CN101899519B - 一种用于华法林个体化用药相关基因snp位点检测的试剂盒及其pcr扩增方法 - Google Patents

Abstract

一种用于华法林个体化用药相关基因SNP检测的试剂盒及其PCR扩增方法，所述试剂盒包括检测基因VKORC1(-1639G/A)SNP位点的两个正向引物以及一个反向引物和/或检测基因CYP2C9(1075A/C)SNP位点的两个正向引物以及一个反向引物。本发明的试剂盒，可以实现高效率高通量VKORC1(-1639G/A)与CYP2C9(1075A/C)的SNP位点检测，从而达到对华法林剂量量化的控制，甚至对血栓性疾病的预防、抗凝药物的选择、新抗凝药的研发、血栓性的疾病预后也起到一定的作用。

Description

一种用于华法林个体化用药相关基因SNP位点检测的试剂盒及其PCR扩增方法

技术领域

本发明涉及一种用于华法林个体化用药相关基因SNP位点检测的试剂盒及其PCR扩增方法，特别涉及一种检测影响临床华法林用药剂量的维生素K环氧化物还原酶复合物1基因VKORC1(-1639G/A)与细胞色素P450酶2C9基因CYP2C9(1075A/C)的单核苷酸多态性(SNP)的试剂盒以及PCR扩增方法，属于生物医学领域中的临床检测技术。

背景技术

华法林是临床上广泛使用的一种双香豆素衍生物类口服抗凝药，通过干扰环氧化型维生素K与氢醌型维生素K之间的转化循环而产生抗凝效应。主要用于预防和治疗血栓性疾病如血栓栓塞性静脉炎、肺梗塞、心房纤颤等，在外科心脏瓣膜置换术、血管移植术等术后也需要常规服用华法林，特别是人工机械瓣膜置换术后患者需终生服用。但华法林的有效治疗范围较窄且不同个体之间给药剂量存在较大的差异，除了受患者年龄、性别、体重、体表面积、营养状态、肝肾功能、饮食及使用药物等临床因素的影响外，华法林的靶酶VKORC1和用药剂量酶CYP2C9的基因遗传多态性是影响华法林用药剂量差异性的主要因素，而当前确定华法林需求剂量时无法考虑遗传因素的影响，常常造成患者严重的出血并发症。

华法林是维生素K环氧化物还原酶(VKOR)的特异性抑制剂，VKOR主要由维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1(VKORC1)基因编码，该基因位于染色体16p11.2，全长约4kb；VKOR可使无活性的环氧化型维生素K转变为有活性的氢醌型维生素K，氢醌型维生素K是γ-谷氨酰基羧化酶(GGCX)的必要辅助因子，凝血因子II、VII、IX、X、蛋白质C和蛋白质S经过GGCX的羧化作用后而活化，进而发生一系列级联反应引起血液凝固。大量研究发现，在VKORC1编码区和非编码区存在大量的多态性位点，其中VKORC1启动子的基因多态性(-1639G/A)是影响华法林需求剂量中种族差异和个体差异的最主要因素，其机制是启动子多态现象改变了能够影响启动子转录活性的E-盒(CANNTG)共有序列。研究表明，G基因的VKORC1启动子活性比A基因的启动子活性高出44％。GG基因型的个体VKORC1启动子活性增高，引起VKORC1 mRNA表达增加，VKOR生成也相应增多。VKOR增多，有活性的氢醌型维生素K生成和凝血因子生成也增加，因此需要较高剂量的华法林才能达到抗凝效果；而启动子区域-1639G＞A的突变可引起VKOR mRNA的表达下降，从而使肝脏中VKOR的生成也相应地减少，进而引起环氧化型维生素K还原成氢醌型维生素K减少，此时只需要很少剂量的华法林就能达到抗凝效果，最终导致患者对华法林敏感；其中华法林敏感者(≤1.5mg/d)的基因型为纯合子AA，而华法林抵抗者(≥6.0mg/d)则为基因型AG或者GG。

华法林在体内的用药剂量主要是通过肝脏细胞色素氧化酶P450(CYP)系，华法林含S型和R型2种异构体，S型主要经肝脏CYP2C9用药剂量，R型由CYP3A4用药剂量，其中S型华法林的抗凝活性比R型华法林强3～5倍，因此CYP2C9是影响华法林用药剂量的主要酶之一。CYP2C9是CYP系统的亚家族，该酶的基因位于染色体10q24.2上，全长约55kb，含有8个内含子，9个外显子(mRNA长1.47kb)，编码490个氨基酸残基、分子量为55kD的蛋白质，它是人类肝脏中一种重要的药物用药剂量酶，大约10％的临床常用药物由CYP2C9氧化用药剂量，人类的CYP2C9基因同样具有遗传多态性，其中与亚洲人群最为密切的是CYP2C9基因第7外显子的第1075位核苷酸存在A/C多态(1075A/C)，导致多肽链第359位氨基酸Ile被Leu取代，突变后其编码的酶活性比野生型降低了80％，导致CYP基因突变个体对华法林的用药剂量能力以及清除能力大大降低，从而导致患者对华法林敏感，携带CYP2C9突变基因的个体在使用华法林的初期就有较高的出血危险性。

综上所述，VKORC1(-1639G/A)和CYP2C9(1075A/C)基因多态性是导致华法林需求剂量民族差异和个体差异的重要因素；国人VKORC1(-1639)等位基因G和A频率分别为14％和86％，以AA和AG型为主，GG型少见；CYP2C9(1075)等位基因A和C频率分别为95％和5％，以AA和AC型为主，CC型罕见。因此，VKORC1(-1639)G→A、CYP2C9(1075)A→C的变异均可导致患者华法林用量的显著减少。

然而，目前检测与华法林用药剂量相关的基因遗传多态性的方法比较单一，常规是首先从患者体内抽取全血，提取DNA，扩增VKORCI启动区域DNA片段，再进行DNA测序，最终得到相应的结果，这种常规检测SNP位点的方法虽然可以达到检测的目的，但试验周期长、步骤过于繁琐、不能及时得到结果和不能迅速做出医疗诊断的同时还给患者以及医疗单位带来较大经济支出；还有应用较广的方法为限制性内切酶酶解片段长度多态性，这一方法具有简便、经济和可靠的特点，但这一方法的显著弱点是难以直接应用于高通量平行分析；普通PCR技术采用一对普通引物和低保真Taq酶进行PCR扩增，得到的结果特异性不高，常常造成假阳性。这三种方法都无法满足后基因时代对VKORC1(-1639G/A)和CYP2C9(1075A/C)SNP位点分析的要求。

发明内容

华法林的靶酶VKORC1和代谢酶CYP2C9的基因遗传多态性分别所起的重要作用已经被我们所认识，二者的基因突变直接或间接影响华法林在体内的代谢过程和抗凝效果。本发明提供一种检测影响临床华法林个体化用药剂量的维生素K环氧化物还原酶复合物1基因VKORC1(-1639G/A)与细胞色素P450酶2C9基因CYP2C9(1075A/C)的单核苷酸多态性(SNP)的试剂盒及其PCR扩增方法，目的是解决现有用PCR扩增方法检测VKORC1(-1639G/A)和CYP2C9(1075A/C)的SNP位点时价格昂贵、低效率低通量以及特异性不高的问题。

为达到上述目的，本发明采用的第一种技术方案是：一种检测华法林个体化用药相关基因单核苷酸多态性位点的试剂盒，所述试剂盒包括检测基因VKORC1(-1639G/A)SNP位点的两个正向引物以及一个反向引物和/或检测基因CYP2C9(1075A/C)SNP位点的两个正向引物以及一个反向引物；所述检测基因VKORC1(-1639G/A)SNP位点的两个正向引物以及一个反向引物的碱基序列如下所示：

正向引物：5’-CCTGAAAAACAACCATTGGTCG-3’(VKORC1-1639Gss)；

          5’-CCTGAAAAACAACCATTGGTCA-3’(VKORC1-1639Ass)；

反向引物：5’AGTTTGGACTACAGGTGCCTG-3’(VKORC1-1639R)；

所述检测基因CYP2C9(1075A/C)SNP位点的两个正向引物以及一个反向引物的碱基序列如下所示：

正向引物：5’-TGCACGAGGTCCAGAGATACAT-3’(CYP2C9 1075Ass)；

          5’-TGCACGAGGTCCAGAGATACCT-3’(CYP2C9 1075Css)；

反向引物：5’-ACTGGAAACAAGAGAAAGTCCA-3’(CYP2C9 1075R)；

其中，所述正向引物的3’端-1，-2，-3位碱基之间硫代磷酸化修饰。

为达到上述目的，本发明采用的第一种技术方案是：一种检测华法林个体化用药相关基因单核苷酸多态性位点的PCR扩增方法，

预变性的条件为：温度为95℃，时间为5分钟；

PCR扩增由第一阶段和第二阶段构成：

第一阶段由15次扩增循环构成，其条件为：

变性：温度为95℃，时间为30秒；

退火：起始温度为68℃，每一次扩增循环温度递减1℃，直至扩增循环结束，时间为30秒；

延伸：温度为72℃，时间为30秒；

第二阶段由25次扩增循环构成，其条件为：

变性：温度为95℃，时间为30秒；

退火：温度为58℃，时间为30秒；

延伸：温度为72℃，时间为30秒；

终延伸的条件为：温度为72℃，时间为10分钟。

上述技术方案中的有关内容解释如下：

1、上述技术方案中：所述引物(primer)是PCR(聚合酶链式反应)技术中重要的组成部分，它是一小段单链DNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯键形式进行合成，因此引物的3′-OH必须是游离的。

2、上述方案中，所述硫代磷酸化修饰是指在普通引物合成的基础上，3′端两个单核苷酸之间二酯键上的-OH被-SH所取代，从而达到耐核酸外切酶消化的效果。

本发明工作原理是：PCR(polymerase chain reaction)扩增是一种体外扩增DNA片段的方法，即聚合酶链式反应方法。采用这种方法，在反应系统中只要有一个拷贝的待扩增DNA片段，在短时间内就能扩增出大量拷贝数的特异性DNA片段。该方法广泛应用于基因检测。PCR扩增的基本原理是：模仿细胞内发生的DNA复制过程，以DNA互补链聚合反应为基础，通过靶DNA变性、引物与模板DNA(待扩增DNA)一侧的互补序列退火复性、耐热性DNA聚合酶催化引物延伸等过程的多次循环，产生待扩增的特异性DNA片段。由于上一次循环合成的两条互补链均可作为下一次循环的模板DNA链，所以每循环一次，底物DNA的拷贝数增加一倍，因此PCR经过n次循环后，理论上，待扩增的特异性DNA片段可达到2ⁿ个拷贝数。TouchdownPCR，即降落PCR。是优化和改良后的一种PCR方法，指每一个(或n个)循环降低1℃(或n℃)退火温度，直至达到一个较低的退火温度(touchdown退火温度)。然后以此温度进行多个循环。正确和非正确退火温度1℃差异将造成PCR产物量4倍的差异，如果相差n℃，就会产生4的n次方倍的优势，因此，相对于非正确产物，正确产物可以得到大量的富集。退火温度起始在高于计算的Tm值15℃左右，再接下来的循环中，退火温度以每次1-2℃逐渐降低，直到Tm值以下5℃，当达到特异的引物-模板结合的Tm值时，扩增就会开始。当退火温度降到非特异扩增发生的水平时，特异产物会在与非特异扩增的竞争中胜出，成为主导的扩增产物避免非特异扩增产物的出现。此扩增方法有利于PCR产物的纯化和假阳性的降低。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：

1、本发明采用特殊设计的引物，并且在其引物的3′端用双硫代磷酸化修饰，其PCR产物特异性非常高。利用该检测方法，在完成PCR反应和凝胶电泳后，可通过直接观察产物的有无来判断VKORC1和CYP2C9的基因型以及检测基因VKORC1(-1639G/A)与CYP2C9(1075A/C)的SNP位点。

2、本发明采用特殊的PCR程序，大大减少了由于Tm值太低而导致的引物与模板在错误位点的结合，从而提高了PCR效率和灵敏度，为临床华法林用药剂量提供可靠的依据。

3、本发明经济，不需测序，在节省了大量资本的同时，大大缩短了试验周期，提高了实验效率。

4、本发明的试剂盒，可以实现高效率高通量VKORC1(-1639G/A)与CYP2C9(1075A/C)的SNP位点检测，从而达到对华法林剂量量化的控制，甚至对血栓性疾病的预防、抗凝药物的选择、新抗凝药的研发、血栓性的疾病预后也起到一定的作用。

附图说明

附图1为采用试剂盒中的检测基因VKORC1(-1639G/A)SNP位点的两个正向引物以及一个反向引物检测三个样品得到凝胶电泳图。

附图2为附图1中所示的左侧样品DNA测序图。

附图3为附图1中所示的中间样品DNA测序图(采用反向引物)。

附图4为附图1中所示的右侧样品DNA测序图(采用反向引物)。

附图5为采用试剂盒中的检测基因CYP2C9(1075A/C)SNP位点的两个正向引物以及一个反向引物检测三个样品得到凝胶电泳图。

附图6为附图5中所示的左侧样品DNA测序图。

附图7为附图5中所示的中间样品DNA测序图。

附图8为附图5中所示的中间样品DNA测序图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：一种检测华法林个体化用药相关基因单核苷酸多态性位点的试剂盒包含：10×PCR Buffer、dNTP(2.5mM)、Pfu DNA聚合酶(2.5U/μl)以及引物(各10mM)。

检测基因VKORC1(-1639G/A)的SNP位点的引物的碱基序列如下所示：

正向引物：CCTGAAAAACAACCATTGGTCG(VKORC1-1639Gss)；

          CCTGAAAAACAACCATTGGTCA(VKORC1-1639Ass)；

反向引物：AGTTTGGACTACAGGTGCCTG (VKORC1-1639R)。

检测基因CYP2C9(1075A/C)SNP位点的引物的碱基序列如下所示(5’→3’)：

正向引物：TGCACGAGGTCCAGAGATACAT(CYP2C9 1075Ass)；

          TGCACGAGGTCCAGAGATACCT(CYP2C9 1075Css)；

反向引物：ACTGGAAACAAGAGAAAGTCCA(CYP2C9 1075R)。

四个正向引物的3’端-1，-2，-3位碱基之间均进行硫代磷酸化修饰。

实施例二：一种检测华法林个体化用药相关基因单核苷酸多态性位点的试剂盒采用的PCR扩增方法

包括下列步骤：

第一步：准备DNA

(1)、从患者甲抽取血液样本。

(2)、从血液样本中获取DNA，我们采用上海生物工程技术有限公司生产的UNIQ-10试剂盒进行提取。

从患者甲的血样中获取DNA过程：

a.取500ul已加入ACD(0.48％Citric Acid(柠檬酸)；1.32％SodiumCitrate(柠檬酸钠)；1.47％Glucose(葡萄糖))抗凝剂的血样。

b.500ul血样中加入1ml无菌水，5000转/分，离心两分钟去上清，用200ulTE将白细胞悬浮起来。

c.在b步骤制备的200ul样品中，加入200ul Digestion Buffer混匀，再加入20ul的Proteinase K(蛋白酶K)(10mg/ml)，混匀，55℃保存30分钟。

d.加入200ul BD Buffer，70℃孵育10分钟。

e.加入200ul无水乙醇，混匀，然后用1-ml Tip头将样品全部转移到UNIQ-10柱，柱子放入2.0-ml Collection Tube。

f.用台式离心机，10000转/分，室温离心1分钟。

g.取下UNIQ-10柱，弃去Collection Tube中的废液。将柱子放回同一根Collection Tube中，加入500ul PW Solution，10000转/分，室温离心1分钟。

h.取下UNIQ-10柱，弃去Collection Tube中的废液。将柱子放回同一根Collection Tube中，加入500ul Wash Solution，10000转/分，室温离心1分钟。

i.取下UNIQ-10柱，弃去Collection Tube中的全部废液。将柱子放回同一根Collection Tube中，10000转/分，室温离心1分钟以除去残留的WashSolution。

j.将柱子放入新的无菌的1.5ml离心管中，在柱子中央加入50ul 60度预热的Elution Buffer，室温放置5分钟。

k.10000转/分，室温离心1分钟，离心管中的液体即为血液中基因组DNA。

第二步：对DNA进行扩增

PCR扩增进行两次，分别采用检测基因VKORC1(-1639G/A)的SNP位点的引物和检测基因CYP2C9(1075A/C)SNP位点的引物，PCR扩增的方法相同：

采用30ng/50ul的反应体系，具体操作为：

1、将上述一系列引物分别与获取的血液基因组DNA、4种碱基、PCR反应缓冲液、高保真Pfu DNA聚合酶、去离子水按一定比例混合构成单独的反应体系，具体见下表：

ddH2O	39μl
		10×PCR Buffer	5μl
dNTP(2.5mM)	4.0μl
		引物(各10mM)	各0.8μl
Pfu DNA聚合酶(2.5U/μl)	0.2μl
		基因组DNA(约60ng/μl)	0.5μl

2、对上述反应体系进行PCR循环，PCR循环条件见下表：

第三步：凝胶电泳

采用凝胶电泳系统对上述DNA扩增后的体系做凝胶电泳，得到的凝胶电泳图如附图1的左侧所示。

第四步：观测结果

采用检测基因VKORC1(-1639G/A)的SNP位点的引物得到的凝胶电泳如附图1的左侧所示，只在Ass泳道中有产物，说明患者是VKORC1(-1639A/A)突变纯合子，患者对华法林极为敏感，该患者甲在使用华法林时应降低剂量。该结果可以通过DNA测序图附图2证实(采用正向引物测序)。

采用检测基因CYP2C9(1075A/C)SNP位点的引物得到的凝胶电泳如附图5的左侧所示，只在Ass泳道中有产物，，说明患者是CYP2C9-1075A/A野生纯合子，患者对华法林的代谢能力正常，患者不对华法林敏感。该结果可以通过DNA测序图附图6证实(采用正向引物测序)。

实施例三：一种检测华法林个体化用药相关基因单核苷酸多态性位点的试剂盒采用的PCR扩增方法

血液样本是从患者乙抽取。其他的实验条件均与实施例二相同。

结果是：采用检测基因VKORC1(-1639G/A)的SNP位点的引物得到的凝胶电泳如附图1的中间所示，在Ass和Gss泳道中都有产物，说明患者是VKORC1(-1639A/G)突变杂合子，患者对华法林较为敏感，该患者在使用华法林时应适当降低剂量。该结果可以通过DNA测序图附图3证实(采用反向引物测序)。

采用检测基因CYP2C9(1075A/C)SNP位点的引物得到的凝胶电泳如附图5的中间所示，只在Ass泳道中有产物，，说明患者是CYP2C9(1075A/A)野生纯合子，患者对华法林的代谢能力正常，患者不对华法林敏感。该结果可以通过DNA测序图附图7证实(采用正向引物测序)。

实施例四：一种检测华法林个体化用药相关基因单核苷酸多态性位点的试剂盒采用的PCR扩增方法

血液样本是从患者丙抽取。其他的实验条件均与实施例二相同。

结果是：采用检测基因VKORC1(-1639G/A)的SNP位点的引物得到的凝胶电泳如附图1的右侧所示，只在Gss泳道中有产物，说明患者是VKORC1(-1639G/G)野生纯合子，患者对华法林耐药，该患者在使用华法林时必须加大剂量。该结果可以通过DNA测序图附图4证实(采用反向引物测序)。

采用检测基因CYP2C9(1075A/C)SNP位点的引物得到的凝胶电泳如附图5的右侧所示，只在Ass泳道中有产物，，说明患者是CYP2C9(-1075A/A)野生纯合子，患者对华法林的代谢能力正常，患者不对华法林敏感。该结果可以通过DNA测序图附图8证实(采用正向引物测序)。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种用于华法林个体化用药相关基因SNP位点检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括检测基因VKORC1-1639G/A SNP位点的两个正向引物以及一个反向引物；所述检测基因VKORC1-1639G/A SNP位点的两个正向引物以及一个反向引物的碱基序列如下所示：

正向引物：5’-CCTGAAAAACAACCATTGGTCG-3’；

5’-CCTGAAAAACAACCATTGGTCA-3’；

反向引物：5’AGTTTGGACTACAGGTGCCTG-3’；

其中，所述正向引物的3’端-1，-2，-3位碱基之间进行硫代磷酸化修饰。

2.一种采用权利要求1所述试剂盒的PCR扩增方法，其特征在于：

预变性的条件为：温度为95℃，时间为5分钟；

PCR扩增由第一阶段和第二阶段构成：

第一阶段由15次扩增循环构成，其条件为：

变性：温度为95℃，时间为30秒；

退火：起始温度为68℃，每一次扩增循环温度递减1℃，直至扩增循环结束，时间为30秒；

延伸：温度为72℃，时间为30秒；

第二阶段由25次扩增循环构成，其条件为：

变性：温度为95℃，时间为30秒；

退火：温度为58℃，时间为30秒；

延伸：温度为72℃，时间为30秒；

终延伸的条件为：温度为72℃，时间为10分钟。

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