CN108950021B

CN108950021B - 猪9号染色体基因间区单核苷酸多态作为猪红细胞数目性状的分子标记

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Publication number: CN108950021B
Application number: CN201811013595.9A
Authority: CN
Inventors: 刘向东; 王梦芬; 杜小勇; 赵书红; 李新云; 尹立林; 唐振双; 赵志超; 朱猛进; 张�杰
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-08-31
Filing date: 2018-08-31
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2038-08-31
Also published as: CN108950021A

Abstract

本发明属于猪分子标记筛选技术领域，具体涉及猪9号染色体基因间区单核苷酸多态作为猪红细胞数目性状的分子标记。通过基因芯片技术对登陆号为ASGA0082606基因进行分型，筛选得到一种与猪33日龄红细胞数目性状相关的分子标记，该标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在该序列的第101位的碱基处存在一个C/T的等位基因突变。当SEQ ID NO：1所示序列上的第101位核苷酸为T时，表明猪具有更高的红细胞数目。本发明为猪免疫性状尤其是红细胞数目的标记辅助选择提供了一个新的SNP分子标记。

Description

猪9号染色体基因间区单核苷酸多态作为猪红细胞数目性状的分子标记

技术领域

本发明属于猪的分子标记筛选技术领域，具体涉及猪9号染色体基因间区单核苷酸多态作为猪红细胞数目性状的分子标记。本发明的分子标记可用于猪红细胞数目(RBC)性状的预测。

背景技术

我国一直是猪肉生产和消费大国，猪肉是我国肉类食品消费最多的品种，每年猪肉消费量约占全球的一半(陶炜煜等，2017)。随着规模化、现代化养殖的盛行，国内生猪生产水平逐渐提高，但饲养密度和强度大随之而来的疾病防控难度也日趋增加，规模化猪场一旦爆发流行性或者传染性疾病，将会给猪场带来致命的打击(张文启，2015)。近年在我国境内开始流行的圆环病毒病，主要侵害青年猪和仔猪，患病猪只食欲下降且表现为渐进性消瘦(钟细平，2016)，严重推迟生猪出栏时间甚至死亡，极大地增加猪场成本。且诸如蓝耳病、圆环病毒病等具有强烈的免疫抑制作用的疾病，患病猪只疫苗免疫水平较低(李文太，2017)，而疫苗免疫是我国猪场传染性疾病防控的主要手段。再者，传染病的血清型和变异株一般较多，也给疾病防控和疫苗免疫增加难度，猪病的防控成为猪生产的一大难点。

2018年以来，猪价低迷，同时饲料原料价格较高、环保监控力度更加严格，猪场如何能在低迷的市场行情和相对较高的生产成本下具有竟争优势，降低疾病防治成本是重要手段之一。而且，季节性爆发的流行性传染病一般具有多种血清型和变异株且多病原间经常存在混合感染、继发感染或协同感染等情况(陈焕春，2014)，加大疫苗免疫和疾病防控难度。且使用抗生素治疗容易出现耐药性，影响治疗效果，提高猪只免疫力才是防控疾病的关键(赵瑞丽，2010)。而抗病育种是公认的猪病综合防控的重要环节，抗病育种是在遗传的基础上改良猪的抗病性能，培育具有抗病性能或免疫力较高的优质高产猪，力图从根本上解决生猪免疫力和抗病力较低的问题，受到国内外学者的高度重视，并取得了一系列成果。免疫系统是动物抵抗病原侵害的天然屏障，免疫系统的强弱直接决定了动物抵抗疾病的能力和疫苗免疫能力，报道的猪的Cav1基因能在阻止病原微生物入侵宿主过程中起关键作用(Liu等，2011)，Toll样受体家族(TLRs)(戴超辉等，2018)和白细胞介素ILs在猪群免疫调控中具有重要作用(Suzuki等,2001)，苏太猪FUT1的M307位点对大肠杆菌F18菌株具有很好的抗性(Bao等，2012)，这些研究为抗病育种提供了很好的参考依据。随着食品安全的重视及兽药使用的规范和限制，抗病育种将成为猪场疾病防控的重要手段。

红细胞是血液的主要细胞成分，参与机体许多免疫应答和免疫调节(甘慧等，2004)，是一种天然免疫刺激剂和调节剂(甘慧等，2005)，数量巨大且分布较广，其含有CR1、CR3、CD8、CD59、DAF、IL-8受体等多种免疫相关物质，具有杀伤抗原和清除免疫复合物的能力(郭峰，1995)，在动物天然抗病免疫中发挥重要作用，在一定程度上红细胞数量的多少会直接影响机体的免疫水平。因此，寻找与红细胞数量相关的基因或分子标记，对提高猪的抗病能力具有重要的现实意义，血液分布于机体全身，红细胞免疫作用面广，筛选出与猪红细胞数显著相关的分子标记及基因对抗病育种具有重要意义。

本发明中发现的SNP与猪的红细胞数(RBC)性状的相关性达到了极显著水平，为家猪免疫及生长性状的研究提供了新的遗传资源。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，完善家猪抗病育种分子标记资源的发掘，利用基因芯片技术对SNP进行分型，并使用全基因组关联分析(GWAS)筛选与注射聚肌胞后对猪细胞数目(RBC)性状相关的SNP，为猪的抗病育种提供了新的分子标记资源。

本发明的技术方案如下所述：

申请人通过基因芯片技术并参阅Ensemble，得到猪9号染色体基因间区核苷酸片段，该片段与33日龄猪红细胞数性状相关，该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。具体核苷酸序列如下所示：

CGGTACCTCTGGGGAAGGCGCAGAAGAAATTTACAGAGTATATTTTTGGTCACACTTAAGTCTTCCTTAAAGTGACCTGGCCTCTCCCTCAGTCAAAGGAY(C/T)TCTGAGTTGGTGAACAGCTTTCTCCCAGCAAACTGAGTGGAAAGCTACAAATTATCACTATGGCTGTTTGAATCAGGTTTCTACCCACCTCAATAATTCC，

上述序列的第101位碱基处的Y是C或T，该突变导致红细胞数性状发生改变。且当SEQ ID NO：1上的第101位核苷酸为T时，表明猪具有更高的红细胞数目。

上述序列可以作为检测猪红细胞数目性状尤其是检测33日龄猪红细胞数目性状相关的SNP分子标记。

申请人提供了一种筛选猪红细胞数目性状相关尤其是检测33日龄猪红细胞数目性状相关SNP分子标记的方法，所述的方法包括如下步骤：

①提取猪耳组织基因组DNA，进行DNA质量检测。

②利用基因芯片技术进基因分型。

③采用基于固定模型和随机模型的方法，利用R统计环境下的MVP软件包进行全基因组关联分析(GWAS)。具体的回归模型如下：(1)固定模型y_i＝M_i1b₁+M_i2b₂+…+M_itb_t+S_ijd_j+e_i，其中y_i是对第i个个体的观察值；M_i1，M_i2，...，M_it分别是t个假设QTN的基因型；b₁，b₂，...，b_t分别是t个遗传标记的效应值；e_i是残差误差，服从正态分布，e_i～N(u_e,σ² _e)，σ² _e表示残差方差。(2)随机模型y_i＝u_i+e_i，其中y_i是对第i个个体的观察值；e_i是残差误差，服从正态分布，e_i～N(u_e,σ² _e)，σ² _e表示残差方差；u_i是第i个体的总遗传效应，并对影响表型的因素进行了主成分分析，将前三个主成分作为协变量加入模型中。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果：

本发明可通过在体外采用基因芯片技术检测猪的基因型，作为非诊断目的评价猪的免疫能力，与目前的PCR-RFLP、ELISA、流式细胞仪等方法相比，本发明具有简单、快捷、灵敏度高和特异性好等突出优点。更详细的技术方案请参见说明书的《附图说明》及《具体实施方式》中的实施例。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的猪9号染色体基因间区的核苷酸片段。该片段即是本发明筛选的分子标记，序列长度为201bp，在该序列的101位碱基处的Y存在一个C/T等位基因突变。

图1：本发明的总体技术流程示意图。

图2：本发明克隆的9号染色体基因间区序列，该序列即是本发明的分子标记序列。附图标记说明：在图2所示序列的第101位碱基处存在一个C/T等位基因突变(101bp处的英文字母“Y”代表突变位点)。

图3：本发明的曼哈顿图。附图标记说明：箭头所指黑色圆圈标记的为本发明筛选的分子标记，该标记位于猪第9号染色体上的基因间区序列。

具体实施方式

实施例1：基因分型检测

(1)利用苯酚抽提法提取杜洛克×二花脸F2代群体的耳朵组织DNA

1)将杜洛克×二花脸F2代猪群体(群体样本由广东华农温氏畜牧股份有限公司提供)的耳组织样在液氮中磨碎，加入等体积1×SET(1mL)，蛋白酶K(10ng/mL)至终浓度200ug/mL，再加入10％浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)至终浓度为0.5％，摇匀。在55℃水浴中温育过夜消化。

2)将消化后的组织样加入等体积的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管15min，于低温冷冻离心机中，在4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清液转移至另一离心管中，标记相应记号。

3)加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25：24：1)，缓慢颠倒离心管10min，于低温(4℃)离心机中，在11000rpm离心10min，小心吸取上清，转移至另一个干净的离心管中。

4)加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24：1)，缓慢颠倒离心管10min，于低温(4℃)

冷冻离心机中，在11000rpm离心10min。

5)将上清液吸入标记好的的离心管中，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，即可以看到白色絮状DNA。

6)用枪头将DNA沉淀挑出，置于装有对应号码的EP管中，室温下让乙醇挥发干净，加入适量的超纯水(一般300ul左右)溶解DNA。

7)在DNA浓度测定仪上测定其浓度与纯度，并在1％琼脂糖凝胶80伏电泳约2h，紫外灯下检测提取的DNA质量。

(2)SNP基因型的判定

使用Illumina公司研制PorcineSNP60 BeadChip全基因组芯片，该芯片包含超过60000个SNP位点，以步长平均每40kb有一个标记，覆盖猪的基因组。此芯片整合了多种猪的基因差异，包括杜洛克猪，长白猪，皮特兰猪和大白猪，能提供足够的SNP密度，可应用于全基因组关联分析中。

(3)质量控制

用PLINK v1.9软件(来自Shaun Purcell公司)对获得的基因型数据进行质量控制，剔除检出率低于90％的SNP，这些SNP等位基因频率小于0.03。忽略偏离哈代温伯格(Hardy-Weinberg Equilibrium,HWE)P<10^-6的SNP标记，最终有5473个SNP被过滤，43111个SNP用于GWAS研究。

实施例2：基因间区分子标记分型方法在猪免疫性状关联分析中的应用

(1)基因间区分子标记分型结果与免疫性状关联分析

用于基因型与免疫性状关联检测分析所用的实验猪群是杜洛克×二花脸杂交的F2代群体(为常规品种)。基因分型所用的DNA由杜洛克×二花脸杂交的F2代(说明书正文和表中所称的“杜洛克×二花脸杂交的F2代”简称“猪”)耳样组织中提取，用于测量猪红细胞数量的血液分别采自33日龄的仔猪。采用基于固定模型和随机模型的方法，未将性别作为固定效应，在利用R统计环境下的MVP软件包进行GWAS分析。(1)固定模型y_i＝M_i1b₁+M_i2b₂+…+M_itb_t+S_ijd_j+e_i，其中y_i是对第i个个体的观察值；M_i1，M_i2，...，M_it分别是t个假设QTN的基因型；b₁，b₂，...，b_t分别是t个遗传标记的效应值；e_i是残差误差，服从正态分布，_ei～N(u_e,σ² _e)，σ² _e表示残差方差。(2)随机模型y_i＝u_i+e_i，其中y_i是对第i个个体的观察值；e_i是残差误差，服从正态分布，e_i～N(u_e,σ² _e)，σ² _e表示残差方差；u_i是第i个体的总遗传效应，并对影响表型的因素进行主成分分析，将前3个主成分作为协变量加入到模型中。关联分析结果见表1。

表1基因间区片段101C/T多态性不同基因型对33日龄猪红细胞数的影响

表1说明：P<0.05为差异显著；P<0.01为差异极显著。

由表1可知，基因型为TT的个体红细胞数极显著高于TC和CC个体，所以T是有利于红细胞数增加的等位基因。

主要参考文献

[1]陶炜煜等，近年来中国猪肉消费形势及“十三五”展望[J].农业展望,2017(9):108-113；

[2]张文启，猪场疾病的流行特点与防控技术[C]//“中国畜牧兽医学会动物福利与健康养殖分会”成立大会暨首届规模化健康与福利养猪高峰学术论坛论文集.2015；

[3]钟细平，猪圆环病毒病的防控措施[J].中国畜牧兽医文摘,2016,32(5):127-127；

[4]李文太，猪圆环病毒病的流行现状与防控措施[J].当代畜牧,2017(29)；

[5]陈焕春，当前猪群疾病的流行变化与防控措施[J].今日畜牧兽医,2014(06):19-22；

[6]赵瑞丽，提高猪只免疫力是防治疾病的关键[N].中国畜牧兽医报,2010-05-09(005)；

[7]戴超辉等，猪源Toll样受体家族(TLRs)及其在抗病育种中的应用[J].浙江农业学报,2018,30(3):507-520；

[8]Suzuki A et al,Cis3/Socs3/Ssi3 Plays a Negative Regulatory Role inStat3 Activation and Intestinal Inflammation[J].Journal of ExperimentalMedicine,2001,193(4):471-482；

[9]Bao W B et al,Evaluation of M307 of FUT1 gene as a genetic markerfor disease resistance breeding of Sutai pigs.[J].Molecular Biology Reports,2012,39(4):4223-4228；

[10]甘慧等，红细胞免疫研究的历史、现状和前景[C]//第6次全国微生物学与免疫学大会论文摘要汇编.2004:227-230；

[11]甘慧等，红细胞免疫研究的历史、现状和前景[J].国际免疫学杂志,2005,28(4):227-230.

[12]郭峰，红细胞免疫研究概况[J].中华微生物学和免疫学杂志,1995(3):181-182。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 猪9号染色体基因间区单核苷酸多态作为猪红细胞数目性状的分子标记

<141> 2018-08-24

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 201

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(201)

<220>

<221> mutation

<222> (101)..(101)

<400> 1

cggtacctct ggggaaggcg cagaagaaat ttacagagta tatttttggt cacacttaag 60

tcttccttaa agtgacctgg cctctccctc agtcaaagga ttctgagttg gtgaacagct 120

ttctcccagc aaactgagtg gaaagctaca aattatcact atggctgttt gaatcaggtt 180

tctacccacc tcaataattc c 201

Claims

1.一种SNP分子标记在猪红细胞数目性状标记辅助选择中非诊断目的的应用，所述性状为33日龄猪红细胞数目，所述猪的品种为杜洛克×二花脸F2代，所述分子标记的核苷酸序列如下所示：

CGGTACCTCTGGGGAAGGCGCAGAAGAAATTTACAGAGTATATTTTTGGTCACACTTAAGTCTTCCTTAAAGTGACCTGGCCTCTCCCTCAGTCAAAGGAYTCTGAGTTGGTGAACAGCTTTCTCCCAGCAAACTGAGTGGAAAGCTACAAATTATCACTATGGCTGTTTGAATCAGGTTTCTACCCACCTCAATAATTCC，

上述序列的101bp处的Y是C或T，基因型为TT的个体红细胞数极显著高于TC和CC个体。