CN109762911B - Ptprj基因作为猪免疫相关性状的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于猪分子标记筛选领域，具体涉及PTPRJ基因作为猪免疫相关性状的分子标记及其应用。本发明的分子标记克隆自PTPRJ基因的一个片段。其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在该序列的第134碱基位处发生一个等位基因突变，即T/G突变。该基因的SNP突变位点获得的分子标记与猪的免疫相关性状相关。对该分子标记进行了关联分析，发现此多态位点与猪的T淋巴细胞亚型含量、嗜碱性粒细胞数、中性粒细胞百分比、嗜碱性粒细胞百分比、白介素‑10含量、80日龄体重这六个性状呈极显著相关。本发明的分子标记可作为检测猪免疫性状的相关标记，可用于猪的标记辅助育种上。

Description

PTPRJ基因作为猪免疫相关性状的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及猪分子标记筛选领域，具体涉及PTPRJ基因作为猪免疫相关性状的分子标记 及其应用。本发明所述的分子标记可用于猪免疫相关性状的检测。

背景技术

世界上生猪养殖业蓬勃发展的同时，也暴露出一些不可忽略的问题。随着生活水平的提 高，人们的消费观念发生了明显转变，在对肉制品的要求上，瘦肉率甚至口感已经不再处于 第一考量，营养、绿色、健康逐渐成为推动行业升级的方向标。传统养殖方式中疫苗、抗生 素等的大量使用明显和大方向不符。在生猪饲养期间，对于疾病处理方面，不规范使用甚至 滥用疫苗和抗生素导致了猪体内药物残留，间接对人类造成影响，同时，预混于饲料中的抗 生素残留风险也一种额外威胁，有可能诱发共生菌产生耐药性。早在2015年，美国食品及药 物管理局(FDA)就提案建议在鸡肉、牛肉和猪肉生产中减少抗菌促生长剂的使用量，欧盟 正极力限制第三代头孢菌素在兽药上的使用，荷兰经济部、农业部和创新部也建议减少抗生 素的使用量，其中一项措施可能是禁止在饲料内预混药物(黎先伟，2015)。2018年中国农 科院饲料研究所启动了饲用抗生素替代研究项目。可以看出，饲用抗生素导致的食品安全和 环境安全问题已经在国内外受到了重视。

PTPRJ基因编码受体型酪氨酸磷酸酶J，该酶广泛存在于多种细胞类型中(Lin J等，2004)， 它有多种底物，包括PDGF b受体(Kovalenko M等，2000)、肝细胞生长因子(HGF)受体 (Palka HL等，2003)、血管内皮生长因子(VEGF)受体-2(Lampugnani MG等，2006) 等，是介导细胞基质间相互作用的重要信号分子(Larsen M等，2003)。PTPRJ在血管内皮 细胞中的表达水平对于血管发生具有重要作用：低到中度表达水平促进血管内皮钙黏蛋白相关血管生成；高表达水平抑制血管内皮细胞生长因子受体磷酸化激活，对血管内皮细胞生长 因子相关血管生成起负性调控作用(许小兵等，2017)。

PTPRJ也是一种肿瘤抑制基因，它已经在包括乳腺癌在内的一系列癌症研究中被发现 (Chanel E.Smart等，2012)。PTPRJ通过负调控与增殖信号有关的几种蛋白，表现出抑癌 活性，其可以与癌症中广泛表达的CD98hc相互作用，PTPRJ过表达可显著降低A549肺癌细 胞中CD98hc蛋白水平，还能显著降低肺癌细胞的增殖和诱导凋亡，有助于阐明肿瘤细胞中 PTPRJ信号通路(Sabrina等，2018)。在人和小鼠组织中，巨噬细胞的PTPRJ表达量最高(Dave RK等，2009)，敲除试验表明其在单核细胞活化中发挥了与CD45类似的积极作用，可使酪 氨酸Src家族的负调控激酶去磷酸化(Stepanek O等，2011)。Richa K等人在2013年报导， PTPRJ/CD148是具有肿瘤抑制样活性的酪氨酸磷酸酶，各种细胞和组织的定量PCR试验显 示它优先在富含巨噬细胞的组织中表达；在淋巴组织内，免疫组化学试验显示PTPRJ/CD148 与F4/80共定位，同样表明巨噬细胞最强烈地表达PTPRJ蛋白质；并且PTPRJ基础水平不 仅在巨噬细胞中表达最高，还能通过脂多糖(LPS)和其他Toll样受体配体处理后进一步升 高。巨噬细胞是识别、吞噬和破坏外来微生物及其产物的关键细胞，它们是人体免疫系统的 重要组成部分。巨噬细胞不仅有吞噬功能还具有抗原呈递的额外作用，因此对先天免疫反应 和后天免疫反应发挥最佳功能起着关键作用(Stoy N等，2001)。

由此，我们合理推测，PTPRJ基因可能参与机体重要的功能，并且它对免疫系统发挥作 用有影响，支撑本发明的试验结果也表明PTPRJ基因中一个SNP变异与猪的免疫性状显著相 关，如果将其作为猪抗病育种工作中的分子标记，可以对抗病性状的研究起到提示作用。因 此，本申请发明中于PTPRJ基因上发现的一个SNP在猪免疫性状相关分子标记制备领域中具 有极大的应用潜力。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种与猪免疫性状相关基因PTPRJ的分子 标记及其应用。所述的猪免疫性状主要涉及免疫性状CD4-CD8-CD3-、嗜碱性粒细胞数(BA)、 中性粒细胞百分比(NE％)、嗜碱性粒细胞百分比(BA％)、白介素-10(IL-10)含量、80 日龄体重性状关联的分子标记。利用该分子标记可迅速预测不同基因型群体猪之间免疫性状 的差别，同时在猪育种工作中，该分子标记可作为免疫性状的可靠标记，便于进行早期选择， 从而缩短世代间隔，提高选择强度，提高猪的标记辅助选种效率和准确性。

为实现上述目的，本发明提供一种猪免疫性状相关基因PTPRJ的分子标记，所述分子标 记位于猪2号染色体PTPRJ基因第25号外显子(E25)的核苷酸序列上，即序列SEQ IDNO： 1或附图3所示，序列标注位置为第134位的T＞G单核苷酸突变，它对应于ensembl数据库 (GRCh37)版本的猪基因组参考转录本PTPRJ-201(GenBank收录号：ENSSSCT00000022326.1)的cDNA序列第6104位核苷酸，也对应于猪全基因组(Sscrofa10.2)第2号染色体上第15633547位核苷酸，RS号为rs333210306。

SEQ ID NO：1所述序列具体为：

CGGATGCCCCGCGGGCCCCGGGGTGTTGGGTGCAGCTGGGTGTGGGCGGATGGCTTCC GGGCCTGCACAAGTGGCCTGCCCCTGGCACGCAAGCCTTGCAGAGCTCTGTGACTTCTT CAGAGGTCCCTGTTCA R(T/G)GCGGCAGTTCTGTGCGCCACACCCCTTCCCACTCCA GTTCCTCAGGAAACCATGGTGATGGGGGCCGGGCGTCAAATCCCACGTGGACGTACGCC CCGCCCACAGCACTGCCGCTG

上述序列第134位碱基处R是T/G的基因突变(序列表SEQ ID NO：1中第134位的碱基是突变后的碱基G)，该突变使上述序列产生了多态性。该序列可以作为检测与猪免疫性状相关的分子标记。

申请人提供了一种筛选猪免疫性状相关分子标记的方法，所述方法的步骤如下：

1.按常规方法提取若干头猪耳朵基因组DNA混成DNA池，并对DNA进行质量检测，以ensembl数据库(GRCh37)版本上公布的猪基因组参考转录本PTPRJ-201 的cDNA序列为模板扩增PTPRJ基因，并送到北京六合华大基因公司进行基因测序。

2.利用MegAlign软件对测序结果与参考序列进行比对分析，发现PTPRJ基因25号外 显子上存在着一突变位点，依据其在参考转录本上的位置信息，定位得到ensembl数据库上 的rs333210306。

3.根据比对结果列出包含该SNP位点在内的上下游各大于100bp的序列，以此作为分 型序列。

4.按常规方法提取294头猪耳朵基因组DNA，并对DNA进行质量检测。

5.利用质谱分型技术(华大基因Sequenom MassArray，具体步骤见说明书文末)对PTPRJ基因的SNP进行分型。

此外，申请人还提供了一种应用该分子标记与猪免疫性状进行关联分析的方法：具体步 骤为：

采用免费软件R(3.2.4)中gaston包进行数据处理与统计分析。采集样品的白细胞数、 嗜中性粒细胞数、淋巴细胞数、嗜碱性粒细胞数、平均血红蛋白浓度、嗜碱性粒细胞数百分 比等22个血液指标；CD4-CD8-CD3-等7个T淋巴细胞含量指标；IL-8、IL-10等7个细胞因 子含量指标以及初生重等4个生长性状指标。根据采集样品的群体结构，运用基于加性遗传 相关矩阵的混合线性模型来统计分析PTPRJ基因SNP位点的基因型效应及其与上述40种性 状之间的关系。

所用线性模型为：Y＝μ+X₁β₁+X₂β₂+X₃β₃+Zu+ε

其中μ为群体均值；X₁、X₂、X₃、Z为相应效应的设计矩阵；β₁、β₂、β₃为固定效应，分 别表示基因型、性别、窝效应；u为随机效应，即多效遗传背景，服从于u～N(0，Aσ_a ²)；ε 为残差；相互独立且服从于ε～N(0，Iσ_ε ²)。

接着采用R(3.2.4)语言软件中gaston包对猪PTPRJ基因的SNP与上述性状进行了关联 分析。由表1可知：TT基因型频率为0.22，TG基因型频率为0.54，GG基因型频率为0.24。统计分析发现该PTPRJ基因的T/G突变基因型与80日龄体重、T淋巴细胞亚型含量 (CD4-CD8-CD3-)、嗜碱性粒细胞数(BA)、中性粒细胞百分比(NE％)、嗜碱性粒细胞 百分比(BA％)、白介素-10(IL-10)含量这六个性状呈极显著相关。

本发明筛选的分子标记可用于对猪免疫性状相关基因型的关联分析中，为猪免疫性状分 子标记辅助选择提供一个新的分子标记资源。更详细的技术方案请参见说明书的《附图说明》 及《具体实施方式》中的实施例。

附图说明

图1：本发明总体技术流程示意图。

图2：A图是本发明PTPRJ基因25号外显子的测序结果与ensembl上猪参考转录本PTPRJ-201的cDNA序列比对图(部分)。附图标记说明：标红的碱基为突变碱基，其位于测 序结果的第375位，位于参考转录本第6104位，为T/G突变。B图是本发明PTPRJ基因25 号外显子的测序峰图(部分)。附图标记说明：箭头所指为突变碱基的峰，其位于测序结果 的375位。

图3：本发明PTPRJ基因分子标记的核苷酸序列。附图标记说明：在图中显示核苷酸序列 的第134位碱基处存在一个T/G等位基因突变(134bp处加粗的英文字母“R”为突变位点)。

图4：本发明PTPRJ基因SNP位点与上述40种性状关联分析的曼哈顿图。附图标记说明：横坐标为40种性状，纵坐标为对应的p值的-log₁₀，其中，图上六个点ABCDEF分别表 示80日龄体重、T淋巴细胞亚型含量(CD4-CD8-CD3-)、嗜碱性粒细胞数(BA)、中性粒 细胞百分比(NE％)、嗜碱性粒细胞百分比(BA％)、白介素-10(IL-10)含量等六个性状。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明可通过采用体外基因芯片技术检测猪的基因型，并作为非诊断目的的评价猪的免 疫相关性状，比以往的PCR-RFLP等方法更具有简单、快捷、灵敏度高和特异性好等优点。 同时，本发明还验证了PTPRJ基因的SNP位点(T/G基因型)与80日龄体重、T淋巴细胞亚型含量(CD4-CD8-CD3-)、嗜碱性粒细胞数(BA)、中性粒细胞百分比(NE％)、嗜碱 性粒细胞百分比(BA％)、白介素-10(IL-10)含量这六个性状呈极显著相关，这一结果给 猪免疫相关性状的标记辅助选择提供了重要依据。

具体实施方式

对序列表的说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明分离的PTPRJ基因分子标记片段，其核苷酸序列长度为 250bp，该序列的134位碱基处的R存在一个T/G等位基因突变。

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明 的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1：猪基因分型

(1)试验动物

本发明所用的杜洛克×二花脸F₂资源群体(常规品种)采用远交系F₂代设计，F₀代由8 头杜洛克公猪(常规品种)和18头二花脸母猪(常规品种)组成，F₁代13头公猪与38头母猪避免近亲(全同胞或半同胞)交配，每头母猪只配一次，只产一胎，最后F₂群体规模达到342头，在出生后24小时对每头猪多角度的拍照记录，剪耳和断尾收集猪组织样本。详细记录杜洛克×二花脸F₂资源群体的系谱信息。

(2)猪基因SNP位点的发现

①按常规方法提取若干头猪耳朵基因组混成DNA池，并对DNA进行质量检测，以ensembl数据库(GRCh37)版本上公布的猪基因组参考转录本PTPRJ-201 的cDNA序列为模板扩增PTPRJ基因，将扩增产物送北京六合华大基因公司进行测序。

②利用MegAlign软件对测序结果与参考序列进行比对分析，发现PTPRJ基因25号外显 子上存在着一突变位点，依据其在参考转录本上的位置信息，定位得到ensembl数据库上的 rs333210306处。

③根据比对结果列出包含该SNP位点在内的上下游各大于100bp的序列，以此作为分型 序列。

(3)猪基因分型检测

1)利用试剂盒法提取猪免疫性状测定相关群体的耳朵组织DNA样本。实施例的试剂盒 采用TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取离心柱型试剂盒，由天根生 化科技(北京)有限公司生产。具体步骤为：

①将本发明试验群体(杜洛克(来自广东省)×二花脸F₂资源群体，实施本发明并不限 于上述群体)的耳样组织，用眼科剪剪碎至糊状，加入200μL GA(上述试剂盒自带)，并震荡混匀；然后放入56℃水浴锅中消化过夜。

②将消化后的组织样加入200μL缓冲液GB(上述试剂盒自带)，充分颠倒混匀，于70℃放置10分钟，待溶液变清亮后，简短离心以去除管壁上的水珠。

③加入200μL无水乙醇，充分震荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以 去除管壁上的水珠。

④将上一步所得溶液及絮状沉淀一并加入吸附柱CB3中，并将吸附柱放入收集管中， 12000rpm离心30s，倒掉废液，并将吸附柱放回收集管中。

⑤向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(上述试剂盒自带)，12000rpm离心30s， 倒掉废液，并将吸附柱放入收集管中。

⑥向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(上述试剂盒自带)，12000rpm离心30s，倒掉废液，并将吸附柱放入收集管中，并重复该步骤。

⑦将吸附柱CB3置于室温下放置数分钟，以彻底晾干吸附柱材料中剩余的漂洗液。

⑧将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，并向吸附柱膜中间部位悬空滴加50-200μL 的洗脱液TE(试剂盒自带)，室温下放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离 心管中。

2)SNP基因型的判定及质量控制。使用质谱分型技术(华大基因SequenomMassArray) 进行分型，并对基因型数据进行质检，262个个体分型结果可用。

实施例2：分子标记分型方法在猪免疫性状关联分析中的应用

(1)试验动物

本发明所用的杜洛克×二花脸F₂资源群体采用远交系F₂代设计，F₀代由8头杜洛克公猪 和18头二花脸母猪组成，F₁代13头公猪与38头母猪避免近亲(全同胞或半同胞)交配，每 头母猪只配一次，只产一胎，最后F₂群体规模达到342头，在出生后24小时对每头猪多角度的拍照记录，剪耳和断尾收集猪组织样本。详细记录杜洛克×二花脸F₂资源群体的系谱信 息。

(2)猪群试验处理与血液样品采集

试验猪个体在33日龄进行第一次采血10mL，35日龄按每公斤体重0.5mg的剂量对F₂代所有个体肌肉注射Poly I:C，进行免疫刺激，刺激后4小时后采集第二次血样，并记录刺激 前后体温变化数据。33日龄和35日龄时均称体重。采用前腔静脉采血12mL。将促凝血于室 温状态下静置2小时，2000r/m离心一分钟，吸取上层清液，分装成3管，编上对应编号，置于-20℃冰箱备用。

(3)猪外周血细胞原始样品的制备步骤

1)红细胞溶解：2mL抗凝血(用肝素或者EDTA盐抗凝)加入10mL灭菌EP管，加 入7mL红细胞裂解液，用枪头轻轻吹打混匀，室温裂解4-5min。

2)白细胞分离：2800rpm(最大转速3000rpm)，离心5分钟，弃上清，保留管底细胞沉淀。

3)重复步骤2)：加5mL红细胞裂解液，加5mL生理盐水，轻摇混匀，2800rpm离心 5分钟，弃红色上清，保留管底白细胞沉淀。

4)往白细胞沉淀中加入1mL Trizol试剂(购至宝生物工程大连有限公司)，用移液器 充分抽打、混匀，直到细胞被完全溶解(形成清亮不粘稠的液体)。

(4)免疫指标的测定

血液免疫指标采用免疫学试剂盒测定，按试剂盒说明书操作。Poly I:C刺激后4h采用前 腔静脉采血2mL，用EDTA灭菌真空抗凝管抗凝，采用日本光电MEK—8222K22五分类流 式激光法全自动血液分析仪进行参数五分类血液分析。T淋巴细胞亚型的测定由湖北省预防 医学研究院医学实验动物中心完成。试剂采用英国southernbiotech公司的抗猪CD3-SPRD(PE-Cy5)/抗猪CD8-PE/抗猪CD4-FITC。主要仪器采用美国Beckman-Coulter公司的EPICS ALTRA流式细胞仪，488nm激发光源，EXPO32软件进行分析。流式检测方法： 流式管加入6μL混合抗体(CD3、CD4和CD8)，留一管空白不加抗体。加入猪抗凝血30μL， 混匀，避光孵育20min。加入流式细胞溶血试剂2mL混匀，室温避光孵育13min，直至液 体澄清透明(如不透明应延长时间)。1500rpm离心5min，弃上清。2mL磷酸盐缓冲液(简 称PBS，购至Gibco公司)清洗，1500rpm离心5min，将细胞悬浮于0.5mL PBS中，振荡 混匀后上机检测。

(5)分型结果与猪免疫性状关联分析

利用实施例1分子标记分型结果与猪免疫性状关联分析用于基因型与猪免疫性状关联检 测分析所用的试验猪群来自杜洛克×二花脸F₂资源群体(适用但不仅限于此群体)，规模达 到342头。基因分型所用的DNA由所述猪群(说明书正文和表中所称的“杜洛克×二花脸F₂资源群体”简称“猪”)耳样中提取。

所用线性模型为：Y＝μ+X₁β₁+X₂β₂+X₃β₃+Zu+ε。

其中μ为群体均值；X₁、X₂、X₃、Z为相应效应的设计矩阵；β₁、β₂、β₃为固定效应， 分别表示基因型、性别、窝效应；u为随机效应，即多效遗传背景，服从于u～N(0，Aσ_a ²)； ε为残差；相互独立且服从于ε～N(0，Iσ_ε ²)。

采用R(3.2.4)语言软件中gaston包对猪PTPRJ基因的SNP与上述性状进行了关联分析。 由表1可知：TT基因型频率为0.22，TG基因型频率为0.54，GG基因型频率为0.24。统计分析发现该PTPRJ基因的T/G突变基因型与80日龄体重、T淋巴细胞亚型含量 (CD4-CD8-CD3-)、嗜碱性粒细胞数(BA)、中性粒细胞百分比(NE％)、嗜碱性粒细胞 百分比(BA％)、白介素-10(IL-10)含量这六个性状呈极显著相关。

表1 PTPRJ基因多态性位点基因型与免疫相关性状的关联分析结果

表1的说明：基因型为基因型频率及个体数；CD4-CD8-CD3-为淋巴细胞亚型含量；BA为嗜碱性粒细胞 数；NE％为中性粒细胞百分比；BA％为嗜碱性粒细胞百分比；il10_CalcConc为白介素-10(IL-10)含量， 对应的数值用“平均值±标准差”表示。

本发明原理在于：

PTPRJ基因中包含的一个SNP位点，对应ensembl数据库(GRCh37)版本上的RS号为rs333210306，基因组序列2号染色体的第15633547bp处，该突变位点为等位基因突变，即T/G的碱基突变。这个碱基突变位于所述的PTPRJ基因的第25外显子3`UTR中。本发明进 行提取猪耳样DNA利用芯片分型得到PTPRJ基因序列的SNP位点，如SEQ ID NO：1所述 序列的分子标记(简洁序列)，该分子标记可用于检测猪的免疫性状。

<110> 华中农业大学

<120> PTPRJ基因作为猪免疫相关性状的分子标记及其应用

<130>

<141> 2019-02-20

<160> 1

<170> SIPOSequence Listing 1.0

<210> 1

<211> 250

<212> DNA

<213> 猪（Sus scrofa）

<220>

<221> gene

<222> (1)..(250)

<223>

<220>

<221> mutation

<222> (134)..(134)

<223>

<400> 1

cggatgcccc gcgggccccg gggtgttggg tgcagctggg tgtgggcgga tggcttccgg 60

gcctgcacaa gtggcctgcc cctggcacgc aagccttgca gagctctgtg acttcttcag 120

aggtccctgt tcaggcggca gttctgtgcg ccacacccct tcccactcca gttcctcagg 180

aaaccatggt gatgggggcc gggcgtcaaa tcccacgtgg acgtacgccc cgcccacagc 240

actgccgctg 250

Claims (1)

1.克隆自PTPRJ基因的分子标记在杜洛克×二花脸F₂资源群体的免疫性状中 T淋巴细胞亚型含量、嗜碱性粒细胞数、中性粒细胞百分比、嗜碱性粒细胞百分比、白介素-10含量和80日龄体重性状关联分析中的应用，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如下所示：

CGGATGCCCCGCGGGCCCCGGGGTGTTGGGTGCAGCTGGGTGTGGGCGGATGGCTTCCGGGCCTGCACAAGTGGCCTGCCCCTGGCACGCAAGCCTTGCAGAGCTCTGTGACTTCTTCAGAGGTCCCTGTTCARGCGGCAGTTCTGTGCGCCACACCCCTTCCCACTCCAGTTCCTCAGGAAACCATGGTGATGGGGGCCGGGCGTCAAATCCCACGTGGACGTACGCCCCGCCCACAGCACTGCCGCTG，

上述序列中的第134碱基位的R为T或G的碱基替换，该替换导致所述序列产生多态性。

Images