CN107674878B - 一种与猪免疫性状相关的分子标记克隆与应用 - Google Patents

一种与猪免疫性状相关的分子标记克隆与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于猪分子标记筛选技术领域，具体涉及CPE基因片段作为猪免疫性状的分子标记及应用。所述的分子标记从猪CPE基因序列中克隆得到。本发明筛选得到一种与猪免疫性状相关的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在该序列的第57位碱基处存在一个G/A的等位基因突变，该突变导致Sequenom

Description

一种与猪免疫性状相关的分子标记克隆与应用
技术领域
本发现属于猪的分子标记筛选技术领域，具体涉及一种与猪免疫性状相关的分子标记克隆与应用。
背景技术
猪病已经成为当前制约养猪业健康发展的关键因素之一，尤其是伴随规模化猪场的普及，对疫病的防治成为生猪养殖过程中的主要任务。但是由于对某些疫病控制能力弱，疾病检测、诊断、预防和扑灭等措施处理不当，造成猪病频发。疾病的爆发可直接导致生猪的死亡，出栏率降低，进而影响生猪养殖的经济效益。同时为了预防和治疗疾病而大量使用药物增加了养殖成本和药物残留，残留的药物对生态环境造成一定程度的破坏。而抗生素的滥用不仅导致病菌出现耐药性，增加了养殖场疾病防治的难度，而且还造成猪肉食品存在安全隐患。因此在生猪养殖过程中的疾病防控，直接关系到这一产业的发展和猪肉食品市场。尽量避免大量使用药物，寻找抗病新策略，从培育抗病品系入手，是改善养猪行业行情的热门研究方向。
研究表明免疫与生长之间存在负相关(唐国庆等,猪抗病育种研究进展.中国畜牧兽医,2002,29(6):29-32；严燕等,猪遗传抗性与抗病育种研究进展.猪业科学,2007,6:58-61.)，而在中外猪种中用于检测免疫指标的因子存在显著差异(刘筱等,猪Toll样受体4基因(TLR4)外显子SNP检测及生物信息学分析.江苏农业学报,2011,27(4):782-789；董文华等,猪CD14基因多态性及其对部分免疫指标的遗传效应分析.中国畜牧杂志,2014,50(13):1-5.)，且在一定程度上可以反映机体的生长状态。因此可以筛选与免疫性状关联的基因作为检测免疫性状的遗传标记。
大量文献报道羧肽酶E(Carboxypeptidase E:CPE)基因参与调控机体的生长及免疫。CPE基因编码金属羧肽酶M14家族的一员，属于金属羧肽酶的范畴。金属羧肽酶是一类存在于细胞外，帮助蛋白质消化，在中性或弱碱性条件下具有极大活性的羧肽酶。CPE作为金属羧肽酶的重要组成成分，主要作用是降解C-末端为精氨酸和赖氨酸的肽。在胰岛β细胞内，CPE在胰岛素原酶解为胰岛素与C肽的过程中发挥关键性作用，且该基因的突变与高胰岛素原水平密切相关，而胰岛素原作为胰岛素的前体物质在冠心病发生和发展过程具有重要作用。研究表明，CPE基因突变的小鼠会产生较为明显的高胰岛素原血症，该结果与人类中CPE基因突变导致高胰岛素原血症的结果相同，而胰岛素原血症主要是由于胰岛素基因编码突变引起，会造成机体呈现异常胰岛素病(李灿等,胰岛素基因突变与糖尿病关系的研究进展.上海交通大学学报(医学版),2013,33(3):354-358.)。CPE基因发生点突变还会造成小鼠体内CPE缺少活性，从而导致神经肽和肽激素的水平降低(Naggert JK等,Hyperproinsulinaemia in obese fat/fat mice associated with a carboxypeptidaseE mutation which reduces enzyme activity.Nat Genet,1995,10:135-142.)。CPE基因活性的丧失还会产生肥胖、不孕、焦虑、记忆障碍和海马神经元的神经退行性疾病等一系列不正常的行为或者生理状态发生错误的改变(Woronowicz等,Absence ofcarboxypeptidase E leads to adulthippocampal neuronal degeneration and memorydeficits.Hippocampus,2008,18:1051-1063；Rodriguiz RM等,Emergence of anxiety-like behaviours in depressive-like Cpefat/fat mice.Int JNeuropsychopharmacol,2013:1-2.)。另外，在人类群体中的研究发现CPE基因同样存在突变位点，但是大部分的突变为隐性突变，因此不会产生任何疾病(Utsunomiya N等,Organization of the human carboxypeptidase E gene and molecular scanning formutations in Japanese subjects with NIDDM or obesity.Diabetologia,1998,41:701-705；Chen H等,Missense polymorphism in the human carboxypeptidase E genealters enzymatic activity.Hum Mutat,2001,18:120-131.)。在癌症的早期病理阶段或者接受癌症治疗后恢复的患者中，CPE基因mRNA的表达水平可以被当做用来预测肿瘤复发的生物学标记(Huang SF等,Carboxypeptidase E is a prediction marker for tumorrecurrence in early-stage hepatocellular carcinoma.Tumour Biol,2016,37(7):9745-53；Shen HW等,CPE overexpression is correlated with pelvic lymph modemetastasis and poor prognosis in patients with early-stage cervicalcancer.Arch Gynecol Obstet,2016,294(2):332-42.)。该基因第四外显子T-C突变会发生氨基酸的转变，色氨酸转变为精氨酸，最终导致细胞中神经保护功能的丧失和神经障碍(Cong L等,A Novel Single Nucleotide T980C Polymorphism in the HumanCarboxypeptidase E Gene Results in Loss of Neuroprotective Function.PloS One,2017,12(1):e0170169.)。综上所述，CPE基因在维持机体免疫功能和参与调控机体生长的过程中发挥重要作用。
本发明申请中，申请人分析了CPE基因的第1内含子片段，鉴定了一个与猪免疫性状密切相关的功能突变位点，为猪免疫性状的标记辅助选择提供了新的SNP分子标记。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供CPE基因片段作为猪免疫性状的分子标记及应用。本发明通过PCR扩增CPE基因片段，利用Sequenom
Figure GDA0002651682190000022
SNP技术，在猪品种杜洛克×二花脸F2代群体中进行分型，分型结果与该群体的免疫指标关联分析，进而鉴定获得与猪免疫性状相关的分子标记。本发明为猪的抗病育种提供了新的分子标记资源和应用。
本发明的技术方案如下所述：
申请人通过基因克隆的方法，得到CPE基因序列，其序列如序列表SEQ ID NO：1所述。其核苷酸序列如下所述：
GAGGTAATGACCAGAAAATTGTCATAGTATTAACTTTTCTACACACAAAAAATGTCRGCTTCCTGCCCTCCCAATCTGGCACTTTGT，
上述序列的57bp碱基处的R是G或A，该突变导致Sequenom
Figure GDA0002651682190000023
SNP分型多态性。
该基因片段可以作为检测与猪免疫性状相关的分子标记。
申请人提供了一种检测如序列表SEQ ID NO：1所述的分子标记的引物对(即扩增CPE基因序列的引物对)，在该引物对的正、反向引物的起始处(即下划线所示的序列)各包含10bp的序列标签。该引物对的核苷酸序列如下所示：
正向引物：5’-ACGTTGGATGGAGGTAATGACCAGAAAATTG-3’
反向引物：5’-ACGTTGGATGACAAAGTGCCAGATTGGGAG-3’。
申请人提供了一种检测如序列表SEQ ID NO：1所述的分子标记的用于基因分型的延伸引物组合，该引物组合序列的起始处(即下划线所示的序列)各包含1bp的序列标签。该引物组合的核苷酸序列如下所示：
引物1：5’-CGGGAGGGCAGGAAGC-3’；
引物2：5’-CGGGAGGGCAGGAAGCC-3’；
引物3：5’-CGGGAGGGCAGGAAGCT-3’。
一种筛选猪免疫性状的分子标记的方法，包括下列步骤：
①提取猪耳朵组织基因组DNA并对DNA进行质量检测；
②根据SNP位点序列信息，使用Sequenom公司的引物设计软件Assay design3.1，设计PCR反应和单碱基扩增引物；
③利用Sequenom
Figure GDA0002651682190000033
SNP方法进行分型检测；
④采用SAS9.1软件进行基因型与猪免疫性状间的关联分析。
本发明分子标记可用于非诊断目的的猪免疫性状标记辅助选择中。
本发明筛选的分子标记可用于非诊断目的的对猪相关基因的基因型或与猪免疫性状之间的关联分析中，为猪免疫性状的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记资源。
与现有技术相比本发明具有的有益效果：
本发明可通过在体外采用Sequenom
Figure GDA0002651682190000032
SNP方法检测猪的基因型，作为非诊断目的的评价猪的免疫能力，与目前的PCR-RFLP、ELISA、流式细胞仪等方法相比，本发明具有简单、快捷、灵敏度高和特异性好等突出优点。
更详细的技术方案请参见说明书的《附图说明》及《具体实施方式》中的实施例。
附图说明
图1：本发明的总体技术流程示意图。
图2：本发明筛选的分子标记的核苷酸序列。
图3：本发明的分子标记SNP位点的峰图。
具体实施方式
对序列表的说明：
序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的CPE基因的第1内含子片段，即本发明筛选的分子标记的核苷酸序列。序列长度为87bp，在该序列的57位碱基处的R存在一个G/A的等位基因突变。
序列表SEQ ID NO：2是本发明克隆CPE基因的第1内含子序列和分子标记的正向引物序列。
序列表SEQ ID NO：3是本发明克隆CPE基因的第1内含子序列和分子标记的反向引物序列。
序列表SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6是检测序列表SEQ ID NO：1的Sequenom
Figure GDA0002651682190000041
SNP多态性的延伸引物序列组合。
实施例1：基因分型检测
(1)利用苯酚抽提法提取杜洛克猪×二花脸猪F2代群体的耳朵组织DNA
1)将杜洛克×二花脸F2代群体(广东华农温氏畜牧股份有限公司提供)的耳样组织在液氮中磨碎，加入等体积1×SET(1mL)，蛋白酶K(10ng/mL)至终浓度200ug/mL，十二烷基硫酸钠(即SDS，10％)至终浓度0.5％，摇匀。55℃水浴温育过夜消化。
2)将消化后的组织样加入等体积的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管15min，于低温冷冻离心机中4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清液转移至另一离心管中，标上相应记号。
3)加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比25：24：1)，缓慢颠倒离心管10min，于低温离心机中4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清，转移至另一个干净的离心管中。
4)加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24：1)，缓慢颠倒离心管10min，于低温冷冻离心机中4℃、11000rpm离心10min。
5)将上清液吸入标记好的的离心管中，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，即可以看到白色絮状DNA。
6)用枪头将DNA沉淀挑出，置于装有对应号码的EP管中，室温下让乙醇挥发干净，加入适量的超纯水(一般300ul左右)溶解DNA。
7)在DNA浓度测定仪上测定其浓度与纯度，并在1％琼脂糖凝胶80伏电泳约2h，紫外灯下检测提取的DNA质量。
(2)引物设计
根据SNP位点序列信息，以猪CPE基因(ENSSSCG00000008854)第1内含子序列为模板，使用Sequenom公司的引物设计软件Assay design3.1，设计PCR反应和单碱基扩增引物。
PCR扩增引物(引物序列的前10个碱基为标签序列，见下划线所示的序列)：
正向引物：5’-ACGTTGGATGGAGGTAATGACCAGAAAATTG-3’
反向引物：5’-ACGTTGGATGACAAAGTGCCAGATTGGGAG-3’。
PCR产物延伸引物组合(引物序列的第1个碱基为标签序列，见下划线所示的序列)：
引物1：5’-CGGGAGGGCAGGAAGC-3’(如序列表SEQ ID NO：4所示序列对应)；
引物2：5’-CGGGAGGGCAGGAAGCC-3’(如序列表SEQ ID NO：5所示序列对应)；
引物3：5’-CGGGAGGGCAGGAAGCT-3’(如序列表SEQ ID NO：6所示序列对应)。
(3)PCR扩增
反应体系(384孔PCR版+38％的试剂损耗)，见表1。
表1 PCR反应体系-1
Figure GDA0002651682190000051
扩增条件：94℃预变性900s，(94℃变性20s、56℃退火30s、72℃延伸60s)45个循环，72℃延伸180s，4℃终止反应。将PCR产物进行碱性磷酸酶处理。
(4)碱性磷酸酶(SAP)消化：
反应体系(384孔PCR板+38％的试剂损耗)，见表2。
表2 PCR反应体系-2
Figure GDA0002651682190000052
扩增条件：37℃40min，85℃5min，4℃终止反应，将PCR产物进行延伸反应。
(5)延伸反应：
反应体系(384孔PCR板+38％的试剂损耗)，见表3。
表3 PCR反应体系-3
Figure GDA0002651682190000061
扩增条件：94℃预变性30s，{94℃变性5s，(52℃退火5s，80℃延伸5s)5个循环}40个循环，72℃延伸180s，4℃终止反应。将PCR产物进行上机检测。
(6)上机检测：
A)将反应产物(共9μL)稀释3倍，按常规方法，使用树脂进行脱盐。
B)将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶。
C)上机进行质谱检测，并收集数据。
根据收集数据统计基因型分型检测结果。基因型检测结果表明，在384个样品中检测出382个样品，检出率99.48％。其中在382个个体中AA基因型有74个个体，占19.37％；GG基因型有111个个体，占29.06％；AG基因型有197个个体，占51.57％。
实施例2：CPE分子标记分型方法在猪免疫性状关联分析中的应用
(1)CPE分子标记分型结果与免疫性状关联分析
用于基因型与免疫性状关联检测分析所用的实验猪群来自广东华农温氏畜牧股份有限公司培育的杜洛克×二花脸杂交的F2代群体(为常规品种)。基因分型所用的DNA由杜洛克×二花脸杂交的F2代(以下正文内容和表中的“杜洛克×二花脸杂交的F2代”简称“猪”)耳样提取，用于血常规检测和流式分析的血液采自20、33、35和80日龄的猪，其中20、33日龄的猪未接种聚肌胞(PolyI:C)，第35日龄的仔猪接种聚肌胞(PolyI:C)4小时后采集血样，用于ELISA分析的血清也来自35日龄的猪接种聚肌胞(PolyI:C)4小时后采集血样。运用固定模型统计分析CPE基因序列SNP位点的基因型效应与免疫指标的关系。
数学模型如下：Y＝Xβ+e
其中：Y为免疫性状测定值向量；X为固定效应关联矩阵；β为固定效应参数向量，包括基因型效应、公畜效应、公畜内母畜效应；e为随机残差效应。
采用SAS9.1进行统计分析，结果见表4、5、6。
表4 CPE基因上游序列57G/A多态性与20日龄猪部分免疫性状的关联分析检测
Figure GDA0002651682190000071
注：表4中，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。
表5 CPE基因上游序列57G/A多态性与33日龄猪部分免疫性状的关联分析检测
Figure GDA0002651682190000072
注：表5中，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。
表6 CPE基因上游序列57G/A多态性与35日龄猪部分免疫性状的关联分析检测
Figure GDA0002651682190000073
注：表6中，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。
由表4-6可知，AA基因型在20日龄的嗜中性细胞百分比(NEp)、血小板(PLT)、血小板压积(PCT)、平均血小板体积(MPV)，33日龄的平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、嗜酸性细胞百分比(EOp)，35日龄的平均红细胞血红蛋白含量(MCH)显著高于GA或GG基因型；AA基因型在20日龄淋巴细胞数目(LY)显著低于GG基因型。因此A等位对20日龄的嗜中性细胞百分比(NEp)、血小板(PLT)、血小板压积(PCT)、平均血小板体积(MPV)、淋巴细胞数目(LY)，33日龄的平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、嗜酸性细胞百分比(EOp)，35日龄的平均红细胞血红蛋白含量(MCH)等性状是有利等位基因，因此选择A等位基因对猪免疫性状的选择是有利的。
主要参考文献：
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序列表
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<120> CPE基因片段作为猪免疫性状的分子标记及应用
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(87)
<220>
<221> mutation
<222> (57)..(57)
<400> 1
gaggtaatga ccagaaaatt gtcatagtat taacttttct acacacaaaa aatgtcagct 60
tcctgccctc ccaatctggc actttgt 87
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(31)
<400> 2
acgttggatg gaggtaatga ccagaaaatt g 31
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(30)
<400> 3
acgttggatg acaaagtgcc agattgggag 30
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(16)
<400> 4
cgggagggca ggaagc 16
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(17)
<400> 5
cgggagggca ggaagcc 17
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(17)
<400> 6
cgggagggca ggaagct 17

Claims (2)

1.一种遗传标记在猪免疫性状非诊断目的的关联分析中的应用，所述遗传标记的核苷酸序列如下所示：
GAGGTAATGACCAGAAAATTGTCATAGTATTAACTTTTCTACACACAAAAAATGTCRGCTTCCTGCCCTCCCAATCTGGCACTTTGT，
上述序列57bp处的R是等位基因突变，由碱基G替换为碱基A，所述突变导致SequenomMassARRAY®SNP分型多态性。
2.一种基于SequenomMassARRAY®SNP方法检测与猪免疫性状遗传标记的引物组合，所述的引物组合包括扩增引物组合和延伸 引物组合，所述扩增引物组合为：正向引物：ACGTTGGATGGAGGTAATGACCAGAAAATTG，和反向引物：ACGTTGGATGACAAAGTGCCAGATTGGGAG；所述延伸 引物组合为：引物1：CGGGAGGGCAGGAAGC，引物2：CGGGAGGGCAGGAAGCC，和引物3：CGGGAGGGCAGGAAGCT。
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利用选择性清除方法鉴别影响太湖猪(二花脸、梅山猪)及野猪产仔数差异的SNP位点;杨怀谷等;《广东农业科学》;20141231(第15期);第100-106页 *

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