CN113862366A - 一种肝癌诊断的生物标志物及其诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种肝癌诊断的生物标志物及其诊断试剂盒，属于生物学技术领域。本发明所提供的生物标志物为ENST00000415932.1基因，本发明通过实验发现，ENST00000415932.1基因在肝癌患者的外周血单个核细胞中低表达，而且将ENST00000415932.1基因用于诊断时具有较高的诊断价值。
Description
技术领域
本发明属于生物学技术领域，尤其涉及一种肝癌诊断的生物标志物及其诊断试剂盒。
背景技术
肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。目前，我国是全球肝癌发生率和死亡率最高的国家，肝癌具有高度的异质性，因此其相较于其他的实体肿瘤具有易转移复发和耐药的特点。虽然肝癌的治疗技术现在得到了不断的提升，但是肝癌患者的5年生存率并没有发生显著的改善。限制手术治疗效果的核心原因在于肝癌的早期诊断率低并且术后的复发率高。
LncRNA是一种长度大于200nt的转录产物，由于其缺乏开放阅读框，因此其无法进行蛋白的编码。最开始发现时，lncRNA被认为是垃圾基因，不具有生物学功能。但是，后续的研究表明lncRNA可以通过转录激活、mRNA降解以及翻译调控等方式曾参与细胞的生理活动，并可以参与多种疾病的发生发展。因此，利用lncRNA实现肝癌患者的早诊断，对于实现肝癌患者的早治疗和提高肝癌患者的生存率具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的肝癌诊断的生物标志物及其诊断试剂盒，从而实现肝癌患者的早诊断和早治疗。
第一方面，本发明提供了检测ENST00000415932.1基因过表达的试剂在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。
优选地，所述ENST00000415932.1基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述试剂为检测ENST00000415932.1基因表达量的荧光定量PCR引物。
优选地，所述荧光定量PCR引物的序列如下：
上游引物为：CTGGACGACACAGTGAGACC；
下游引物为：GGCTCAATGGTTCATGCCTG。
第二方法，本发明提供了一种肝癌诊断的试剂盒，所述试剂盒包括检测ENST00000415932.1基因表达量的荧光定量PCR引物，ENST00000415932.1基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述荧光定量PCR引物的序列如下：
上游引物为：CTGGACGACACAGTGAGACC；
下游引物为：GGCTCAATGGTTCATGCCTG。
优选地，所述试剂盒还包括SYBR反应液，PCR反应缓冲液和水。
第三方法，本发明提供了一种试剂盒在制备肝癌诊断试剂中的应用，所述试剂盒为检测ENST00000415932.1基因表达量的试剂盒，所述ENST00000415932.1基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述试剂盒包括检测ENST00000415932.1基因表达量的荧光定量PCR引物。
优选地，所述荧光定量PCR引物的序列如下：
上游引物为：CTGGACGACACAGTGAGACC；
下游引物为：GGCTCAATGGTTCATGCCTG。
本发明的有益效果是：
本发明发现ENST00000415932.1基因在肝癌患者的外周血单个核细胞中低表达，而且ROC曲线显示，ENST00000415932.1基因在用于肝癌诊断时的AUC值为0.907，具有较高的诊断价值,因此，可用于制备肝癌诊断试剂盒。
附图说明
图1为正常组和肝癌组的外周血单个核细胞中ENST00000415932.1基因的相对表达量。
图2为ENST00000415932.1基因诊断效果的ROC曲线。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
实施例1
（1）收集50例肝癌患者的静脉血和50例正常人静脉血；
（2）取2ml静脉血，调整离心机转速为3500转/分，离心10min，此时血液分为两层，上层为淡黄色血浆，下层为细胞；
（3）去除上层的血浆，按照1:1的比例加入生理盐水并轻轻混匀；
（4） 将4ml淋巴细胞分离液加入到无酶离心管中，小心的将混合生理盐水的细胞倒入到离心管中，调整离心机转速为1500转/min，离心20min；
（5）此时，液体被分为3层，其中最上层的是淡黄色的血浆，中间层为乳白色的淋巴细胞，下层为红色的血细胞，小心的将中间层的细胞吸取到离心管中，调整离心机转速为10000转/min,离心5min；
（6）离心结束后，去除上清，保留沉淀，即得到单个核细胞。
实施例2
（1）在得到的单个核细胞中加入1ml Trizol，使用移液器吹打细胞；
（2）加入200ul氯仿，混匀之后于室温放置5min，置于离心机中进行离心；
（3）离心结束之后，小心的吸取上层的水相至新的无酶离心管中，加入异丙醇后冰上放置10min后置于离心机中离心，离心结束后，保留沉淀；
（4）加入500ul预冷的70%乙醇溶解沉淀，离心后，弃去上清，室温干燥5-10min，加入DEPC水，得到RNA；
（5）参照逆转录试剂盒配置gDNA去除反应体系
| 组成成分 | 使用量 |
| 5×g DNA Buffer | 2 μL |
| TotaL RNA | 2 μg |
| RNase-Free ddH2O | 补足到 10 μL |
设定的反应条件为：42℃，3min，结束后置于冰上。
（6）配置逆转录反应体系
| 组成成分 | 使用量 |
| 10×King RT Buffer | 2 μL |
| FastKing RT Enzyme Mix | 1 μL |
| FQ-RT Primer Mix | 2 μL |
| 步骤（5）反应液 | 10 μL |
| RNase-Free ddH2O | 5μL |
设定的反应条件为：42℃ 15min，95℃ 3min，结束后置于冰上。
（6）按照荧光定量PCR试剂盒配置反应液
| 成分 | 体积 |
| SYBR<sup>⑩</sup>Premix Ex Taq II | 10μl |
| PCR 上游引物 | 0.8μl |
| PCR 下游引物 | 0.8μl |
| ROX Reference Dye | 0.4μl |
| DNA模板 | 2μl |
| dH<sub>2</sub>O | 6μl |
| Total | 20μl |
设定的反应条件为：95℃ 30s预变性，95℃ 5s，60℃ 35s，重复40个循环。
（7）以β-actin为内参，采用2-∆∆Ct的方法计算基因的相对表达量。
本发明所检测的基因为ENST00000415932.1基因，该基因的序列cDNA序列如下：
GGCAAAGTTCAGCATCATCCTCTCTGCTGAAATAACCAACATGGTGCTCATTAATTGGTCATGTGAGCACTAAGGATAACCACCCTCCCCTCCTCAATCAGGATCACAAATGCTAGCTTTCATATGGATTTCAAGCTGGGTGAAATGACTTTTTTTGCTTGTAAAGAAGAAATGATGATGGAGGTCTCATCAGGAAGTGATGCAGAAGACTGGGACAGACGGGGGTTTCACCATGTTGGCCAGGATGGTCTCAAACTCCTAACCTCGCGATCCACCCACCTCGGCCTCCCAAAGTGCTAGGATTACAGGCGTGAGGCACTGCACCCAGCCCATCATAAGTATTTTCATGTATCATCATGTATTTTAGAAAATGGTATTATTGACTATATATCAGTTCATTGTGTGCACACATTTTATTTAATTAATTTGCTCTTTTCAGTTATTTAGTTTTCTTTTTTTGTTATTATAAATTTCATAGTAATATATGTCCTTATACATAAATCTGAGTATGAATCTAGGATTATTTACTTAAAATGAATTTCCAGACACAAATTGTGGGGTTAAAGTGGGAGGAGCATTTTTAAAGCTTTTGATATATACCGCTAAATTGTCTTATAGGAATGTATAAATTATGAAACAACCAGCTGTCCATGTGAGACCATGCATTTCCTTATCCAAATGAAGTTAAAGAAATTATTTGTCAGCTTTTTTGGTGGTATGTGGTAACTCCTTTTCCTGATTTGAATGTTTTTCTAGTACTAGTGACTTTTTACAGGTTTTTCTTATGTTTGTTGGTTGAGTTTTTTTTTTTAATGTCTATGCCTATCTTAGTATCTATGCCTATTTTAATTTTTTAATGTCTATGTACTTTCTTTTGGAGCATGTTGTATGATATTTTATAAATAAAAGGTGTTAACTCTGTCATTATAGTGTAAATATATTTCCCAATATGTTTTTAAATTTTCATTTATGATATATAGAAATTTTAACTTTTATATATTAAAAATATCTATATTTAAATGACTTTGTCCAGATGTAGTGACTCATGCCTGTAATCACAGAATTTTGAGAGGCTATGTCAAGAGGATTGCTTGAGGCCAGGAGTTCCTGGCCAGCCTGGACGACACAGTGAGACCCCTATCTCTAAAAAAGTTTTTTTTCAAACAATCCTGCCACCTCAGCTTCCTAAAGTGCTGGGATTACAGGCATGAACCATTGAGCCCAGGTTCTTTGTAATATCTTCCTCCACGTTTTTACGTATCAATCCTGCATTCAAACATTTACTCATTCTGAAACAAATTTTAGTATATGTTATAAGGTATTGATCCAAATTTTTACGTTTATAAATAGTTAACATCTCCAAACCATTTATTGATATTAATTTCACCTTCATCATATTGTAAATTATAGTTTTGATTTTCCTTTTTGACAATGAATTATCTAAGAGGATACTTTAGAATTTTCAAACTTAATAAAAAACTTTT；
ENST00000415932.1基因的上游引物序列如下：CTGGACGACACAGTGAGACC,SEQ IDNO.2；
ENST00000415932.1基因的下游引物序列如下：GGCTCAATGGTTCATGCCTG,SEQ IDNO.3；
实验所得到的结果被展示于图1中，肝癌组单个核细胞中的ENST00000415932.1基因的相对表达量为0.485±0.273，P值小于0.001，差异具有统计学意义，说明肝癌组单个核细胞中ENST00000415932.1基因的相对表达量低于正常组。
为了检测ENST00000415932.1的诊断效果，本发明绘制了ROC曲线，结果如图2所示。曲线下面积（AUC）为0.907，置信区间为0.849-0.965。
AUC越接近1，说明诊断效果越好。AUC在0.5-0.7时有较低准确性，AUC在0.7-0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。而本发明为AUC值为0.907，说明ENST00000415932.1在用于诊断患者是否患有肝癌时具有较高的准确性，因此可将其用于辅助诊断患者是否患有肝癌。
实施例3
本发明提供一种诊断肝癌的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒中包括SYBR⑩PremixEx Taq II，ENST00000415932.1基因上游引物，ENST00000415932.1基因下游引物，ROXReference Dye，DNA模和dH2O；
ENST00000415932.1基因的上游引物序列如下：CTGGACGACACAGTGAGACC,SEQ IDNO.2；
ENST00000415932.1基因的下游引物序列如下：GGCTCAATGGTTCATGCCTG,SEQ IDNO.3。
本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述，当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 山东师范大学
<120> 一种肝癌诊断的生物标志物及其诊断试剂盒
<150> 2021112456138
<151> 2021-10-26
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1484
<212> DNA
<213> 人源(Human)
<400> 1
ggcaaagttc agcatcatcc tctctgctga aataaccaac atggtgctca ttaattggtc 60
atgtgagcac taaggataac caccctcccc tcctcaatca ggatcacaaa tgctagcttt 120
catatggatt tcaagctggg tgaaatgact ttttttgctt gtaaagaaga aatgatgatg 180
gaggtctcat caggaagtga tgcagaagac tgggacagac gggggtttca ccatgttggc 240
caggatggtc tcaaactcct aacctcgcga tccacccacc tcggcctccc aaagtgctag 300
gattacaggc gtgaggcact gcacccagcc catcataagt attttcatgt atcatcatgt 360
attttagaaa atggtattat tgactatata tcagttcatt gtgtgcacac attttattta 420
attaatttgc tcttttcagt tatttagttt tctttttttg ttattataaa tttcatagta 480
atatatgtcc ttatacataa atctgagtat gaatctagga ttatttactt aaaatgaatt 540
tccagacaca aattgtgggg ttaaagtggg aggagcattt ttaaagcttt tgatatatac 600
cgctaaattg tcttatagga atgtataaat tatgaaacaa ccagctgtcc atgtgagacc 660
atgcatttcc ttatccaaat gaagttaaag aaattatttg tcagcttttt tggtggtatg 720
tggtaactcc ttttcctgat ttgaatgttt ttctagtact agtgactttt tacaggtttt 780
tcttatgttt gttggttgag tttttttttt taatgtctat gcctatctta gtatctatgc 840
ctattttaat tttttaatgt ctatgtactt tcttttggag catgttgtat gatattttat 900
aaataaaagg tgttaactct gtcattatag tgtaaatata tttcccaata tgtttttaaa 960
ttttcattta tgatatatag aaattttaac ttttatatat taaaaatatc tatatttaaa 1020
tgactttgtc cagatgtagt gactcatgcc tgtaatcaca gaattttgag aggctatgtc 1080
aagaggattg cttgaggcca ggagttcctg gccagcctgg acgacacagt gagaccccta 1140
tctctaaaaa agtttttttt caaacaatcc tgccacctca gcttcctaaa gtgctgggat 1200
tacaggcatg aaccattgag cccaggttct ttgtaatatc ttcctccacg tttttacgta 1260
tcaatcctgc attcaaacat ttactcattc tgaaacaaat tttagtatat gttataaggt 1320
attgatccaa atttttacgt ttataaatag ttaacatctc caaaccattt attgatatta 1380
atttcacctt catcatattg taaattatag ttttgatttt cctttttgac aatgaattat 1440
ctaagaggat actttagaat tttcaaactt aataaaaaac tttt 1484
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctggacgaca cagtgagacc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggctcaatgg ttcatgcctg 20
Claims (10)
1.检测ENST00000415932.1基因过表达的试剂在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ENST00000415932.1基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为检测ENST00000415932.1基因表达量的荧光定量PCR引物。
4.根据权利要求3所述的应用，所述荧光定量PCR引物的序列如下：
上游引物为：CTGGACGACACAGTGAGACC；
下游引物为：GGCTCAATGGTTCATGCCTG。
5.一种肝癌诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测ENST00000415932.1基因表达量的荧光定量PCR引物，所述ENST00000415932.1基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR引物的序列如下：
上游引物为：CTGGACGACACAGTGAGACC；
下游引物为：GGCTCAATGGTTCATGCCTG。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括SYBR反应液，PCR反应缓冲液和水。
8.一种试剂盒在制备肝癌诊断试剂中的应用，其特征在于，所述试剂盒为检测ENST00000415932.1基因表达量的试剂盒，所述ENST00000415932.1基因的cDNA序列如SEQID NO.1所示。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括检测ENST00000415932.1基因表达量的荧光定量PCR引物。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述荧光定量PCR引物的序列如下：
上游引物为：CTGGACGACACAGTGAGACC；
下游引物为：GGCTCAATGGTTCATGCCTG。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20211231 |