CN103146688B

CN103146688B - 长链非编码rna作为疾病诊断血液分子标志物的应用

Info

Publication number: CN103146688B
Application number: CN201210337606.5A
Authority: CN
Inventors: 孙颖浩; 任善成; 王富博; 沈剑
Original assignee: Shanghai Changhai Hospital
Current assignee: Shanghai Changhai Hospital
Priority date: 2012-09-12
Filing date: 2012-09-12
Publication date: 2015-05-13
Anticipated expiration: 2032-09-12
Also published as: CN103146688A

Abstract

本发明涉及长链非编码RNA作为疾病诊断血液分子标志物的应用。具体地，本发明人成功分离并检测了人或非人哺乳动物血液中长链非编码的RNA（lncRNA）；人或非人哺乳动物的血液中的长链非编码的RNA是以表达丰度不同的片段稳定存在的；血液中来源于lncRNA MALAT-1的短链RNA（命名为MD-miniRNA）来源于前列腺癌（Prostate cancer,PCa）细胞，并分泌释放入血；体外培养的PCa细胞能分泌MD-miniRNA，并释放到培养液中；在移植瘤小鼠血浆中能检测到MD-miniRNA的高表达。此外，MD-miniRNA的表达与PCa的发病呈现正相关，MD-miniRNA对区分前列腺穿刺阳性和阴性病人的敏感性和特异性都分别高达40%以上和80%以上。因此，MD-miniRNA是一种新型的癌症（尤其是前列腺癌）血液分子诊断标记物，能显著提高诊断的准确性。

Description

长链非编码RNA作为疾病诊断血液分子标志物的应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地，本发明涉及长链非编码RNA作为疾病诊断血液分子标志物的应用。

背景技术

癌症是目前威胁人类生存、影响健康的最主要疾病。前列腺癌（Prostate cancer,PCa)是发达国家发病率最高的男性恶性实体肿瘤之一，占全球癌死亡率第6位。我国前列腺癌的发病率近年来一直处于显著的上升趋势。在北京、上海、广州等医学、经济发达城市，前列腺癌发病率已位于当地十大常见肿瘤之列。来自上海市疾病控制中心的资料显示，前列腺癌的发病率自2002年起已跃居男性泌尿生殖系恶性肿瘤的首位。流行病学数据还显示，中国前列腺癌发病率已从1993年的1.71/10万男性人口增加到2005年的7.9/10万男性人口，年增幅13%。依次推算，预计至2020年，我国前列腺癌发病率将超过40/10万人口男性，接近欧美国家水平，成为危害男性健康的主要肿瘤“杀手”。

早期前列腺癌局限于包膜内，但当肿瘤扩散到包膜外或远处转移时，肿瘤的治疗就显得相当困难，且预后效果很差。因此，前列腺癌的早期诊断就显得尤为重要。前列腺特异性抗原（Prostate specific antigen，PSA）作为目前诊断前列腺癌最为公认、应用最为广泛的分子诊断标记物，在目前前列腺癌的诊断方面起着极为重要的作用，但它在明显提高肿瘤诊断率的同时也有着越来越大的局限性。例如，PSA处于正常范围（<4.0ng/ml），前列腺穿刺阳性率为15.2%；在PSA的诊断灰区（4-10ng/ml），前列腺穿刺及反复穿刺阴性率为78%和90%。美国一项临床随机对照试验表明，PSA作为PCa的诊断标记物不能降低癌死亡率。

因此亟需找到PCa特异性更高的分子诊断标记物和相关的检测技术。

发明内容

本发明的目的就是提供长链非编码RNA作为疾病诊断血液分子标志的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种分离的lncRNA，所述的lncRNA选自：

(1)序列如SEQ ID NO:n所示的lncRNA，其中n为选自1-9的正整数；或

(2)与SEQ ID NO:n所示序列互补的lncRNA，其中n为选自1-9的正整数。

在另一优选例中，所述的lncRNA为序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:7所示的lncRNA。

在另一优选例中，所述的lncRNA为序列SEQ ID NO:7所示的lncRNA。

在另一优选例中，所述的lncRNA分离自人或非人哺乳动物的血液。

在另一优选例中，所述的血液为血浆和/或血清。

在另一优选例中，所述的血液不包括血细胞。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物为小鼠、大鼠、兔、猪、牛、羊等。

在另一优选例中，所述的lncRNA分离自人。

在本发明的第二方面，提供了一种lncRNA集，所述的lncRNA集由序列如SEQID NO:1-9中所示的至少2种lncRNA所构成。

在另一优选例中，所述的lncRNA集至少包括如SEQ ID NO:6所示的lncRNA。

在另一优选例中，所述的lncRNA集由序列如SEQ ID NO:1-9中所示的9种lncRNA所构成。

在本发明的第三方面，提供了一种分离的前体lncRNA，所述的前体lncRNA能在人细胞内剪切并表达成第一方面所述的lncRNA。

在另一优选例中，所述的前体lncRNA分离自人或非人哺乳动物的血液。

在本发明的第四方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸能被人细胞转录成第一方面所述的lncRNA。

在另一优选例中，所述的多核苷酸具有式I所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向式I，

式I中，

Seq_正向为能在人细胞中表达成所述的lncRNA的核苷酸序列；

Seq_反向为与Seq_正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq _反向不互补；

并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：

式II，

式II中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述，

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

在本发明的第五方面，提供了一种载体，它含有第一方面所述的lncRNA，或第四方面所述的多核苷酸。

在本发明的第六方面，提供了第一方面所述的lncRNA、或第二方面所述的lncRNA集的用途，用于制备癌症诊断的芯片或试剂盒。

在本发明的第七方面，提供了一种lncRNA芯片，所述的lncRNA芯片包括：

固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1-9所示的部分或全部序列。

在本发明的第八方面，提供了第七方面所述的lncRNA芯片的用途，用于制备癌症诊断的试剂盒。

在另一优选例中，所述的癌症为前列腺癌、肺癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、皮肤癌等。

在另一优选例中，所述的癌症为前列腺癌。

在本发明的第九方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有第七方面所述的lncRNA芯片。

在本发明的第十方面，提供了一种分离并检测血液中lncRNA或其片段的方法，所述的lncRNA或其片段是以表达丰度不同的片段存在，包括步骤：

(1)获得样本血液的总RNA，并且逆转录所述的RNA，获得DNA；

(2)对所述的DNA进行检测和分离，获得相对应的血液中lncRNA或其片段的信息。

在另一优选例中，所述lncRNA或其片段用于人或非人哺乳动物疾病进行诊断及预后评估等。

在另一优选例中，所述方法可以对血液中lncRNA或其片段进行定性、半定量及定量检测。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示：SYBR qRT-PCR检测PCA3和MALAT-1在10对前列腺癌及癌旁组织中的表达量。

图2显示了PCA3和MALAT-1在10个前列腺癌组织和15个良性前列腺增生组织中表达情况比较，PCA3区分癌和BPH的敏感性为100%，特异性为80%；MALAT-1区分癌和BPH的敏感性为100%，特异性为100%。

图3为血浆中MALAT-1存在性实验，在MALAT-1整个序列中每隔1000bp设计引物，qRT-PCR检测各个片段的表达量。整合各个片段在8个样本中的表达量信息，可以看到第6个片段的表达量明显高于其它片段。

图4：Sanger测序证实第6个片段。

图5：用Northern blot对血浆中MALAT-1的存在形式分析结果，证实血浆中MALAT-1是以表达丰度不同的片段存在的。

图6显示反复冻融后，MD-miniRNA和PD-miniRNA保持稳定。

图7显示室温放置后，MD-miniRNA和PD-miniRNA的表达量保持稳定。

图8显示-80℃冻存后，MD-miniRNA和PD-miniRNA的表达量保持稳定。

图9酸碱处理后，MD-miniRNA和PD-miniRNA的表达量变化不大。

图10显示RNA酶处理处理后，MD-miniRNA和PD-miniRNA的表达量变化不大。

图11显示血浆PD-miniRNA不能有效区分前列腺癌与非癌病人，AUC-ROC=0.651。

图12显示了MALAT-1在不同前列腺细胞系中的表达情况。

图13显示了MD-miniRNA在前列腺细胞系培养上清中的表达实验结果。

图14显示了MD-miniRNA在实验组和对照组中的表达情况，MD-miniRNA能明显区分前列腺癌移植瘤和对照组。

图15显示了血浆MD-miniRNA表达量术前术后变化。

图16显示了血清PSA含量术前术后变化。

图17显示了血浆PD-miniRNA表达量术前术后变化。

图18为血浆MD-miniRNA诊断效能分析结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次成功分离并检测了人或非人哺乳动物血液（包括血浆和血清）中长链非编码的RNA（lncRNA），并且人或非人哺乳动物的血液中是以表达丰度不同的片段稳定存在的；血液中来源于lncRNA MALAT-1的短链RNA（命名为MD-miniRNA）来源于前列腺癌（Prostate cancer,PCa）细胞分泌并释放入血，体外培养的前列腺癌细胞能分泌MD-miniRNA，并释放到培养液中；在移植瘤小鼠血浆中能检测到MD-miniRNA的高表达。此外，MD-miniRNA的表达与PCa的发病呈现正相关，其对区分前列腺穿刺阳性和阴性病人的敏感性和特异性都分别高达40%以上和80%以上。因此，MD-miniRNA是一种新型的癌症（尤其是前列腺癌）血液分子诊断标记物，能显著提高诊断的准确性。

非编码RNA（Non-coding RNAs）

如本文所用，术语“非编码RNA”是指不编码蛋白质的RNA。在人类基因组中，大部分为非编码RNA。人类基因组中仅有2%产生的转录本是可编码RNA，剩余98%均为非编码RNA，它们是不能翻译成蛋白质的功能性RNA分子。这些非编码RNA广泛参与人体生理、病理活动，与众多肿瘤密切相关。

在非编码RNA中，根据大小的不同，具有调控作用的分子主要分为两类：短链非编码RNA（包括siRNA、miRNA、piRNA）和长链非编码RNA（Long non-coding RNA，LncRNA）。这些ncRNA广泛参与人体几乎所有的生理、病理活动，包括参与、调控或介导众多肿瘤的发生、发展过程。

长链非编码RNA（LncRNA）

如本文所用，术语“LncRNA”、“长链非编码RNA”、“Long non-coding RNA”含义相同，互换使用，都是指一种由RNA聚合酶II转录、不编码蛋白的、一般长度大于200bp的RNA片段。

在人类基因组序列中，4%～9%产生的转录本是长链非编码RNA（lncRNA），其中许多lncRNA仅在特定的发育阶段出现，具有组织或细胞特异性，lncRNA能够通过多种方式在不同层面上调节与之相关的蛋白编码基因，参与诱导疾病的发生。

本发明提供了一种从血液中分离的长链非编码RNA。

如本文所用，术语“血液”可以为血浆、血清，但不包括血细胞。

如本文所用，术语“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

LncRNA可从前体LncRNA加工而来，前体LncRNA可被剪切生成成熟的LncRNA，所述成熟的LncRNA可能与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。

如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70%的核苷酸是互补的；优选的，至少有80%的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90%的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95%的核苷酸是互补的；如98%、99%或100%。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。

如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

本发明优选的LncRNA具有如SEQ ID NO.:1-9任一所示的序列，优选SEQID NO.:2、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:7。

反义寡核苷酸

如本文所用，术语“反义寡核苷酸”、“antisense-oligonucleotides”、“AS-Ons”、或“ASO”含义相同。根据本发明所提供的LncRNA序列，可以设计出了它们的反义寡核苷酸，所述的反义寡核苷酸可在体内下调相应的LncRNA的量或LncRNA的表达。

在本发明中，所述的“反义寡核苷酸”还包括采用如基于核酸锁或核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义寡核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义寡核苷酸的稳定性、活性或治疗效果。

将本发明所述的反义寡核苷酸转移到人或非人哺乳动物体内后，它们能够明显下调相关LncRNA的表达。

多核苷酸构建物

根据本发明所提供的人LncRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的LncRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的LncRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成LncRNA。

作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式I所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向式I，

式I中，

Seq_正向为可在细胞中表达成所述的LncRNA的核苷酸序列，Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq_反向为可在细胞中表达成所述的LncRNA 的核苷酸序列，Seq_正向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；

式I所示的结构在转入细胞后，形成式II所示的二级结构：

式II，

式II中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述；

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的LncRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

芯片

LncRNA表达谱芯片通常含有多达几百个探针，涵盖多种RNA，利用DNA双链同源互补的原理在全基因组水平上检测样本中所含各种RNA的含量。因此，可在同一时间对待测样本中全基因组范围内的RNA的转录水平进行检测。

利用本发明所述的LncRNA序列，还可以制备相应的LncRNA芯片，进而研究其表达谱以及LncRNA的调节方式。

在另一方面，本发明还提供一种用于分析LncRNA表达谱的芯片。本发明的所述的LncRNA芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1-9所示的序列中的至少1种(如1、2、3、4、5、6、7、8、9种)。

具体地，可根据本发明所述的LncRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

所述的LncRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi,V.R.Iyer,P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science,1997;278:680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。

另一方面，本发明还提供了一种通过LncRNA芯片检测人或非人哺乳动物血液中LncRNA表达谱的方法，包括步骤：

(1)提供分离自人或非人哺乳动物血液的RNA样品，在所述的RNA上设置标记物；

(2)将(1)的RNA与所述的芯片接触，使所述的RNA与固相载体上的寡核苷酸探针发生杂交反应，从而在固相载体上形成“寡核苷酸探针-RNA”二元复合物；

(3)检测(2)形成的二元复合物的标记物，从而确定人组织中相应的LncRNA的表达谱。

从人组织中提取RNA的方法是本领域技术人员熟知的方法，包括Trizol法。

更优选的，在步骤(1)中，在从人组织组织中分离出RNA样品后，对RNA样品进行适当处理，以富集具有一定长度的RNA，所述长度一般在150-250之间。在经过上述处理后，利用这些小片段RNA进行后续的杂交，这样可提高芯片捕获LncRNA的准确性。

本领域人员可方便地分离出具有一定片段长度的RNA，比如可采用凝胶电泳法来分离。

对RNA进行标记也是本领域技术人员熟知的方法，其可通过在杂交时加入与RNA特异性结合的标记物的方法实现，所述标记物比如是标记基团。所述的标记基团包括但不限于：地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生生物分子(FITC等)、其它荧光分子(如Cy3、Cy5等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等。这些标记及其标记方法都已是本领域众所周知的常规技术。

将上述的RNA与LncRNA芯片进行杂交时，可以先将LncRNA芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。

本发明所述的RNA与LncRNA芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样本浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。或者也可以参照《分子克隆实验指南》中所述的。

然后根据标记信号在LncRNA芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。若扩增产物用荧光基团标记，也可直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray 3000等)获取待测信息。

检测试剂盒

本发明还提供了一种试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明的芯片。所述的试剂盒可用于检测血液中所述LncRNA的表达。

优选的，所述的试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。

此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。

此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

本发明的主要优点在于：

(a)血液中lncRNA是以表达丰度不同的片段稳定存在，MD-miniRNA可以作为一种新型的前列腺癌血浆中分子诊断标记物；

(b)以血液中的MD-miniRNA作为标志物能显著提高癌症诊断的准确性和特异性。

英文缩略词

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实验试剂

实验方法

1、组织RNA抽提和质量控制

按照常规的Trizol法提取组织总RNA。

组织/细胞总RNA质量检测：应用普通的琼脂糖胶电泳法进行质量检测。电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利(指条带的边缘清晰)，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，认为RNA的质量是好。条带不清、28S：18S<2或有尾部拖长现象，认为有RNA降解或其它成份的污染，将其剔除。

2、血浆/血清总RNA抽提和质量控制

使用常规方法进行。使用血浆/血清tRNA抽提试剂盒（mirVana PARIS Kit；AM1556）美国Ambion公司。具体操作方法详见：

http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_056986.pdf。

3、细胞培养

实验中所涉及的常规前列腺癌各细胞系在含10%胎牛血清RPMI-1640培养液及37.0℃、5%CO₂的培养条件下行含雄激素培养。而LNCaP－AI细胞培养液则采用10%活性炭/葡聚糖处理的胎牛血清和不含酚红RPMI-1640培养液进行培养。

4、动物实验（肿瘤细胞皮下种植）

（1）肿瘤细胞的准备：待前列腺癌22RV1细胞生长至对数增长期，即状态最佳时，消化收集，然后计数，算得细胞总量，1000转离心5分钟，去上清后加入1640培养液，大约5*106/100ul，然后按1:1比例与基质胶混匀，基质胶需提前1小时放4℃溶解，混好后，最后放4℃冰水中暂存。

（2）接种：将22RV1细胞准备好后尽快带至动物房，时间不能长于1小时，接种部位选择裸鼠腋下、肩部和背部，为便于观察测量肿瘤情况，我们选择将肿瘤细胞接种于裸鼠背部；接种量为每只200ul约5*106，接种前先用75%酒精将裸鼠背部皮肤消毒，然后将裸鼠固定，用1ml注射器吸取肿瘤细胞后，开始进针，进至皮下约1cm开始注射肿瘤细胞，注入约200ul看到有明显的隆起即可，退出针头，用棉球稍按压进针口，以防止肿瘤细胞溢出。

（3）实验标本收集：大约4周后即可看到肿瘤明显。此时可将裸鼠处死，心脏穿刺取血。用与处理人血浆/血清同样的方法处理，最后小鼠血浆-80℃冻存，

5、实时定量PCR

（1）反转录：将抽提好的总RNA使用NANO Drop 1000测定浓度及260/280nm吸光度，260/280nm吸光度比值在1.8～2.0之间说明RNA质量良好，根据测得的RNA浓度，每个样本定量1000ng的RNA用于反转录。使用大连宝生物的DDR037A反转录试剂盒，20ul的体系（见表1），加入到200ul的去酶EP管中，离心后置入PCR仪，温度条件设置为:37℃15min,85℃5sec。结束后将cDNA稀释10倍，-20℃保存备用。

表1

（2）实时定量PCR：上海生工生物合成引物，序列见表2。

表2

采用美国ABI公司的实时定量PCR仪（AB StepOne Plus）对前列腺癌组织及前列腺癌细胞系中MALA T-1进行检测，东洋纺公司（TOYOBO）公司的SYBRGreen染料掺入法检测，反转录获得的cDNA稀释十倍，以20ul为反应体系（见表3），使用ABI八连PCR管。生成标准曲线时，每孔设置8个复孔，其余设置3个复孔。扩增条件为：95℃预变性60sec，之后95℃变性15sec，60℃延伸60sec，共40个循环，得到目标基因及内参的Ct值。

表3

（2）实时定量PCR标准化：所有反应数据均由StepOne Software version v2.1(Applied BioSystems,USA)分析得出。

采用绝对量的血浆/血清350μl进行总RNA的抽取，使用绝对量的洗脱液50μl进行洗脱总RNA，使用绝对量的总RNA溶液2μl进行反转录。然后，采用绝对定量的方法对表达量进行绝对量的计算^[2]。方法简述如下：RT-PCR，切胶回收目标基因片段，检测DNA浓度，计算目标基因分子数，qRT-PCR检测梯度DNA，作出标准曲线。

6、统计学分析

用SPSS 16．0软件包对数据进行统计学分析，用Mann–Whitney，Wilcoxon，χ²，and Kruskal–Wallis检测组织、细胞、血浆和血清目标基因表达的统计学差异；用受试者工作曲线(ROC)确定最佳截断值(cut off)、特异度、敏感度、曲线下面积(AUC)，以P＜0.05为差异有统计学意义。

实施例1样本获取及处理

1.组织标本

本实验所有临床组织标本均来自于上海长海医院。所有标本的使用均由病人或其委托人签署知情同意书。所有涉及人体标本的研究均事先获得长海医院伦理委员会的批准。

14对前列腺癌及其癌旁组织用于RNA测序（RNA sequence,RNA-seq）。10对前列腺癌及其癌旁组织和15个良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia,BPH）组织用于验证RNA-seq结果，患者临床资料见表4。

表4

2、血浆标本

25个不同病人的血浆标本取自于长海医院泌尿外科，用于探索血浆中lncRNA或其片段的生物学特性，其临床资料见表5。

表5

从2011年5月到2011年12月，收集192例患者血浆样本，包括87例前列腺穿刺阳性患者、82例前列腺穿刺阴性患者和23例正常对照，其临床资料见表6。另外，收集10例患者术前术后配对血浆标本，用于评估术前术后lncRNA变化，也用来对照分析患者血清PSA变化。

表6

所有前列腺癌标本患者均为新诊断且术前未进行过任何治疗。前列腺穿刺标本的最后诊断均由病理确认。

3、标本取材与处理

组织标本：立即将新鲜手术标本送病理科，取组织标本，HE染色确定标本性质。前列腺癌组织标本，经HE染色后癌细胞范围>70%。

血浆/血清标本：在抽血后1h时内取血浆标本进行处理，半小时血液凝固后，取在2h内取血清标本进行处理。血浆/血清标本均1800xg，4℃离心15min。为了防止细胞层的染污，小心取离心后血浆和血清上清部分，以剩距细胞层0.5cm为宜。所有标本，包括组织和血浆/血清标本均分装保存在-80℃。

实施例2前列腺癌相关的lncRNA

在前期的工作中，使用14对前列腺癌及癌旁组织进行RNA-seq分析，分析前列腺癌相关lncRNA，结果发现406个lncRNA在前列腺癌及癌旁组织中差异性表达，包括已知的PCA3和MALAT-1。

由于PCA3和MALAT-1是已知的肿瘤相关lncRNA，因此，本实施例对这两个lncRNA作了进一步的研究。使用10对前列腺癌和癌旁组织进行验证PCA3和MALAT-1，结果发现这两个基因在前列腺癌组织中广泛高表达（图1）。使用10个前列腺癌组织和15个良性前列腺增生组织（BPH）进一步验证，发现PCA3和MALAT-1在前列腺癌组织中的表达量明显高于BPH组织（图2）。

实施例3血浆中lncRNA的存在方式

本实施例检测MALAT-1在血浆中的存在方式。在MALAT-1的全长基因上每1000bp设计了一个扩增片段（详细信息见表7），所有这些MALAT-1片段的表达量都在8个前列腺癌血浆样本中进行qRT-PCR检测（病人信息见表8）。

表7

表8 8个前列腺癌样本详细信息

发明人还结果发现这9个MALAT-1片段在血浆中的表达量相差很大（见图3），第六个片段相对表达水平最高。对表达量最高的PCR产物进行测序，证实了所得到的片段确实是发明人设计的来源于MALAT-1的基因片段（图4）。

发明人进一步运用Northern blot对血浆中MALAT-1的存在形式进行分析，运用RNA探针，序列如下：

5'-GCCCACAGGAACAAGTCCTACAATTTTAAAAAGGCTCGATGGAAAAATTTCTCAATCCTGAAATCCCCTAGGGAAG-3'（SEQ ID NO.：32），在5'进行地高辛标记，结果（图5）证实了血浆中MALAT-1是以表达丰度不同的片段存在的。

实施例4血浆中lncRNA的生物学特性

发明人选择PCA3和MALAT-1表达在血浆中的表达量最高的片段作了深入研究。把表达量最高的MALAT-1片段命名为来源于MALAT-1的miniRNA（MD-miniRNA），把表达量最高的PCA3片段命名为来源于PCA3的miniRNA（PD-miniRNA）。发明人进一步研究血浆中MD-miniRNA和PD-miniRNA的生物学特性。分如下5个实验完成。

1.血浆反复冻融实验

取离心好的来源于不同个体的血浆3份，每份分为5等份。将5份血浆分别冻融0、1、2、4、8次，立即提取血浆总RNA进行后续表达量测定。结果表明反复冻融了数次以后，MD-miniRNA和PD-miniRNA表达量的变化极小（图6）。

2、血浆室温放置实验

取离心好的来源于不同个体的血浆3份，每份分为7等份。将7份血浆分别室温放置0、0.5、1、2、4、8、24小时，立即提取血浆总RNA进行后续表达量测定。结果表明室温放置血浆后，MD-miniRNA和PD-miniRNA表达量的变化极小（图7）。

3、-80℃冻存实验

取离心好的来源于不同个体的血浆3份，每份分为3等份。将3份血浆分别-80℃冻存0、1周、1月，分别提取血浆总RNA进行后续表达量测定。结果表明MD-miniRNA和PD-miniRNA表达量基本无变化（图8）。

4、酸碱处理实验

取离心好的来源于不同个体的血浆5份，每份分为3等份。将2份血浆分别用强酸强碱处理，另一份不作处理。分别提取血浆总RNA进行后续表达量测定。结果发现MD-miniRNA和PD-miniRNA表达量变化不大（图9）。

5、RNA酶处理实验

取离心好的来源于不同个体的血浆2份，每份分为5等份。将4份血浆分别用RNAse A、RNAse H、RNAse I、RNAse T1处理，另一份不作处理。分别提取血浆总RNA进行后续表达量测定。结果发现MD-miniRNA和PD-miniRNA表达量变化不大（图10）。

实施例5MD-miniRNA存在于细胞培养上清中

运用34对前列腺穿刺阳性和阴性病人血浆标本进行PD-miniRNA的诊断效能研究，在小样本的验证中，PD-miniRNA不能很好的区分前列腺癌与非癌病人（图11），图11显示血浆PD-miniRNA不能有效区分前列腺癌与非癌病人，AUC-ROC=0.651。

因此在后面的试验中，发明人仅用PD-miniRNA作为血浆/血清中lncRNA存在方式和生物学特性的研究，选用MD-miniRNA进行后续早期诊断研究。

基于血浆中lncRNA的存在性和稳定性，我们进上步研究血浆中lncRNA的来源。首先，研究了MALAT-1在前列腺细胞系中的表达情况，结果表明（图12），包括1株正常前列腺细胞系（PWR-1E）和6株前列腺癌细胞系（C4-2，PC3，DU145，LNCap-AD，22RV1，LNCap-AI）。

选择6种前列腺细胞系（PWR-1E，C4-2，PC3，LNCap-AD，22RV1，LNCap-AI）进行了细胞上清实验的研究。同一细胞系传代时分成3份，分别于培养1天、2天、3天取细胞上清，细胞上清处理和总RNA的抽提方法与血浆/血清相同。qRT-PCR分析结果表明，MD-miniRNA在前列腺癌细胞上清中表达且表达量随着时间的推移而升高，而在前列腺正常细胞系中表达低且变化较小（图13）。

实施例6MD-miniRNA在前列腺癌移植瘤血浆中高表达

为了进一步探索MD-miniRNA的来源，发明人进行前列腺癌移植瘤实验。移植瘤模型建立好以后，心脏穿刺取小鼠血液，2小时内对血液进行处理，方法同人体标本的血浆处理方法。用qRT-PCR检测MD-miniRNA表达量。

结果显示，移植瘤血浆中MD-miniRNA明显高表达（图14），且MD-miniRNA能明显区分实验组和对照组，敏感性和特异性均达100%。因此，MD-miniRNA可能来源于前列腺肿瘤。

实施例7血浆MD-miniRNA来源

为了进一步论证血浆中MD-miniRNA来源，取10个前列腺癌根治术术前和术后7天血浆样品进行MD-miniRNA表达量的研究，并分析MD-miniRNA表达变化与血清PSA含量、PD-miniRNA表达量变化的关系。术前标本取材时，患者需未经任何治疗。

结果发现，术后MD-miniRNA表达显著下降（p=0.022，Wilcoxon test；图15）。血清PSA含量（p=0.005，Wilcoxon test，图16）、PD-miniRNA表达量（p=0.037，Wilcoxon test，图17）也较术前显著下降。

本实施例结果说明前列腺肿瘤组织可分泌MD-miniRNA并释放入血。MD-miniRNA表达量的变化与血清PSA含量及PD-miniRNA表达量变化一致。

实施例8血浆MD-miniRNA在前列腺癌诊断中的作用

运用192例病人血浆样本，包括87例前列腺穿刺阳性病人、82例前列腺穿刺阴性病人和23例正常对照，检测MD-miniRNA的诊断价值。

qRT-PCR检测血所有血浆和血清样本中lncRNA及其片段的表达情况。应用标准曲线法计算MD-miniRNA的绝对量。应用AUC-ROC方法统计检测指标的诊断效能。实验所用样本均为最新诊断且取样前未经任何治疗的病人样本。

对192个临床病人血浆进行MD-miniRNA检测发现，前列腺癌病人血浆中MD-miniRNA的表达量显著高于非恶性肿瘤病人（p<0.001，图18A），前列腺穿刺阳性病人血浆中MD-miniRNA的表达量显著高于前列腺穿刺阴性病人（p<0.001，图18B），PSA=4-10ng/ml的前列腺穿刺阳性病人血浆中MD-miniRNA的表达量也显著高于前列腺穿刺阴性病人（p=0.001，图18C）。

另外，运用AUC-ROC进行血浆MD-miniRNA和血清PSA诊断效能分析，结果详见表9。血浆MD-miniRNA在诊断前列腺癌与非癌（MD-miniRNA:AUC-ROC,0.836vs.PSA:AUC-ROC=0.770）（图18D）、前列腺穿刺阳性与穿刺阴性（MD-miniRNA:AUC-ROC,0.841vs.PSA:AUC-ROC=0.708）（图18E）、PSA=4-10ng/ml范围内前列腺穿刺阳性与阴性（MD-miniRNA:AUC-ROC,0.767vs.PSA:AUC-ROC=0.446）（图18F）方面效能显著高于血清PSA。

表9

运用867.8拷贝数/μl血浆作为截断点进行研究，结果显示，MD-miniRNA对区分前列腺穿刺阳性和阴性病人(PSA>4ng/ml)的敏感性和特异性分别为：58.6%、84.8%；区分在PSA=4-10ng/ml范围内前列腺穿刺阳性和阴性病人的敏感性和特异性分别为：43.5%、81.6%；区分前列腺癌和非前列腺癌病人的敏感性和特异性分别为：58.6%、84.8%。

讨论：

1.LncRNA片段在血浆/血清中稳定存在

近年来，在肿瘤无创或微创方面，循环血液中细胞外或非细胞性RNA检测成为极富前景的人类肿瘤诊断和判断预后的方法。虽然循环血液中mRNA检测在肿瘤诊断和判断预后方面取得了一定进展，并且已经建立了血浆/血清中microRNA用于诊断肿瘤的方法，但lncRNA却未曾研究过。

本发明第一次系统性检测血浆中lncRNA的存在方式及生物学特性。结果表明，虽然lncRNA的某些片段在血浆中表达量很高，但lncRNA在血浆中并不是完整存在的，这可能是由于某种机制使其断裂成表达量不同的多个片段，各个片段也可能在肿瘤的发生与发展过程中起着不同的作用。

近期，研究者们发现了在mMALAT-1的3’端存在着一段高度保守的序列，这段序列定位在细胞浆中，命名为MALAT-1相关的类似tRNA的细胞浆小RNA，即mascRNA。这种存在形式与本发明究类似，但经分析后，mascRNA与我们发现的MD-miniRNA并不同源（详细信息见表7）。

2.血浆中MD-miniRNA来源于肿瘤细胞，分泌入血

血浆中MD-miniRNA的来源是什么？本发明人认为血浆中的MD-miniRNA来源于前列腺肿瘤细胞，并分泌入血。发明人在体外实验和体内实验中都证明了这一关点。另外，MD-miniRNA分泌和入血的机制不明，但这种血浆中高表达的lncRNA片段值得进行下一步的研究。

3.MD-miniRNA是一种新的前列腺癌血液分子诊断标记物

在本发明中，运用RNA-seq证实MALAT-1在前列腺癌和癌旁组织中差异性表达。其后，检测了血浆中来源于MALA T-1的miniRNA在诊断前列腺癌中的效能。结果表明，血浆MD-miniRNA相对于血清PSA检测来说，可以更准确区分前列腺癌与正常人，并且在PSA=4-10ng/ml时，血浆MD-miniRNA显示出更强的诊断价值。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种lncRNA集，其特征在于，所述的lncRNA集由序列如SEQ ID NO:1-9中所示的至少2种lncRNA所构成，其中一种lncRNA如SEQ ID NO.:6所示。

2.一种分离的多核苷酸集，其特征在于，所述的多核苷酸集中的多核苷酸能被人细胞转录成权利要求1所述的lncRNA集。

3.权利要求1所述的lncRNA集的用途，其特征在于，用于制备前列腺癌诊断的芯片或试剂盒。

4.一种lncRNA芯片，其特征在于，所述的lncRNA芯片包括：

固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于SEQ ID NO:1-9所示的部分或全部序列，且所示的部分序列至少由2种lncRNA所构成，其中一种lncRNA如SEQ ID NO.:6所示的序列，即所述的寡核苷酸探针特异性地针对权利要求1所述的lncRNA集。

5.权利要求4所述的lncRNA芯片的用途，其特征在于，用于制备前列腺癌诊断的试剂盒。

6.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求4所述的lncRNA芯片。