CN109112218B - Il1r1基因片段作为猪免疫性状的分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于猪分子标记筛选技术领域，具体涉及IL1R1基因片段作为猪免疫性状的分子标记及应用。所述的分子标记由猪IL1R1基因中克隆得到。本发明筛选得到一种与猪免疫性状相关的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在该序列的第36位的碱基处存在一个A/G的等位基因突变，该突变导致Sequenom

Description

IL1R1基因片段作为猪免疫性状的分子标记及应用

技术领域

本发现属于猪的分子标记筛选技术领域，具体涉及IL1R1基因片段作为猪免疫性状的分子标记及应用。

背景技术

养猪业在我国畜牧业中占据重要的位置，近年来不但培育出具有地方特色且生产性能优秀的品种或品系，而且通过引进外种猪加速猪品质的遗传改良，促进了我国养猪业的发展。随着集约化生产模式的普及，疫病问题接踵而至，主要表现在对某些疫病的控制能力弱，疾病检测、诊断、预防和扑灭等环节处理不当。因此，疾病问题是影响养猪产业发展的关键因素之一。生猪养殖过程中疾病的爆发可直接导致生猪的死亡，出栏率降低，进而影响生猪养殖的经济效益。而为了预防疾病而大量使用药物增加了养殖成本和药物残留，残留的药物破坏了生态环境。尤其是抗生素的滥用不仅导致病菌出现耐药性增加了养殖场疾病防治的难度，而且威胁猪肉的品质安全，造成食品存在安全隐患。因此，在生猪养殖过程中的疾病防控，直接关系到这一产业的发展和猪肉食品市场。尽量避免大量使用药物，寻找抗病新策略，从培育抗病品系入手，是改善养猪行业行情的热门研究方向。

免疫力与抗病力密切关联，抗病力能够体现机体对疾病的整体防御能力，而免疫指标可代表机体的免疫功能状态，间接反映机体的抗病能力，因此可将免疫指标作为抗病能力的选择指标。研究表明免疫与生长存在负相关(唐国庆等,猪抗病育种研究进展.中国畜牧兽医,2002,29(6):29-32；严燕等,猪遗传抗性与抗病育种研究进展.猪业科学,2007,6:58-61.)，而用于检测免疫指标的因子在中外猪种中存在显著差异(刘筱等,猪Toll样受体4基因(TLR4)外显子SNP检测及生物信息学分析.江苏农业学报,2011,27(4):782-789；董文华等,猪CD14基因多态性及其对部分免疫指标的遗传效应分析.中国畜牧杂志,2014,50(13):1-5.)。因此可以筛选与免疫性状关联的基因作为检测免疫性状的遗传标记。

I型白介素-1受体(IL1R1：Interleukin 1Receptor Type 1)基因是IL1R的主要成员之一，在IL1介导的信号通路和炎症反应中发挥重要作用。IL1是一种强有力的促炎症细胞因子，能够引起机体迅速发热，对细胞的增殖、分化，多种先天免疫功能以及具体的免疫活性细胞都具有较强的促进效果(AKDIS M等,Interleukins from 1to 37,andinterferon-gamma:receptors,functions,and roles in diseases.The journal ofallergy and clinical immunology,2011,127(3):701-21.)。IL1主要靠IL1R的信号呈递来完成上述多种生物学功能，而IL1R的生物学作用主要由IL1R1参与完成。IL1R1胞质域中含有的TIR(Toll/IL1受体)结构域与其下游信号转导元件以及Toll样受体相互结合，招募多种信号转导分子，起始IL1信号级联反应(SIMS J E等，IL-1and IL-18receptors,andtheir extended family.Current opinion in immunology,2002,14(1):117-22.)，而其胞外域则依靠特殊的剪切形式发挥自身的生物学功能(KOPF M等，Averting inflammationby targeting the cytokine environment.Nature reviews Drug discovery,2010,9(9):703-18；BURGER D等，The inhibitory activity of human interleukin-1receptorantagonist is enhanced by type II interleukin-1soluble receptor and hinderedby type I soluble receptor.The journal of clinical investigation,1995,96(1):38-41.)。IL1R1对生物体的损伤和感染应答十分重要，该基因功能缺失会导致大鼠对松脂油诱导的免疫应答反应减弱以及表现出更高的李斯特菌易感染性(PERRY A K等,The hosttype I interferon response to viral and bacterial infections.Cell research,2005,15(6):407-22.)。正常的IL-1/IL1R信号系统有助于维持机体的正常功能和对炎症分子的活化，IL1R1信号功能的缺失会造成对D-半乳糖胺和脂多糖致死量的敏感性增强(GLACCUM M B等,Phenotypic and functional characterization of mice that lackthe type I receptor for IL-1.Journal of immunology,1997,159(7):3364-71.)。另外，研究表明IL1R1基因SNP位点的多态性与儿童哮喘的易感性相关，且该位点的多态性可能影响患儿血清中IL1R1基因的表达水平(刘燕等,IL1R1基因多态性与儿童哮喘的相关性.中国当代儿科杂志,2016,18(3):243-246.)。上述研究表明，IL1R1基因在维持机体免疫功能和参与机体炎症反应过程中发挥重要作用。

本发明申请中，申请人分析了IL1R1基因的第1内含子片段，鉴定了一个与猪免疫性状密切相关的功能突变位点，为猪免疫性状的标记辅助选择提供了新的SNP分子标记。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，通过PCR扩增IL1R1基因第1内含子片段，利用Sequenom

SNP技术，在杜洛克×二花脸F2代群体中进行分型，分型结果与该群体的免疫指标关联分析，进而鉴定获得与猪免疫性状相关的分子标记，为猪的抗病育种提供了新的分子标记资源和应用。

本发明的技术方案如下所述：

申请人通过基因克隆的方法，得到IL1R1基因第1内含子的核苷酸序列，其序列如表序列表SEQ ID NO：1所示。具体如下所述：

GGTAGCAGGAGAGATGTTTGCTTCAGTAAAAAGATRGAAAAACCAGAATTTAACCTCCCACCTGAACAACACAA

上述序列的36位碱基处的R为一个A36-G36的等基因突变，该突变导致Sequenom

SNP分型多态性。该基因片段可以作为检测与猪免疫性状相关的分子标记。

申请人提供了一种检测如序列表SEQ ID NO:1所述的分子标记的引物对(即扩增IL1R1基因第1内含子序列的引物对)，该引物对的正、方向引物的起始处(即序列下划线所示的序列)各包含10bp的序列标签，所述引物对的核苷酸序列如下所示：

正向引物：5’-ACGTTGGATGGGTAGCAGGAGAGATGTTTG-3’

反向引物：5’-ACGTTGGATGTTGTGTTGTTCAGGTGGGAG-3’。

申请人提供了一种检测如序列表SEQ ID NO:1所述的分子标记的用于基因分型的延伸引物组合，该引物组合序列的最后一个碱基不同，所述引物的核苷酸序列如下所示：

引物1：5’-GGAGGTTAAATTCTGGTTTTTC-3’；

引物2：5’-GGAGGTTAAATTCTGGTTTTTCC-3’；

引物3：5’-GGAGGTTAAATTCTGGTTTTTCT-3’。

申请人提供了一种筛选猪免疫性状的分子标记的方法所述的方法包括如下步骤：

①提取猪耳朵组织基因组DNA并对DNA进行质量检测；

②根据SNP位点序列信息，使用sequenom公司的引物设计软件Assay design3.1，设计PCR反应和单碱基扩增引物；

③利用Sequenom

SNP方法进行分型检测；

④采用SAS9.1软件进行基因型与猪免疫性状间的关联分析。

本发明所述的一种猪免疫性状相关的分子标记可用于猪免疫性状标记辅助选择中。

本发明筛选的分子标记可用于非诊断目的的对猪相关基因的基因型或与猪免疫性状之间的关联分析中，为猪免疫性状的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记资源。

与现有技术相比本发明具有的有益效果：

本发明可通过在体外采用Sequenom

SNP方法检测猪的基因型，作为非诊断目的的评价猪的免疫能力，与目前的PCR-RFLP、ELISA、流式细胞仪等方法相比，本发明具有简单、快捷、灵敏度高和特异性好等突出优点。

更详细的技术方案请参见说明书的《附图说明》及《具体实施方式》中的实施例。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的IL1R1基因第一内含子片段，即本发明筛选的分子标记的核苷酸序列。序列长度为为74bp，在该序列的36位碱基处的R存在一个A/G的等位基因突变。

序列表SEQ ID NO：2是本发明克隆IL1R1基因的第一内含子和分子标记的正向引物序列。序列长度为30bp。

序列表SEQ ID NO：3是本发明克隆IL1R1基因的内含子和分子标记的反向引物序列。序列长度为30bp。

序列表SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6是检测序列表SEQ ID NO：1的Sequenom

SNP多态性的延伸引物序列。序列长度分别为22bp、23bp和23bp。

图1：本发明的总体技术流程示意图。

图2：是本发明克隆的IL1R1基因的内含子序列和本发明分子标记的核苷酸序列。图中序列的36位碱基处存在一个A/G等位基因突变(36bp处的英文字母“R”为突变位点)。

图3：是本发明标记的SNP位点的峰图。

具体实施方式

实施例1：基因分型检测

(1)利用苯酚抽提法提取杜洛克×二花脸F2代群体的耳朵组织DNA

1)将杜洛克×二花脸F2代群体(广东华农温氏畜牧股份有限公司提供)的耳样组织在液氮中磨碎，加入等体积1×SET(1mL)，蛋白酶K(10ng/mL)至终浓度200ug/mL，十二烷基硫酸钠(即SDS，10％)至终浓度0.5％，摇匀。55℃水浴温育过夜消化。

2)将消化后的组织样加入等体积的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管15min，于低温冷冻离心机中4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清液转移至另一离心管中，标上相应记号。

3)加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比25：24：1)，缓慢颠倒离心管10min，于低温离心机中4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清，转移至另一个干净的离心管中。

4)加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24：1)，缓慢颠倒离心管10min，于低温冷冻离心机中4℃、11000rpm离心10min。

5)将上清液吸入标记好的的离心管中，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，即可以看到白色絮状DNA。

6)用枪头将DNA沉淀挑出，置于装有对应号码的EP管中，室温下让乙醇挥发干净，加入适量的超纯水(一般300ul左右)溶解DNA。

7)在DNA浓度测定仪上测定其浓度与纯度，并在1％琼脂糖凝胶80伏电泳约2h，紫外灯下检测提取的DNA质量。

(2)引物设计

根据SNP位点序列信息，以猪IL1R1基因(ENSSSCG00000008162)第1内含子序列为模板，使用Sequenom公司的引物设计软件Assay design3.1，设计PCR反应和单碱基扩增引物。

PCR扩增引物(引物序列的前10个碱基为标签序列，见下划线的序列)：

正向引物：5’-ACGTTGGATGGGTAGCAGGAGAGATGTTTG-3’

反向引物：5’-ACGTTGGATGTTGTGTTGTTCAGGTGGGAG-3’。

PCR产物延伸引物组合：

引物1：5’-GGAGGTTAAATTCTGGTTTTTC-3’(如序列表SEQ ID NO：4所示序列对应)；

引物2：5’-GGAGGTTAAATTCTGGTTTTTCC-3’(如序列表SEQ ID NO：5所示序列对应)；

引物3：5’-GGAGGTTAAATTCTGGTTTTTCT-3’(如序列表SEQ ID NO：6所示序列对应)。

(3)PCR扩增

反应体系(384孔PCR版+38％的试剂损耗)，见表1。

表1PCR反应体系--1

扩增条件：94℃预变性900s，(94℃变性20s、56℃退火30s、72℃延伸60s)45个循环，72℃延伸180s，4℃终止反应。将PCR产物进行碱性磷酸酶处理。

(4)碱性磷酸酶(SAP)消化：

反应体系(384孔PCR板+38％的试剂损耗)，见表2。

表2PCR反应体系--2

扩增条件：37℃40min，85℃5min，4℃终止反应，将PCR产物进行延伸反应。

(5)延伸反应：

反应体系(384孔PCR板+38％的试剂损耗)，见表3。

表3PCR反应体系--3

扩增条件：94℃预变性30s，{94℃变性5s，(52℃退火5s，80℃延伸5s)5个循环}40个循环，72℃延伸180s，4℃终止反应。将PCR产物进行上机检测。

(6)上机检测：

A)将反应产物(共9μL)稀释3倍，按常规方法，使用树脂进行脱盐；

B)将脱盐处理后的样品点在样品靶上，使其自然结晶；

C)上机进行质谱检测，并收集数据。

根据收集数据，统计基因型分型检测结果。基因型检测结果表明，在384个样品中检测出382个样品，检出率99.48％。其中在382个个体中AA基因型有51个个体，占13.35％；GG基因型有138个个体，占36.13％；GA基因型有193个个体，占50.52％。

实施例2：IL1R1分子标记分型方法在猪免疫性状关联分析中的应用

(1)IL1R1分子标记分型结果与免疫性状关联分析

用于基因型与免疫性状关联检测分析所用的实验猪群来自广东华农温氏畜牧股份有限公司培育的杜洛克×二花脸杂交的F2代群体(为常规品种)。基因分型所用的DNA由杜洛克×二花脸杂交的F2代(以下正文内容和表中的“杜洛克×二花脸杂交的F2代”简称“猪”)耳样提取，用于血常规检测和流式分析的血液采自20、33、35和80日龄的猪，其中20、33日龄的猪未接种聚肌胞(PolyI:C)，第35日龄的仔猪接种聚肌胞(PolyI:C)4小时后采集血样，用于ELISA分析的血清也来自35日龄的猪接种聚肌胞(PolyI:C)4小时后采集血样。运用固定模型统计分析IL1R1基因第1内含子序列SNP位点的基因型效应与免疫指标的关系。

数学模型如下：Y＝Xβ+e

其中：Y为免疫性状测定值向量；X为固定效应关联矩阵；β为固定效应参数向量，包括基因型效应、公畜效应、公畜内母畜效应；e为随机残差效应。

采用SAS9.1进行统计分析，结果见表4、5、6、7。

表4IL1R1基因内含子片段36A/G多态性不同基因型对20日龄猪单核细胞数和单核细胞百分比的影响

注：P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

表5IL1R1基因内含子片段36A/G多态性不同基因型对20日龄猪嗜酸细胞数的影响

注：P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

表6IL1R1基因内含子片段36A/G多态性不同基因型对20日龄猪平均红细胞体积、红细胞平均血红蛋白量和红细胞分布宽度的影响

注：P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

表7IL1R1基因内含子片段36A/G多态性不同基因型对33日龄猪单核细胞百分比的影响

注：注：P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

由表4-7可知，AA基因型个体20日龄的单核细胞百分比(MO％)、嗜酸细胞数(EO)、平均红细胞体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白量(MCH)，33日龄的单核细胞百分比(MO％)性状都显著高于AG或GG基因型(P<0.05)；AA基因型个体20日龄的红细胞分布宽度(RDW)显著低于AG或GG基因型(P<0.05)。因此，A等位基因对20和33日龄的单核细胞百分比，20日龄的嗜酸细胞数、平均红细胞体积、红细胞平均血红蛋白量、红细胞分布宽度等性状是有利等位基因，因此选择A等位基因对猪免疫性状的选择是有利的。主要参考文献：

1.唐国庆等,猪抗病育种研究进展.中国畜牧兽医,2002,29(6):29-32.

2.严燕等,猪遗传抗性与抗病育种研究进展.猪业科学,2007,6:58-61.

3.刘筱等，猪Toll样受体4基因(TLR4)外显子SNP检测及生物信息学分析.江苏农业学报,2011,27(4):782-789.

4.董文华等,猪CD14基因多态性及其对部分免疫指标的遗传效应分析.中国畜牧杂志,2014,50(13):1-5.

5.Akdis M,Burgler S,Crameri R,Eiwegger T,Fujita H,Gomez E,Klunker S,Meyer N,O'Mahony L,Palomares O et al:Interleukins,from 1to 37,and interferon-gamma:receptors,functions,and roles in diseases.The Journal of allergy andclinical immunology 2011,127(3):701-721e701-770.

6.Sims JE:IL-1and IL-18receptors,and their extended family.Currentopinion in immunology 2002,14(1):117-122.

7.Kopf M,Bachmann MF,Marsland BJ:Averting inflammation by targetingthe cytokine environment.Nature reviews Drug discovery 2010,9(9):703-718.

8.Burger D,Chicheportiche R,Giri JG,Dayer JM:The inhibitory activityof human interleukin-1receptor antagonist is enhanced by type II interleukin-1soluble receptor and hindered by type I interleukin-1soluble receptor.TheJournal of clinical investigation 1995,96(1):38-41.

9.Perry AK,Chen G,Zheng D,Tang H,Cheng G:The host type I interferonresponse to viral and bacterial infections.Cell research 2005,15(6):407-422.

10.Glaccum MB,Stocking KL,Charrier K,Smith JL,Willis CR,MaliszewskiC,Livingston DJ,Peschon JJ,Morrissey PJ:Phenotypic and functionalcharacterization of mice that lack the type I receptor for IL-1.Journal ofimmunology(Baltimore,Md:1950)1997,159(7):3364-3371.

11.刘燕等,IL1R1基因多态性与儿童哮喘的相关性.中国当代儿科杂志,2016,18(3):243-246。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> IL1R1基因片段作为猪免疫性状的分子标记及应用

<141> 2017-09-07

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 74

<212> DNA

<213> 猪(sus scrofa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(74)

<220>

<221> mutation

<222> (36)..(36)

<400> 1

ggtagcagga gagatgtttg cttcagtaaa aagatggaaa aaccagaatt taacctccca 60

cctgaacaac acaa 74

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 猪(sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(30)

<400> 2

acgttggatg ggtagcagga gagatgtttg 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 猪(sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(30)

<400> 3

acgttggatg ttgtgttgtt caggtgggag 30

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 猪(sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(22)

<400> 4

ggaggttaaa ttctggtttt tc 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 猪(sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(23)

<400> 5

ggaggttaaa ttctggtttt tcc 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 猪(sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(23)

<400> 6

ggaggttaaa ttctggtttt tct 23

Claims (1)

1.扩增分子标记的引物在猪免疫性状标记辅助选择中非诊断目的的应用，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如下所示：

GGTAGCAGGAGAGATGTTTGCTTCAGTAAAAAGATRGAAAAACCAGAATTTAACCTCCCACCTGAACAACACAA；

上述序列36bp处的R是A或G，该突变导致Sequenom MassARRAY®SNP分型多态性，选择基因型为AA的个体。

Images