CN101240317A - 一种检测个体胰岛素抵抗遗传易感性的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测个体胰岛素抵抗遗传易感性的试剂盒。该试剂盒包括同时检测编码脂联蛋白的C1Q和胶原结构域基因(ADIPOQ)上rs2241766号SNP位点、编码单核细胞和巨噬细胞所产生的肿瘤坏死因子－α基因(TNF－α)上rs1800629号SNP位点、编码白细胞介素－6基因(IL－6)上rs1800795号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、用于荧光定量PCR检测的常规组件等。本发明的试剂盒通过同时检测与胰岛素抵抗遗传易感性密切相关的ADIPOQ、TNF－α、IL－6三种基因上的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体胰岛素抵抗遗传易感性。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体胰岛素抵抗遗传易感性的试剂盒，通过同时检测与胰岛素抵抗遗传易感性密切相关的编码脂联蛋白的C1Q和胶原结构域(ADIPOQ)、编码单核细胞和巨噬细胞所产生的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和编码白细胞介素-6(IL-6)的三种基因上的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体胰岛素抵抗遗传易感性。
背景技术
糖尿病是一种十分常见的代谢系统疾病。2型糖尿病患者中，多数存在胰岛素抵抗(IR)。大量研究表明：IR早于糖尿病发生的10～20年，表现为不同程度的高胰岛素血症、肥胖及收缩压升高；若病情继续发展，将出现糖耐量异常，患者主要表现为大血管病变、微量蛋白尿、餐后高血糖及高胰岛素血症；而当出现糖尿病时，则出现空腹和餐后高血糖，并伴有微血管及大血管并发症。目前，胰岛素抵抗问题，已日益受到关注。
胰岛素抵抗问题的发生，是由生活习惯等外界因素和遗传体质共同决定的，不同的人在相同的环境下，发生胰岛素抵抗的可能性不同，因此采取的预防措施也不同，利用现代科学研究成果，开发一项基于分子遗传基础的胰岛素抵抗风险评估产品将对胰岛素抵抗的发生起到预警、个性化防治作用，具有很强的社会意义和市场前景。
目前对涉及胰岛素抵抗通路的一些基因已经进行了大量研究。其作用机制、生化功能、通路情况、调控、转录等等方面都有明确可靠的研究结果；已经有可靠的检测方法、仪器设备和检测试剂等。
目前，已知，编码脂联蛋白的C1Q和胶原结构域(ADIPOQ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的三种基因与胰岛素抵抗有密切关系。
ADIPOQ为脂联蛋白的C1Q和胶原结构域编码基因，它编码一种在结构上与胶原X和VIII以及补体C1q类似的蛋白质。这种基因主要在脂肪组织中表达，所编码的蛋白质在血液中循环，并且和代谢以及激素产生过程有关。它的突变或异常表达等都会引起胰岛素等代谢综合症。研究表明ADIPOQ3号外显子的变异与基因本身的表达及其产物的水平有密切关系。研究表明rs2241766(G129T)为该外显子上的同义突变，其所改变的密码子频率可影响基因表达水平，并且与胰岛素抵抗有关。通过大量关联性分析表明，脂联素基因外显子Gly15Gly多态性与2型糖尿病相关，GG基因型者具有2型糖尿病高易感性。
TNF-α全称肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α)，为编码单核细胞和巨噬细胞所产生的肿瘤坏死因子的基因，由该基因编码的蛋白是一种多功能的细胞因子，它能显著诱导巨噬细胞以抑制细菌生长，诱导多种细胞因子产生间接调节免疫细胞的活性，增强特异性免疫保护功能。国内外的众多研究表明TNF-α基因上的多态现象与胰岛素，过氧化脂质，血脂，血糖，瘦素等因素相关。TNF-α基因的缺陷可以直接导致炎症，并大大提高糖尿病、骨疾病、肿瘤、冠心病的患病机率。TNF-α位于第六号染色体6p21.3位置，基因全长2.8kb，mRNA全长1669bp，共有4个外显子，编码234aa的蛋白。TNF-α是一种分子量为25kD的膜蛋白，并以17kD大小存在于循环中。rs1800629是位于第六号染色体上TNF-α基因启动区一个G/A多态，研究表明其与胰岛素抵抗的发生发展、糖尿病的发病有关。通过大量关联性分析表明，TNF-a导致胰岛素抵抗的机制之一是脂肪分解增强，FFA释放增多，该基因变异所导致的脂肪分解差异可能是群体中胰岛素抵抗程度变异的机制。
IL-6是一种前炎性细胞因子，它可由多种细胞产生，基础状态下血浆中IL-6水平主要来自脂肪组织分泌，作为一种自分泌、旁分泌和内分泌激素刺激肝细胞生成多种急性时相的蛋白质调节机体免疫，参与体内的脂肪、葡萄糖等能量代谢，诱导胰岛素抵抗，破坏胰岛B细胞，在糖尿病发生发展中起着重要作用。人IL-6基因定位于7p21，全长4.8kb，由5个外显子，4个内含子组成，mRNA全长1125bp，编码213个氨基酸。IL-6是一种多功能细胞因子，参与多种细胞的生长、分化和功能调节，在免疫和炎症反应中具有重要作用，是机体重要的免疫-神经-内分泌调节因子。近年发现其除可由免疫细胞和免疫辅助细胞产生外，尚可由非免疫细胞，一些典型的内分泌细胞，如脂肪细胞等分泌，且在糖脂代谢中起作用，现认为其是一种具有内分泌性质的细胞因子，可能导致胰岛素抵抗。IL-6基因具有许多单核苷酸多态性位点：例如启动子区位点G572C、G573C、C634G、G174C、G597A等；IL-6基因还有许多5’侧翼区域及3’侧翼区域数目变异串联重复等多态性。一些报道认为，IL-6基因调节区-174位的G/C变异(rs1800795)可能改变IL-6的转录，是导致血清与组织中IL-6高水平表达的主要原因，并且可能影响机体胰岛素的抵抗性，从而与糖尿病的发病有关。
发明内容
基于编码脂联蛋白的C1Q和胶原结构域(ADIPOQ)、编码单核细胞和巨噬细胞所产生的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和编码白细胞介素-6(IL-6)的三种基因上的3个SNPs位点多态性可用来评估个体胰岛素抵抗遗传易感性的基础上，本发明提供一种检测个体胰岛素抵抗遗传易感性的试剂盒。
该试剂盒包括：
检测ADIPOQ基因上rs2241766号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；
检测TNF-α基因上rs1800629号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；
检测IL-6基因上rs1800795号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对；
荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离子水等)。
本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对ADIPOQ基因上rs2241766号SNP位点、TNF-α基因上rs1800629号SNP位点、IL-6基因上rs1800795号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含这3个SNPs位点的DNA片段的引物对。设计这类引物对是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO：1和2、3和4、5和6所示序列的引物对。特异性引物对可用常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这三对引物。
本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是指针对过ADIPOQ基因上rs2241766号SNP位点、TNF-α基因上rs1800629号SNP位点、IL-6基因上rs1800795号SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这3个SNPs位点基因型的Taqman探针对。设计这类探针是本领域技术人员能够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO：7和8、9和10、11和12所示序列的Taqman探针对。特异性荧光探针对可用常规的探针合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的特异性荧光Taqman探针对不限于这三对探针，所有可用于荧光定量PCR法检测本发明中所述用来评估个体胰岛素抵抗遗传易感性的3个SNPs位点的探针均在本发明范围内。
本发明试剂盒的组分和含量包括：
3μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液，
0.3μl 25mM dNTP混合液，
1.8μl 25mM MgCl2溶液，
0.075μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶，
20μM特异性引物对每条引物各0.225μl，
10μM特异性荧光探针对每条探针各0.25μl，
去离子水15.975μl。
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例1.检测试剂盒的使用
步骤1：DNA模板的抽取
用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。
步骤2：荧光定量PCR反应
使用可个体抗氧化遗传易感性的荧光定量PCR检测试剂盒，其中，含有下列引物对和荧光探针对：
有义引物1：5’-TTCTACTGCTATTAGCTC-3’(SEQ ID NO：1)
反义引物1：5’-CTTGAGTCGTGGTTT-3’(SEQ ID NO：2)
有义引物2：5’-GAGGCAATAGGTTTTGAGGG-3’(SEQ ID NO：3)
反义引物2：5’-GGACCCTGGAGGCTGAA-3’(SEQ ID NO：4)
有义引物3：5’-ACTTTTCCCCCTAGTTG-3’(SEQ ID NO：5)
反义引物3：5’-TGTGCAATGTGACGTC-3’(SEQ ID NO：6)
带VIC荧光基团探针1：5’-CGGgCATGAC-3’(SEQ ID NO：7)
带FAM荧光基团探针1：5’-CGGtCATGAC-3’(SEQ ID NO：8)
带VIC荧光基团探针2：5’-CATGaGGACGG-3’(SEQ ID NO：9)
带FAM荧光基团探针2：5’-CATGgGGACG-3’(SEQ ID NO：10)
带VIC荧光基团探针3：5’-CTTGCcATGCTAAA-3’(SEQ ID NO：11)
带FAM荧光基团探针3：5’-CTTGCgATGCTAAA-3’(SEQ ID NO：12)
有义引物1，反义引物1、带VIC荧光基团探针1、带FAM荧光基团探针1特异地针对检测ADIPOQ基因上rs2241766号SNP位点多态性；
有义引物2，反义引物2、带VIC荧光基团探针2、带FAM荧光基团探针2特异地针对检测TNF-α基因上rs1800629号SNP位点多态性；
有义引物3，反义引物3、带VIC荧光基团探针3、带FAM荧光基团探针3特异地针对检测IL-6基因上rs1800795号SNP位点多态性；
3个SNPs位点分别进行3次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为总体积10μl，包含浓度为20ng/μl的DNA模板2μl、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液、0.1μl 25mM dNTP混合液、0.6μl 25mM MgCl2溶液、0.025μl(5units/μl)Taq DNA聚合酶、20μM的有义引物和反义引物各0.225μl、10μM的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25μl，去离子水5.325μl。
在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50℃、2分钟，95℃、10分钟，进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟。反应结束后在ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。
步骤3：SNP基因型分析
熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。
实施例2.对人们进行个体胰岛素抵抗遗传易感性检测的服务
步骤1：DNA提取
由医院检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
步骤2：基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检测者基因组DNA的ADIPOQ基因上rs2241766号SNP位点、TNF-α基因上rs1800629号SNP位点、IL-6基因上rs1800795号SNP位点分别进行荧光定量PCR检测，确定这3个SNPs位点的基因型。
步骤3：个体胰岛素抵抗遗传易感性的分析
通过对被检测者SNPs基因型的分析，出具个体胰岛素抵抗遗传易感性的分析报告单。报告中详细说明了被检测者胰岛素抵抗遗传易感性的高低，并由医师向被检者详细说明和解读个体胰岛素抵抗遗传易感性分析报告单。
序列表
<110>上海主健生物工程有限公司
<120>一种检测个体胰岛素抵抗遗传易感性的试剂盒
<160>12
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
TTCTACTGCT ATTAGCTC 18
<210>2
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
CTTGAGTCGT GGTTT 15
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
GAGGCAATAG GTTTTGAGGG 20
<210>4
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
GGACCCTGGA GGCTGAA 17
<210>5
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
ACTTTTCCCC CTAGTTG 17
<210>6
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
TGTGCAATGT GACGTC 16
<210>7
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>7
CGGgCATGAC 10
<210>8
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>8
CGGtCATGAC 10
<210>9
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>9
CATGaGGACG G 11
<210>10
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>10
CATGgGGACG 10
<210>11
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>11
CTTGCcATGC TAAA 14
<210>12
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>12
CTTGCgATGC TAAA 14
Claims (6)
1. 一种检测个体胰岛素抵抗遗传易感性的试剂盒，其特征在于：包括同时检测编码脂联蛋白的C1Q和胶原结构域基因(ADIPOQ)上rs2241766号SNP位点、编码单核细胞和巨噬细胞所产生的肿瘤坏死因子-α基因(TNF-α)上rs1800629号SNP位点、编码白细胞介素-6基因(IL-6)上rs1800795号SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的特异性引物对是指针对ADIPOQ基因上rs2241766号SNP位点、TNF-α基因上rs1800629号SNP位点、IL-6基因上rs1800795号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含这3个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的特异性荧光探针对是指针对ADIPOQ基因上rs2241766号SNP位点、TNF-α基因上rs1800629号SNP位点、IL-6基因上rs1800795号SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这3个SNPs位点基因型的Taqman探针对。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所含的特异性引物对选自具有SEQ ID NO：1和2、3和4、5和6所示序列的引物对。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所含的特异性荧光探针选自具有SEQ ID NO：7和8、9和10、11和12所示序列的Taqman探针对。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒的组分和含量包括3μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液，0.3μl 25mM dNTP混合液，1.8μl 25mM MgCl2溶液，0.075μl (5units/μl)Taq DNA聚合酶，20μM特异性引物对每条引物各0.225μl，10μM特异性荧光探针对每条探针各0.25μl，去离子水15.975μl。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20℃。
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-
2007
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Assignee: Shanghai Rongjian Bio-Technology Co., Ltd. Assignor: Shanghai Zhujian Bioengineering Co., Ltd. Contract fulfillment period: 2008.9.1 to 2013.9.1 Contract record no.: 2008310000235 Denomination of invention: Kit for detecting individual insulin resistance inheritance susceptibility License type: exclusive license Record date: 20081124 |
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| LIC | Patent licence contract for exploitation submitted for record |
Free format text: EXCLUSIVE LICENSE; TIME LIMIT OF IMPLEMENTING CONTACT: 2008.9.1 TO 2013.9.1; CHANGE OF CONTRACT Name of requester: SHANGHAI RONGJIAN BIOISYSTECH CO., LTD. Effective date: 20081124 |
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| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: HAINAN ZHUJIAN BIOLOGY MEDICINE SCIENCE AND TECHNO Free format text: FORMER OWNER: SHANGHAI ZHUJIAN BIOLOGICAL ENGINEERING CO., LTD. Effective date: 20091204 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20091204 Address after: Room 38, No. 1006 Datong Road, Hainan, Haikou Applicant after: Hainan Zhujian Biotechnology Co., Ltd. Address before: Floor 2, building 335, No. 6, National Road, Shanghai Applicant before: Shanghai Zhujian Bioengineering Co., Ltd. |
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| C57 | Notification of unclear or unknown address | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Zhang Cunli Document name: Notification of Passing Examination on Formalities |
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| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Zhang Cunli Document name: Notification that Application Deemed to be Withdrawn |
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080813 |