其在作为前列腺癌检测标记物或前列腺癌预后复发标记物中的应用。该LncRNA为以下核酸分子中的至少一种:(1)Linc00657、SNHG15、FTX、MIR17HG、COLCA1;(2)与该LncRNA具有90%及以上同源性的核酸分子。本发明首次发现该LncRNA在前列腺正常组织或癌旁组织中不表达或表达量很低,而在前列腺癌组织中存在超过正常组织或者癌旁组织两倍以上的表达,因此能够作为前列腺癌检测标记物、前列腺癌临床分期标记物或前列腺癌预后复发标记物;辅助判断前列腺癌发生情况、前列腺癌肿瘤大小或前列腺癌预后复发的情况,具有检出谱系广、灵敏度高、检测成本低等特点。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种LncRNA及其在作为前列腺癌检测标记物或前列腺癌预后复发标记物中的应用。
背景技术
人体中编码蛋白质的基因大约有2-3万个,仅占人类基因组的2%,其余98%不编码蛋白质的基因组DNA最初被认为是没有功能的,是生物体中的垃圾,通常被称为“垃圾DNA”。
但目前的研究表明,这些垃圾DNA大多可转录产生非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)。根据成熟转录本大小的不同,ncRNA可分为小分子ncRNA(如siRNA,miRNA,piRNA等),中等长度ncRNA(70-200nt)和长ncRNA(long ncRNA,LncRNA,>200nt)。
目前,ncRNA领域研究较多的是小分子ncRNA,而对LncRNA的研究还处于起步阶段。由于序列内部存在过多的终止密码子,LncRNA不能被翻译成蛋白质,他们通常是以RNA转录本的形式行使其生物学功能,如发育过程中的细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡和类固醇代谢等。
最近的研究发现LncRNA与肺癌、非霍杰金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等肿瘤疾病有关。这表明LncRNA与细胞的癌变有着极为密切的联系,LncRNA在细胞增殖、分化和癌变中发挥着重要的作用。
前列腺癌是男性生殖系最常见的恶性肿瘤,发病率随年龄增大而增长,在欧美地区发病率较高,在男性中是仅次于肺癌的第二大常见癌症死亡率。我国随着人口老龄化,近年来前列腺癌发病率有所增加。然而前列腺癌的病理检出率和经验临床上的发病率有很大差异,目前还没有一种有效的办法来指导前列腺癌的复发。
而发现前列腺癌预后复发相关LncRNA可能会对前列腺癌预后复发的诊断及基因治疗具有重要的临床指导意义。
发明内容
本发明提供了一种LncRNA,该LncRNA的异常表达与前列腺癌发生相关,能够作为前列腺癌检测标记物或前列腺癌预后复发标记物。
一种LncRNA,为以下核酸分子中的至少一种:
(1)cDNA序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ IDNo.5所示的核酸分子(依次为Linc00657、SNHG15、FTX、MIR17HG、COLCA1);
(2)与cDNA序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQID No.5所示核酸分子具有90%及以上同源性的核酸分子。
本发明发现,Linc00657(其cDNA序列如SEQ ID No.1)、SNHG15(其cDNA序列如SEQID No.2)、FTX(其cDNA序列如SEQ ID No.3)、MIR17HG(其cDNA序列如SEQ ID No.4)和COLCA1(其cDNA序列如SEQ ID No.5)这五个LncRNA分子在前列腺正常组织或者癌旁组织中不表达或表达量很低,在前列腺癌组织中的表达量显著提高;因此能够作为前列腺癌检测标记物,成为检测前列腺癌的辅助检测手段。
因此,本发明还提供了所述LncRNA在作为前列腺癌检测标记物中的应用。
其次,与预后的前列腺癌组织相比,这五个LncRNA分子在预后复发的前列腺癌组织中存在显著高表达;因此这五个LncRNA分子也能够作为前列腺癌组织预后复发标记物,成为诊断前列腺癌预后复发的辅助检测手段。
因此,本发明还提供了所述LncRNA在作为前列腺癌预后复发标记物中的应用。
同时,这五个LncRNA分子在T1期前列腺癌组织和T2期前列腺癌组织中也存在差异表达,体现为SNHG15、FTX、MIR17HG、COLCA1在T2期前列腺癌组织中高表达,而Linc00657则在T1期前列腺癌组织中高表达;因此这五个LncRNA分子还能够作为前列腺癌临床分期的指标,成为诊断前列腺癌临床分期的辅助检测手段。
因此,本发明还提供了所述LncRNA在作为前列腺癌临床分期指标中的应用。
RNA的人工合成成本较高,因此本发明还提供了所述LncRNA的编码序列;以及含有所述编码序列的载体。所述载体可以是表达单元、重组载体或者转化子。
进一步地,本发明还提供了所述LncRNA在制备用于检测前列腺癌的制剂、芯片或试剂盒中的应用;所述LncRNA在制备用于诊断前列腺癌临床分期的制剂、芯片或试剂盒中的应用;以及所述LncRNA在制备用于诊断前列腺癌预后复发的制剂、试剂盒或芯片中的应用。
利用所述制剂、试剂盒或芯片检测被试样品和对照样品中所述LncRNA的表达水平,通过对被试样品和对照样品中LncRNA表达水平进行比较分析可以辅助判断是否存在前列腺癌或辅助判断前列腺癌预后复发的情况:
若被试样品的LncRNA表达水平显著提高、超过对照样品中LncRNA表达水平的两倍以上,且p值显示有显著性差异,则可以初步判断为存在罹患前列腺癌的风险或存在前列腺癌预后复发的风险,罹患前列腺癌或前列腺癌预后复发可能性大。
同时,还可用于辅助判断前列腺癌的临床分期:
若被试样品中,SNHG15、FTX、MIR17HG、COLCA1的表达水平显著提高或/和Linc00657的表达水平显著降低,则预示患者所患的前列腺癌极有可能发展到了临床原发性肿瘤T2期。
可供检测的样品可以是分离的体液、淋巴结样本或组织样本,其中体液可以是血清、血浆、组织液、口腔唾液、尿液等。可采用的检测手段包括核酸杂交法(如芯片杂交、Northern杂交、原位杂交)、PCR扩增法(如荧光实时定量PCR法)。
为便于采用核酸杂交法进行检测,本发明还提供了一种用于检测所述LncRNA的特异性探针。本发明具体提供了一种LNA(locked nucleic acid)探针,该LNA探针为以下第(Ⅵ)类、第(Ⅶ)类、第(Ⅷ)类、第(Ⅸ)类和第(Ⅹ)类中的至少一类:
其中,第(Ⅵ)类,选自(Ⅵ-1):5’-AACCTTCTTCTCTTCCTTCTCAGGTCT-3’,或(Ⅵ-2):5’-AAGTTTTCCTACG+A+ATTTCAACACAAA-3’,其中,序列中斜体加粗的碱基是LNA碱基(下同);用于检测Linc00657或与Linc00657具有90%及以上同源性的核酸分子;
第(Ⅶ)类选自(Ⅶ-1):5’-CAGTAAGCTCTTCCACTTTGAGACCGT-3’,或(Ⅶ-2):5’-CCCCTCTAGCTCCAGCATCTTGGGATT-3’,用于检测SNHG15或与SNHG15具有90%及以上同源性的核酸分子;
第(Ⅷ)类选自(Ⅷ-1):5’-AATGTTGCTCTTGACCAATGACAAGTT-3’,或(Ⅷ-2):5’-TGGCTTACACTACACTTTATGCCAAAT-3’,用于检测FTX或与FTX具有90%及以上同源性的核酸分子;
第(Ⅸ)类选自(Ⅸ-1):5’-TGAGTTGTTCTCCAGGAAGTTGCAGGC-3’,或(Ⅸ-2):5’-CTCGTTCTGGACAATTTCTTAACAGCT-3’,用于检测MIR17HG或与MIR17HG具有90%及以上同源性的核酸分子;
第(Ⅹ)类选自(Ⅹ-1):5’-TGTGTTTCCCTCTGTATTTGACACATT-3’,或(Ⅹ-2):5’-TTAATATGCCTGTGCCTTAGTTGAATA-3’,用于检测COLCA1或与COLCA1具有90%及以上同源性的核酸分子。
进一步地,本发明还提供了一种用于检测前列腺癌、诊断前列腺癌肿瘤大小或诊断前列腺癌预后复发的芯片,该芯片中含有所述特异性探针。
所述芯片一般包括固相载体,该固相载体上有序地固定有所述特异性探针,该特异性探针特异性地对应于所述LncRNA的全部或部分序列。
为便于采用PCR扩增法进行检测,本发明还提供了一种用于检测所述LncRNA的特异性引物。
所述特异性引物选自以下第(Ⅰ)类、第(Ⅱ)类、第(Ⅲ)类、第(Ⅳ)类和第(Ⅴ)类中的至少一类:其中,第(Ⅰ)类用于检测Linc00657或与Linc00657具有90%及以上同源性的核酸分子,选自以下引物对中的其中一对:
(Ⅰ-1)上游引物:如SEQ ID No.6;下游引物:如SEQ ID No.7;
(Ⅰ-2)上游引物:如SEQ ID No.8;下游引物:如SEQ ID No.9;
(Ⅰ-3)上游引物:如SEQ ID No.10;下游引物:如SEQ ID No.11;
(Ⅰ-4)上游引物:如SEQ ID No.12;下游引物:如SEQ ID No.13;
第(Ⅱ)类用于检测SNHG15或与SNHG15具有90%及以上同源性的核酸分子,选自以下引物对中的其中一对:
(Ⅱ-1)上游引物:如SEQ ID No.14;下游引物:如SEQ ID No.15;
(Ⅱ-2)上游引物:如SEQ ID No.16;下游引物:如SEQ ID No.17;
(Ⅱ-3)上游引物:如SEQ ID No.18;下游引物:如SEQ ID No.19;
(Ⅱ-4)上游引物:如SEQ ID No.20;下游引物:如SEQ ID No.21;
第(Ⅲ)类用于检测FTX或与FTX具有90%及以上同源性的核酸分子,选自以下引物对中的其中一对:
(Ⅲ-1)上游引物:如SEQ ID No.22;下游引物:如SEQ ID No.23;
(Ⅲ-2)上游引物:如SEQ ID No.24下游引物:如SEQ ID No.25;
(Ⅲ-3)上游引物:如SEQ ID No.26;下游引物:如SEQ ID No.27;
(Ⅲ-4)上游引物:如SEQ ID No.28;下游引物:如SEQ ID No.29;
第(Ⅳ)类用于检测MIR17HG或与MIR17HG具有90%及以上同源性的核酸分子,选自以下引物对中的其中一对:
(Ⅳ-1)上游引物:如SEQ ID No.30;下游引物:如SEQ ID No.31;
(Ⅳ-2)上游引物:如SEQ ID No.32;下游引物:如SEQ ID No.33;
(Ⅳ-3)上游引物:如SEQ ID No.34;下游引物:如SEQ ID No.35;
(Ⅳ-4)上游引物:如SEQ ID No.36;下游引物:如SEQ ID No.37;
第(Ⅴ)类用于检测COLCA1或与COLCA1具有90%及以上同源性的核酸分子,选自以下引物对中的其中一对:
(Ⅴ-1)上游引物:如SEQ ID No.38;下游引物:如SEQ ID No.39;
(Ⅴ-2)上游引物:如SEQ ID No.40;下游引物:如SEQ ID No.41;
(Ⅴ-3)上游引物:如SEQ ID No.42;下游引物:如SEQ ID No.43;
(Ⅴ-4)上游引物:如SEQ ID No.44;下游引物:如SEQ ID No.45。
进一步地,本发明还提供了一种用于检测前列腺癌、诊断前列腺癌肿瘤大小或诊断前列腺癌预后复发的试剂盒,该试剂盒中含有所述芯片;或者含有所述特异性引物。
作为优选,所述试剂盒还含有所述特异性引物的试剂盒中还含有逆转录酶及其反应缓冲液、四种脱氧核糖核苷酸底物、DNA聚合酶、荧光定量PCR反应缓冲液、人工合成的内参以及阴性对照(即正常人对照品)。上述的LNA探针既可以固载于固相载体上制成芯片,还可以在LNA探针的5’端设置常规的报告荧光基团、在3’端设置常规的淬灭荧光基团,用于上述试剂盒中。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
(1)本发明首次发现Linc00657、SNHG15、FTX、MIR17HG和COLCA1这五个LncRNA分子在前列腺正常组织或者癌旁组织中不表达或表达量很低,在前列腺癌组织中存在超过正常组织或者癌旁组织两倍以上的表达,因此能够作为前列腺癌检测标记物,成为检测前列腺癌的辅助检测手段;其次,与预后的前列腺癌组织相比,这五个LncRNA分子在预后复发的前列腺癌组织中存在显著高表达;因此这五个LncRNA分子也能够作为前列腺癌组织预后复发标记物,成为诊断前列腺癌预后复发的辅助检测手段;同时,这五个LncRNA分子在T1期前列腺癌组织和T2期前列腺癌组织中也存在差异表达,体现为SNHG15、FTX、MIR17HG、COLCA1在T2期前列腺癌组织中高表达,而Linc00657则在T1期前列腺癌组织中高表达;因此这五个LncRNA分子还能够作为前列腺癌临床分期的指标,成为诊断前列腺癌临床分期的辅助检测手段。
(2)采用一组LncRNA分子作为前列腺癌预后复发标记物,将改进单一的标记物所难以克服的个体差异性高、检测灵敏性低的问题,具有检出谱系广、灵敏度高、检测成本低等优点,既可以单一看预后风险大小,也可以联合LncRNA分子看预后复发可能,可有效提高前列腺病人预后效果评价从而指导临床治疗。
附图说明
图1为五种LncRNA分子在前列腺癌组织中异常表达情况与年龄的相关性;
其中,Proportion of genes(%)表示基因表达百分比,Age<61表示年龄小于61,Age>=61表示年龄大于等于61;下同;
图2为五种LncRNA分子在前列腺癌组织中异常表达情况与肿瘤大小的相关性;
其中,Clinical Primary Tumor T1Stage表示临床原发性肿瘤T1期,ClinicalPrimary Tumor T2Stage表示临床原发性肿瘤T2期;
图3为五种LncRNA分子在复发前和复发后前列腺癌组织中表达水平的差异性;
其中,Relative Quantification表示相对表达量;recurrence表示复发,norecurrence表示未复发;
图4为供试的486例患者中五种LncRNA分子的表达情况;
图5为五种LncRNA分子预测前列腺癌病人预后复发的准确性。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的详细说明。下述实施例中未注明具体条件的试验方法,即是按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件进行的。
实施例1 LncRNA在前列腺癌组织中的表达的定量分析与患病年龄之间的关系
在数据库网站http://www.cbioportal.org/中,对前列腺癌组织和前列腺癌旁组织样本病理信息按照“MutationsPutative copy-number alterations from GISTICmRNA Expression z-Scores (RNA Seq V2RSEM)”进行筛选,获得499例前列腺癌样本的完整的病理信息,如下表1:
表1前列腺癌及癌旁组织病人的临床病理信息
按499例前列腺癌样本病理信息中的患病年龄,将前列腺癌样本分为三个年龄组(<61,≥61,未知),取低年龄组(<61)的100例样本和高年龄组(≥61)的116例样本,对两组样本中已被HUGO gene nomenclature committee(http://www.genenames.org/)认可的2,530种LncRNA分子进行分析,获得五个在低年龄组和高年龄组中存在明显表达差异的LncRNA分子,分析结果见图1。
从图1可见,LINC00657,SNHG15,FTX,MIR17HG在高年龄组表达的比例高于低年龄组表达,分别高于60%,40%,20%和60%,而COLCA1在高年龄组表达的水平和低年龄组表达水平相当。说明LINC00657,SNHG15,FTX,MIR17HG随着年龄增长表达量也增加。这也符合随着人类逐步老年化,前列腺癌的病人在近年激剧增加的社会现象。
实施例2 LncRNA在前列腺癌组织中的表达在病理分级上测序结果分析
根据TCGA肿瘤数据库,对实施例1中筛选出来的已对前列腺癌的样本进行RNA测序的499例样本进行分析,分析根据http://www.genenames.org/中认可的2,530种LncRNA进行,考察肿瘤大小为T1期(86例)和T2(67例)的前列腺癌样本中LncRNA表达情况,考察结果见图2。
由图2可见,COLCA1、SNHG15、FTX、MIR17HG这四种lncRNA分子在前列腺癌T1期的表达比例比T2期低20%、60%、20%和40%,而LINC00657在前列腺癌T1期的表达比例比T2期显著高1.2倍。
这5种LncRNA分子尤其是其中的COLCA1、SNHG15、FTX、MIR17HG,可以作为前列腺癌临床分期的指标。
实施例3 LncRNA在复发与未复发的前列腺癌组织中的表达水平差异性
分析表1中前列腺癌样本的预后情况发现,有9例出现预后复发,分别是:TCGA-EJ-5524、TCGA-EJ-5525、TCGA-EJ-5526、TCGA-CH-5791、TCGA-M7-A724、TCGA-J4-A67N、TCGA-CH-5751、TCGA-G9-6332、TCGA-CH-5743,其余490例均未复发。
根据499例前列腺样本的高通量测序结果,对复发与未复发病例中目标LncRNA的表达量进行分析,发现COLCA1(RQ=1.785),LINC00657(RQ=1.218)、SNHG15(RQ=1.072)、FTX(RQ=1.198)和MIR17HG(RQ=1.382)在前列腺癌复发病例中都显著高表达,因此根据这五种LncRNA在前列腺癌组织中的表达情况可明显预测预后复发病人,可更好地指导前列腺癌预后的临床治疗。
实施例4 LncRNA预测前列腺癌病人预后复发的准确性
以表1中带有mRNA表达数据的487个前列腺癌样本为分析对象,以正常前列腺组织或癌旁组织样本作为对照,分析这487个前列腺癌样本(486个病人)中五种LncRNA分子(COLCA1、SNHG15、FTX、MIR17HG、LINC00657)的表达情况,结果如图4所述。
由图4可见,在486个病人中,COLCA1表达量高的病人有6%,SNHG15达量高的病人有5%,FTX表达量高的病人有4%,MIR17HG表达量高的病人有5%,LINC00657表达量高的有5%。
并按照五种LncRNA分子的表达情况是否达到“LINC00657:EXP>2.0,SNHG15:EXP>2.0,FTX:EXP>2.0,MIR17HG:EXP>2.0,COLCA1:EXP>2.0”(即五种LncRNA分子在前列腺癌样本中的表达量达到正常前列腺组织或癌旁组织样本中表达量的2倍以上),将487个前列腺癌样本分为两类,一类为复发病人(如图5中a线),一类为生存病人数(如图5中b线)。
五种LncRNA单一评价出的复发病人数占总复发病人数(如实施例3中的9个)的百分比分别是:SNHG1528.6%(即SNHG15:EXP>2.0的前列腺癌样本数占9个复发病人数的百分比,下同)、FTX 28.6%、MIR17HG 28.6%、LINC0065750%、COLCA128.6%。
进一步地,在487个前列腺癌病人样本中筛选5种LncRNA的表达量均在2.0以上的前列腺癌病人样本,可检测出9个复发病人中的8个,并且这8个病人复发后均死亡。可见采用这5个LncRNA分子作为前列腺癌预后复发标记物,可以预测出的前列腺癌病人预后复发病人数占总复发病人数的88.9%,检出率高,且灵敏度高。
实施例5用于检测前列腺癌、诊断前列腺癌肿瘤大小或前列腺癌预后复发的实时荧光定量试剂盒
用于检测前列腺癌、诊断前列腺癌肿瘤大小或诊断前列腺癌预后复发的实时荧光定量试剂盒,包括以下成分:
(1)逆转录酶及其反应缓冲液;其中,缓冲液成分及浓度如下:1M Tris(pH 8.5),10mM;1M HCl,2.94mM;1M KCl,50mM;1M MgCl2,2.5mM;10mM dNTP,200μM;50×ROX,0.02×;ddH2O;
(2)LncRNA的逆转录引物:六碱基随机逆转录引物;
(3)PCR扩增引物组合:包括用于检测Linc00657的引物对、用于检测SNHG15的引物对、用于检测FTX的引物对、用于检测MIR17HG的引物对和用于检测COLCA1的引物对;
其中,用于检测Linc00657的引物对选自:
(Ⅰ-1)上游引物:如SEQ ID No.6;下游引物:如SEQ ID No.7;
(Ⅰ-2)上游引物:如SEQ ID No.8;下游引物:如SEQ ID No.9;
(Ⅰ-3)上游引物:如SEQ ID No.10;下游引物:如SEQ ID No.11;
或者,(Ⅰ-4)上游引物:如SEQ ID No.12;下游引物:如SEQ ID No.13;
用于检测SNHG15的引物对选自:
(Ⅱ-1)上游引物:如SEQ ID No.14;下游引物:如SEQ ID No.15;
(Ⅱ-2)上游引物:如SEQ ID No.16;下游引物:如SEQ ID No.17;
(Ⅱ-3)上游引物:如SEQ ID No.18;下游引物:如SEQ ID No.19;
或者,(Ⅱ-4)上游引物:如SEQ ID No.20;下游引物:如SEQ ID No.21;
用于检测FTX的引物对选自:
(Ⅲ-1)上游引物:如SEQ ID No.22;下游引物:如SEQ ID No.23;
(Ⅲ-2)上游引物:如SEQ ID No.24下游引物:如SEQ ID No.25;
(Ⅲ-3)上游引物:如SEQ ID No.26;下游引物:如SEQ ID No.27;
或者,(Ⅲ-4)上游引物:如SEQ ID No.28;下游引物:如SEQ ID No.29;
用于检测MIR17HG的引物选自:
(Ⅳ-1)上游引物:如SEQ ID No.30;下游引物:如SEQ ID No.31;
(Ⅳ-2)上游引物:如SEQ ID No.32;下游引物:如SEQ ID No.33;
(Ⅳ-3)上游引物:如SEQ ID No.34;下游引物:如SEQ ID No.35;
或者,(Ⅳ-4)上游引物:如SEQ ID No.36;下游引物:如SEQ ID No.37;
用于检测COLCA1的引物对选自:
(Ⅴ-1)上游引物:如SEQ ID No.38;下游引物:如SEQ ID No.39;
(Ⅴ-2)上游引物:如SEQ ID No.40;下游引物:如SEQ ID No.41;
(Ⅴ-3)上游引物:如SEQ ID No.42;下游引物:如SEQ ID No.43;
或者,(Ⅴ-4)上游引物:如SEQ ID No.44;下游引物:如SEQ ID No.45;
(4)DNA聚合酶;
(5)荧光定量PCR反应缓冲液(10.0μl),其组成为:2×SYBR,5.0μl;Primer F(10μM),0.5μl;Primer R(10μM),0.5μl;cDNA Template(稀释10-20倍),1.0μl;RNase-freeWater,3.0μl;
(6)内参;(7)阴性对照;(8)试剂盒使用说明书。
利用上述实时荧光定量试剂盒检测前列腺癌、诊断前列腺癌肿瘤大小或者诊断前列腺癌预后复发的方法包括:
(1)采集患者离体样本,提取总RNA;
(2)对总RNA进行逆转录,获得cDNA;
(3)利用上述PCR扩增引物组合对cDNA进行扩增,检测扩增产物中Linc00657、SNHG15、FTX、MIR17HG、COLCA1的表达水平;
扩增程序为:95℃,3minutes;95℃,10s;60℃,30s;39个循环;
(4)比较被测样本和阴性对照中五种LncRNA分子表达水平的差异,根据比较结果判定患者是否存在罹患前列腺癌风险,或者是否存在前列腺癌预后复发风险,或者判定前列腺癌所处临床分期:
若与阴性对照相比,被测样本中相应的LncRNA分子表达水平有表达且表达量超过阴性对照的2倍以上,说明罹患前列腺癌的可能性较大,或者前列腺癌预后复发的可能性大;
若与前阶段所采数据相比,被测样本SNHG15、FTX、MIR17HG、COLCA1的表达水平显著提高或/和Linc00657的表达水平显著降低,则预示患者所患的前列腺癌极有可能发展到临床原发性肿瘤T2期。
Claims (10)
1.LncRNA在制备用于诊断前列腺癌肿瘤大小的制剂、芯片或试剂盒中的应用,其特征在于,所述LncRNA为以下核酸分子:
cDNA序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示的核酸分子。
2.一种用于检测诊断前列腺癌肿瘤大小的芯片,其特征在于,所述芯片中含有用于检测LncRNA的特异性探针,所述LncRNA为以下核酸分子:
cDNA序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的芯片,其特征在于,所述特异性探针为LNA探针,该LNA探针为以下第(Ⅵ)类、第(Ⅶ)类、第(Ⅷ)类、第(Ⅸ)类和第(Ⅹ)类中的至少一类:
其中,第(Ⅵ)类,选自(Ⅵ-1):5’-AACCTTCTTCTCTTCCTTCTCAGGTCT-3’,或(Ⅵ-2):5’-AAGTTTTCCTACG+A+ATTTCAACACAAA-3’,用于检测SEQ ID No.1;
第(Ⅶ)类选自(Ⅶ-1):5’-CAGTAAGCTCTTCCACTTTGAGACCGT-3’,或(Ⅶ-2):5’-CCCCTCTAGCTCCAGCATCTTGGGATT-3’,用于检测SEQ ID No.2;
第(Ⅷ)类选自(Ⅷ-1):5’-AATGTTGCTCTTGACCAATGACAAGTT-3’,或(Ⅷ-2):5’-TGGCTTACACTACACTTTATGCCAAAT-3’,用于检测SEQ ID No.3;
第(Ⅸ)类选自(Ⅸ-1):5’-TGAGTTGTTCTCCAGGAAGTTGCAGGC-3’,或(Ⅸ-2):5’-CTCGTTCTGGACAATTTCTTAACAGCT-3’,用于检测SEQ ID No.4;
第(Ⅹ)类选自(Ⅹ-1):5’-TGTGTTTCCCTCTGTATTTGACACATT-3’,或(Ⅹ-2):5’-TTAATATGCCTGTGCCTTAGTTGAATA-3’,用于检测SEQ ID No.5。
4.根据权利要求3所述的芯片,其特征在于,所述LNA探针的5’端设置有报告荧光基团、在3’端设置有淬灭荧光基团。
5.根据权利要求2至4之一所述的芯片,其特征在于,所述芯片为固相载体。
6.一种用于诊断前列腺癌肿瘤大小的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中含有用于检测LncRNA的特异性引物;或者,含有用于检测LncRNA的芯片,所述芯片含有用于检测LncRNA的特异性探针;
所述LncRNA为以下核酸分子:
cDNA序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示的核酸分子。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述特异性引物选自以下第(Ⅰ)类、第(Ⅱ)类、第(Ⅲ)类、第(Ⅳ)类和第(Ⅴ)类中的至少一类:
其中,第(Ⅰ)类选自以下引物对中的其中一对:
(Ⅰ-1)上游引物:如SEQIDNo.6;下游引物:如SEQIDNo.7;
(Ⅰ-2)上游引物:如SEQIDNo.8;下游引物:如SEQIDNo.9;
(Ⅰ-3)上游引物:如SEQIDNo.10;下游引物:如SEQIDNo.11;
(Ⅰ-4)上游引物:如SEQIDNo.12;下游引物:如SEQIDNo.13;
第(Ⅱ)类选自以下引物对中的其中一对:
(Ⅱ-1)上游引物:如SEQIDNo.14;下游引物:如SEQIDNo.15;
(Ⅱ-2)上游引物:如SEQIDNo.16;下游引物:如SEQIDNo.17;
(Ⅱ-3)上游引物:如SEQIDNo.18;下游引物:如SEQIDNo.19;
(Ⅱ-4)上游引物:如SEQIDNo.20;下游引物:如SEQIDNo.21;
第(Ⅲ)类选自以下引物对中的其中一对:
(Ⅲ-1)上游引物:如SEQIDNo.22;下游引物:如SEQIDNo.23;
(Ⅲ-2)上游引物:如SEQIDNo.24下游引物:如SEQIDNo.25;
(Ⅲ-3)上游引物:如SEQIDNo.26;下游引物:如SEQIDNo.27;
(Ⅲ-4)上游引物:如SEQIDNo.28;下游引物:如SEQIDNo.29;
第(Ⅳ)类选自以下引物对中的其中一对:
(Ⅳ-1)上游引物:如SEQIDNo.30;下游引物:如SEQIDNo.31;
(Ⅳ-2)上游引物:如SEQIDNo.32;下游引物:如SEQIDNo.33;
(Ⅳ-3)上游引物:如SEQIDNo.34;下游引物:如SEQIDNo.35;
(Ⅳ-4)上游引物:如SEQIDNo.36;下游引物:如SEQIDNo.37;
第(Ⅴ)类选自以下引物对中的其中一对:
(Ⅴ-1)上游引物:如SEQIDNo.38;下游引物:如SEQIDNo.39;
(Ⅴ-2)上游引物:如SEQIDNo.40;下游引物:如SEQIDNo.41;
(Ⅴ-3)上游引物:如SEQIDNo.42;下游引物:如SEQIDNo.43;
(Ⅴ-4)上游引物:如SEQIDNo.44;下游引物:如SEQIDNo.45。
8.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述特异性探针为LNA探针,该LNA探针为以下第(Ⅵ)类、第(Ⅶ)类、第(Ⅷ)类、第(Ⅸ)类和第(Ⅹ)类中的至少一类:
其中,第(Ⅵ)类,选自(Ⅵ-1):5’-AACCTTCTTCTCTTCCTTCTCAGGTCT-3’,或(Ⅵ-2):5’-AAGTTTTCCTACG+A+ATTTCAACACAAA-3’,用于检测SEQ ID No.1;
第(Ⅶ)类选自(Ⅶ-1):5’-CAGTAAGCTCTTCCACTTTGAGACCGT-3’,或(Ⅶ-2):5’-CCCCTCTAGCTCCAGCATCTTGGGATT-3’,用于检测SEQ ID No.2;
第(Ⅷ)类选自(Ⅷ-1):5’-AATGTTGCTCTTGACCAATGACAAGTT-3’,或(Ⅷ-2):5’-TGGCTTACACTACACTTTATGCCAAAT-3’,用于检测SEQ ID No.3;
第(Ⅸ)类选自(Ⅸ-1):5’-TGAGTTGTTCTCCAGGAAGTTGCAGGC-3’,或(Ⅸ-2):5’-CTCGTTCTGGACAATTTCTTAACAGCT-3’,用于检测SEQ ID No.4;
第(Ⅹ)类选自(Ⅹ-1):5’-TGTGTTTCCCTCTGTATTTGACACATT-3’,或(Ⅹ-2):5’-TTAATATGCCTGTGCCTTAGTTGAATA-3’,用于检测SEQ ID No.5。
9.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒为实时荧光定量试剂盒。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还含有逆转录酶及其反应缓冲液、四种脱氧核糖核苷酸底物、DNA聚合酶、荧光定量PCR反应缓冲液、人工合成的内参以及阴性对照。
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