JPH06506837A - ブタの一腹産子数に関する遺伝的標識 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 ブタの一腹産子数に関する遺伝的標識 発明の分野 本発明はブタ個体間に認められる生殖率の遺伝的差異を検出することに、特に− 腹産子数の多いブタを鑑別するのに有用な遺伝的標識に関する。

発明の背景 繁殖雌ブター頭当たりの産子数と定義されている生殖率は、ブタ肉の効率的な生 産における大きな限定因子である。米国の場合、生存状態で生まれる産子数は平 均すれば一腹につきほぼ９．５頭である。−腹産子数の遺伝性は低い（１０〜１ ５％）ので、過去の一腹産子数を基準にする繁殖雌ブタを選別する標準的な遺伝 的方法は有効ではない。従って、細胞レベルやＤＮＡレベルで生殖について判別 できる方法がめられている。

Ｃｈａｉｎｅｓｅ種の場合、早期に春機発動期を迎えると共に、−腹産子数か多 いことか知られている。一方、Ａｍｅｒｉｃａｎ種についていえば、成育率は高 いか、発育が悪いことが知られている。即ち、両品種の最もよい特徴を組合わせ 、これによって米国のブタ肉生産率を改善することか望ましい。これらを実行す る場合、ブタの一腹産子数増加に関与する遺伝子や遺伝的標識の発見が非常に役 にたっている。

哺乳動物の場合、生殖は脳と生殖期間との間に生じる一連の事態に反応して生じ る。この場合、エストロゲン等のステロイドホルモンが重要な役割をもつ。これ らステロイドホルモンは細胞・組織と相互作用して、一連の事態を開始させ、生 殖が成功裏に終わることになる。

ブタの場合、主に卵巣か産生ずるエストロゲンが子宮、脳及び下垂体に大きな作 用を示す。エストロゲンは春機発動期の開啄　生殖行肱　ゴナドトロピンの周期 的な放出及び飼料摂取行動を調節するものである。エストロゲンのこれら作用は 、エストロゲンがエストロゲン反応細胞の細胞核に存在する特異的な受容体蛋白 質に結合する結果生じるものである。Ｍ　ｃ　Ｅ　ｗ　ｅ　ｎ徹　Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇ、Ｈｏｒｍ、Ｒｅｓ、、３８：　４１−９２　（１９８２）。

ヒトエストロゲン受容体について遺伝情報を指定する遺伝子は同定確認されてい る。そして、この遺伝子はｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒ ｅＣｏｌ　Ｉｅｃｔ　ｉｏｎから一般に入手できる。ＡＴＣＣカタログ、１９９ ０年９月、第１１２頁、登録第５７６８１号。プローブネームはｐＯＲ３で、１ ．３ｋｂであるｏＧ　ｒ　ｅ　ｅ　ｎ　徹Ｎ　ａ　ｔ　ｕ　ｒ　ｅ　（ロンドン ）、　３２０：１３４−１３９　（１９８６）。このヒト遺伝子は制限フラグメ ント長さ多形性（ＲＦＬＰ）分析の結果から多形性であることが知られている。

Ｃａｓｔａｇｎｏｌｉ等、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１５：　８８６ 　（１９８７）、及びＣｏｌｅｍａｎ亀　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１ ６：　７２０８　（１９８８）。これら異なる遺伝子型に関する機能上の差異は よく理解されていないが、乳癌患者に多く見られる自発性流産に関与しているこ とが指摘されている。Ｌｅｈｒｅｒ＆　ＴｈｅＬａｎｃｅｔ、３３５：　６２２ −６２４（１９９０年、３月１７日）。

エストロゲン受容体遺伝子は分離さ札　他の種について配列決定されているが、 ブタについては配列決定されていない。ＫｏｉｋｅＪ　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　 Ｒｅｓ、、１５：　２４９９−２５１３　（１９８７）には、ラットの子宮エス トロゲン受容体のｃＤＮＡクローンの分離及び配列決定について報告がある。著 者は、ラット、ヒト、ニワトリのエストロゲン受容体配列の比較から、３つの高 度に保存された領域が存在していることを指摘し、これら領域がエストロゲン受 容体機能に重要な役割をもつことを示唆している。

さらに、Ｋｏｉｋｅ等は、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

２６：　２５６３−２５６８　（１９８７）でブタエストロゲン受容体結合位置 の部分特性化について報告している。

即ち、この論文は疎水性のＣ末端半領域に恐らくは対応し、かつ対応するラット 、ヒト、ニワトリの配列に対して９０％以上の相同性を示す約３０ｋＤａのフラ グメントについて報告している。

ブタＤＮＡを研究するために幾つかの研究グループがＲＦＬＰ分析法を使用して いる。Ｊｕｎｇ等は、Ｔｈｅｏｒ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、７７：　２７１−２ ７４　（１９８９）で、ＲＦＬＰ分析法を使用して、ブタの２品種間に遺伝的に 違いがあることを示している。これら品種のブタの白血球抗原（ＳＬΔ）クラス Ｉ遺伝子については多形性が証明されている。Ｈｏｇａｎｓｏｎ等は、Ａｂｓｔ ｒａｃｔ　ｆｏｒ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　ｏｆ　Ｍｉｄｗｅｓｔｅｒ ｎ　５ｅｃｔｉｏｎ。

ｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｏｆＡｎｉｍａｌ　５ｃｉｅ ｎｃｅ、１９９０年３月２６−２８日で、ＲＦＬＰ分析法によっても証明されて いる、Ｃｈｉｎｅｓｅ種のブタについてブタの主組織適合性複合（ＭＨＣ）遺伝 子の多形性に関して報告している。また、Ｊｕｎｇ等番Ｌ　Ａｎｉｍａｌ　Ｇｅ ｎｅｔｉｃｓ。

２０：　７９−９１　（１９８９）で、アル種の雄ブタノｓＬＡクラスＩのＲＦ ＬＰ分析について報告している。著者は、分析結果はブタのＳＬＡ／ＭＨＣクラ ス■遺伝子と、産生／性能特徴との間に関連があることを示唆している。また、 著者ｌｅｔ、ＳＬＡクラスｌ１１１限フラグメントを遺伝的標識として使用する ことは将来ブタの性能を改善するのに潜在的に有効であるとしている。

本発明以前に、同定すらされていなかったブタエストロゲン受容体遺伝子にＲＦ ＬＰ分析法を適用した例はなかつ九　本発明はこの点を改善するものである。即 ち、本発明はブタにおける一腹産子数増加に関与するブタのエストロゲン受容体 遺伝子における多形性の発見に基づいて遺伝的標識を提供するものである。これ によって、エストロゲン受容体遺伝子についてブタのスクリーニング及び遺伝子 型の決定が可能になる。また、−腹産子数が平均以上であると期待できる雌雄の ブタを鑑別することも可能になる。

発明の要約 本発明の目的はブタをスクリーニングして、−腹産子数の多いブタを鑑別する方 法を提供することにある。

本発明の別な目的はブタの一腹産子数の遺伝的標識を同定する方法を提供するこ とにある。

本発明のさらに別な目的はブタの一腹産子数の遺伝的標識を提供することにある 。

本発明のさらに別な目的はブタＤＮＡのサンプルを評価するキットを提供するこ とにある。

本発明のさらに別な目的及び利点は一部は以下の説明に示さ札　一部は以下の説 明から明らかなはずであり、また本発明を実施することによっても理解できるは ずである。本発明の目的及び長所は、後述する請求の範囲で明確にした手段及び 組合わせによって実現できる。

上記目的を達成するため１：、そして本開示で広く明らかにする本発明の意図に よれば、本発明はブタをスクリーニングして、繁殖時にどのブタが一腹産子数が 高いがを鑑別する方法を提供するものである。対象とするブタのゲノムＤＮＡの サンプルを取り出し、−腹産子数増加に相関するエストロゲン受容体遺伝子に多 形性か認められるか否かを調べる。本発明の場合、多形性が制限フラグメント長 さ多形性であるのが好ましい。

特異性フラグメント、即ちＲＦＬＰパターンの有無は次の工程により確認する。

まっ、ブタのエストロゲン受容体遺伝子を少なくとも１箇所で分割する制限エン ドヌクレアーゼでゲノムＤＮＡをダイジェスション処理する。

次に、このグイジエスション処理により得られたフラグメントを、好ましくはゲ ル電気泳動によって、分離する。

次に、フラグメントを、これらに交雑できるプローブを用いて検出する。これに よって、制限パターンが生成する。最後に、この制限パターンを、−腹産子数増 加に相関する、この遺伝子の既知ＲＦＬＰパターンと比較する。

第２のパターンは同じ制限エンドヌクレアーゼと同じプローブ（等価であれば、 別なプローブでもよい）を使用することによって得られる。この場合、プローブ としてはヒトエストロゲン受容体遺伝子が好ましい。

別な実施態様によれば、本発明はブタの一腹産子数に関する遺伝的標識を同定す る方法を提供する。同種、異稼　あるいは遺伝的に同系統の雌雄のブタを繁殖さ せ、酸ブタそれぞれの産子数をめる。各ブタのエストロゲン受容体遺伝子の多形 性を決定し、産子数と関連づける。

好ましくは、ＲＦＬＰ分析法を使用して多形性を決定するが、より好ましくは、 制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩＩを使用して、ゲノムＤＮＡをダインニスジョ ン処理する。ブタがＭｅ　ｉ　５ｈａｎ種の場合、この分析により、−腹産子数 増加に関連する４゜　３ｋｂのフラグメントか得られる。

さらに、本発明はブタＤＮＡのサンプルを検定する検定キットの提供を含むもの である。最低でも、この検定キットはブタエストロゲン受容体遺伝子の多形性を 同定する試薬を一種以上含む容器である。好ましい試薬はブタエストロゲン受容 体遺伝子又はそのフラグメントと交雑するプローブである。また、ヒトエストロ ゲン受容体遺伝子も好ましいプローブである。さらに、検定キットがブタエスト ロゲン受容体遺伝子を少なくとも１箇所で分割する制限酵素を含んでいるのか好 ましい。

本明細書の一部でもある添付図面に本発明の一実施態様を示すか、これを参照し て本開示を読めば、本発明の原理を理解できるはずである。

図面の簡単な説明 第１図はヒトニストロケン受容体遺伝子プローブを使用して実施したＤｕｒｏｃ 種（レーン１）及びＣｈｉｎｅｓｅ種（レーン２−１６）のブタについてのＲＦ ＬＰ分析の結果を示す図である。

発明の詳細な説明 以下、本発明の好適な実施態様について詳しく説明する。これらを後述の実施例 と共に読めば、本発明の原理を理解できるはずである。

本発明はブタにおける一腹産子数の遺伝的標識に関する。本発明は、−腹産子数 増加に関連する、エストロゲン受容体遺伝子に多形性か認められるか否かを確認 することによって、ブタをスクリーニングして、繁殖させた場合、どのブタか一 腹産子数増加を示ずがを決定する方法を提供するものである。なお、本開示で使 用する“−腹産子数増加”は、−腹産子数が所与の集団の平均値よりかなり高い ことを意味する。

多形性を検出する好ましい方法はＲＦＬＰ分析を使用する方法であるか、ＲＦＬ Ｐ分析法の適用は最終的には多形性と核酸分子にそって存在するＤＮＡ制限部位 に依存するため、別な多形性検出方法も使用することが可能である。このような 方法には、多形性遺伝子を分析し、この遺伝子にある違いを検出することによっ て多形性を検出する方法がある。

ＲＦＬＰ分析法は一般にはよく知られた技術である。

例えば、あるいは参考として、米国特許第４，５８２゜７８８号（Ｅｒ１ｉｃｈ 、１９８６年４月１５日）、及び同第４．　６６６、　８２８号（Ｇｕｓｅｌｌ ａ、１９８７年５月１９日）をあげておく。広くいえば、この方法では、まづ対 象となるＤＮＡを得てから、このＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼでダインニス ジョン処理し、生成したフラグメンＩ・を分離し、そしてこれらフラグメントを 検出する。

本発明の場合、検査対象となるブタからゲノムＤ　Ｎ　Ａのサンプルを得る。Ｄ ＮＡ源としては一般に末梢血液細胞を使用する。十分な量のＤＮＡを分析するた めには、十分な量の細胞を使用する。このような量については、公知であり、ま た、当業者ならば簡単に知ることができる。同様に、当業者ならば知っている方 法により血液細胞からＤＮＡを分離する。

場合によっては、ポリメラーゼ連鎖反応などの標準的な方法によってＤ　Ｎ　Ａ を増量することが望ましいこともある。この方法については、例えば、あるいは 参考として、米国特許第４．　６８３．　１９５号（Ｍｕｌｌｉｓ徹１９８７年 ７月２８日）、同第４．　６８３．　２０２号（Ｍｕ　ｌ　ｌ　ｉ　ｓ、１９８ ７年７月２８日）、同第４，８００．１５９号（Ｍｕ　ｌ　Ｉ　ｉ　ｓ脹　１９ ８９年１月２４日）、同第４．　８８９．　８１８号（Ｇｅ　ｌ　ｆ　ａｎｄ徹 　１９８９年１２月２６日）、及び同第４．　９０２．　６２４号（Ｃｏｌｕｍ ｂｕｓ＆　１９９０年２月２０日）をあげておく。

次に、制限部位と呼ばれる、特異的なヌクレオチド配列で加水分解的にＤＮＡを 分割又は切断する制限エントヌクレアーゼを用いて、分離したＤＮＡをダインニ スジョン処理する。制限酵素とも呼ばれる、このエンドヌクレアーゼは公知であ る。本発明の場合には、少なくとも１箇所でブタエストロゲン受容体遺伝子を分 割して、遺伝子の少なくとも２つのフラグメントを生成する制限酵素を選択する 必要がある。そして、これらフラグメン１−が多形性であるか否かについて、あ るいはこの多形性が一腹産子数に関連かあるかとうかについて、本開示に従い公 知方法によって決定する。このような制限エントヌクレアーゼとして好ましいの はＰｖυ１１である。本開示かあれｉｆ、ブタＤＮＡ含有サンプルに添加する制 限酵素量やサンプルを処理するためのその他の適正な条件を当業者ならば簡単に 決めることかできる。

次に、制限フラグメントを公知方法によって分析するが、これら方法では一般に フラグメントを分離して、特定パターンを得るか、あるいはフラグメントの異な るサイズを判別する。これを実施するのに好適な方法はゲル電気泳動である。

この方法の場合、印加した電場の影響の下で、支持媒体中でサイズによりダイン ニスジョン処理したフラグメントを分離する。この支持媒体としては、例えば、 アガロースやアガロース−アクリルアミド等のゲルシートやスラブが使用できる 。制限フラグメントを含有するサンプルをゲルの一端に添加する。対照として同 じゲルにサイズ標識を支持し、制限酵素のサイズを評価できるようにする。一般 に、この方法によれば、サイズが異なるフラグメントを分離する分離度を１００ 塩基対まで小さくできる。

好ましくは、分離したフラグメントを次に変性して力）ら、適当な試薬を存在さ せた状態で、かつＤＮＡ転移を促進するのに適当な条件でゲルをフィルター１こ 接触させることによりゲルから、好ましくはナイロン膜であるフィルターに転移 する。このような試薬及び条件（ま公知である。このようにして、分離により生 じるＤＮＡフラグメントの相対位置を維持することができる。

次の工程では、各種カテゴリーのフラグメントサイズを検出するか、あるいは特 定サイズのフラグメントを検出する。後者のフラグメントが特に重要である。と ０うのは、このフラグメントが一腹産子数に関連する遺イ云的標識であるからで ある。いずれの場合も、交雑プローブを使用するのが好ましい。このようなプロ ーブ＋１第１ノコ゛ヌクレオチドかポリヌクレオチドであり、０ずれも交雑する フラグメントに対して十分な相同性を示すので、ブローブーフラグメント複合体 を生成する。好ましく為プローブはｃ　ＤＮＡプローブである。オリゴヌクレオ チド又はポリヌクレオチドは検出可能な標識で標識イヒする。これによって、プ ローブが交雑されて０る制限フラグメントを検出することが可能になる。プロー ブの標識イヒｉｔ標準的な標識化方法、例えば放射性標慕　酵素標１　蛍光標区 　ビオチンーアビンン標識等を使用して実）ｆｆｌすることができる。

本発明では、ヒトエストロゲン受容体遺伝子のｃＤＮＡをプローブのポリヌクレ オチドとして使用する。好ましくは、検出できる部位は３２Ｐ又はビオチン−ア ビジンである。本発明者の発見によれば、このプローブはブタエストロゲン受容 体遺伝子に対して十分な相同性を示すので、この遺伝子だけでなく、制限エンド ヌクレアーゼが産生ずる各種フラグメントにも結合する。しかし、本開示があれ ば、当業者ならば他の実質的に等価なプローブを見いだすことができるはずであ る。本開示の場合、ヒトエストロゲン受容体遺伝子に対して“実質的に等価な” プローブとは、同じ制限酵素を使用した場合、ヒトエストロゲン受容体遺伝子と 同様に、ブタエストロゲン受容体遺伝子のグイジエスショント物の同じ多形性フ ラグメントに交雑するプローブを指すものである。例えば、ブタの一腹産子数に 関連する特定フラグメント（マ公知方法により配列決定でき、また合成プローブ も公知方法によって調製できる。

好ましい方法では、プローブか制限フラグメントに交雑するのに適当な交雑条件 で十分な時腓　このフラグメントを含有するナイロン膜にプローブを接触させて 力１ら、好ましくは、フィルターを洗浄して、未結合プローブやその他の望まし くない物質を除去する。

フィルターに結合したブローブーフラグメント複合体は、この場合、公知方法に よって検出する。例えｆ？、プローブを放射線標識化（３２Ｐ）した場合、検出 するには、ナイロン膜紙を放射線感受性フィルム片に接触させる。適当な時間露 光すると、対照フラグメントを含む対象となるフラグメントを視認することかで きる。

検出工程ではフラグメントのサイズによる分離で生しるパターンか得られる。こ れらフラグメントと同しゲルに支持した既知サイズの対照フラグメントとを比較 すると、各種グループのフラグメントのサイズを評価することができる。この場 合、ブタエストロゲン受容体遺イ云子の各多形性は多数の異種ブタからのＤＮＡ を同様（二分析して得たパターンと比較することによって決定する。一部のブタ の場合、パターンはその他のブタの大部分（こより得られる通常のパターンとは 相違して（Ｘる。これＣよ、ひとつ以上の制限フラグメント長さ多形性１こよる 。即ち、ブタエストロゲン受容体遺伝子を切断するエンドヌクレアーゼが産生ず る異なる長さの制限フラグメント（こよる。これはこのようなブタに異なる塩基 対配列力（存在することを示している。

特定ＲＦＬＰを、即ち特定長さの制限フラグメントを同定したなら、このフラグ メントに対するプローブを公知方法によって構成する。これによって、多形性を 迅速に検出できる別な方法が可能になる。例えば、ＤＮＡをダイジエスション処 理したならば、サントイ・ソチ形交雑法が使用できる。このような検定法につ（ り璽は、参考とシテ、米国特許第４．　４８６．　５３９号（Ｒａｎｋｉ等、１ ９８４年１２月４日）及び同第４．　５３６．　４１９号（Ｒａｎｋｉ鳳　１９ ８６年１月７日）を挙げておく。固体支持体に固定した捕獲プローブにサンプル を接触させる。このプローブがフラグメントを結合する。次に、支持体を洗浄し 、標識化検出プローブを加える。さらに洗浄してから、検出プローブを検出する ことによって、所望のフラグメントの存在を確認する。

ＲＦＬＰパターンを、あるいは特定の多形性フラグメントを決定したならば、− 腹産子数に相関する第２の既知ＲＦＬＰパターン又はフラグメントとこれを比較 する。この第２のパターン又はフラグメントについても、第１の場合と同じ制限 エンドヌクレアーゼ及び同じプローブ（又はその等価プローブ）を使用してブタ エストロゲン受容体遺伝子により決定する。

本発明の別な実施態様では、制限フラグメントは溶液交雑によって検出できる。

この方法では、プローブでフラグメントを交雑してから、これを分離する。次に 、前述したように、プローブの検出できる部位を検出することによって分離した ブローブーフラグメント複合体を検出する。一般に、フィルター紙に移さなくて も、このような複合体はゲル上で検出できる。

上記方法はいずれも単一の制限酵素及び単一のプローブの使用により実施するも のとして説明したか、これら以外でも実施可能である。即ち、所望ならば、１種 以上の制限酵素及び／又はプローブを使用することができる。

これら酵乳　品種及び構成プローブは通常の実験により決定することができる。

ブター腹産子数の遺伝的標識は次のようにして決定する。同じ品種又は異種の、 あるいは遺伝的に同系統の雌雄のブタを交尾させる。酸ブタそれぞれの産子数を 決定する。既に説明したようにして、親のＤＮＡをＲＦＬＰ分析して、各ブタの エストロゲン受容体遺伝子の多形性を決定する。多形性か産子数に関与する。こ れらの決定を行うさいには、少なくとも２０頭の、好ましくは少なくとも４０頭 の酸ブタを使用する。各酸ブタの出産回数（即ち出産順位）は少なくとも１であ る。好ましくは、繁殖／出産周期は少なくとも２度、特に少なくとも３度繰り返 す。ブタの好適な品種はＭｅｉｓｈａｎ、Ｆｅｎｇｊｉｎｇ、Ｍｉｎｚｈｕ、Ｄ ｕｒｏｃＳ　Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、Ｌａｎｄｒａｃｅ、Ｌａｒｇｅ　Ｗｈｉｔｅ 。

Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ、５ｐｏｔｔｅｄ　Ｐｏ１ａｎｄＣｈ　ｉ　ｎ　ａ、Ｂ　ｅ 　ｒ　ｋ　ｓ　ｈ　ｉ　ｒ　ｅ、Ｐ　ｏ　ｌ　ａ　ｎ　ｄ　Ｃｈｉ　ｎ　ａ、そ してＣｈｅｓｔｅｒ　Ｗｈｉｔｅである。最も好ましい品種はＤｕｒｏｃ、Ｈａ ｍｐｓｈｉｒｅ、Ｌａｎｄｒａｃｅ、Ｌａｒｇｅ　Ｗｈｉｔｅ、Ｙｏｒｋｓｈ　 ｉ　ｒ　ｅ、及びＣｈｅｓｔｅｒ　Ｗｈｉｔｅである０　この分析をＭｅｉｓｈ ａｎ種について行い、制限エンドヌクレアーゼｐｖｕＩＩを使用するＲＦＬＰ分 析法によって多形性を決定した場合、−腹産子数増加には４．３ｋｂのフラグメ ントが関与する。

本発明方法を適用するのに好適な試薬は手頃なキットにバックすることができる 。即ち、適当な容器に必要物質をバックしたキットである。最低でも、このキッ トには、−腹産子数増加に関与するブタエストロゲン受容体遺伝子の多形性を同 定する試薬をバックする。好ましくは、試薬はブタエストロゲン受容体遺伝子又 はそのフラグメントと交雑するプローブである。また、好ましくは、このプロー ブと、ブタエストロゲン受容体遺伝子を少なくとも１箇所で分割する制限酵素の 両方をキットにバックする。本発明の特に好ましい実施態様では、ヒトエストロ ゲン受容体遺伝子、ブタエストロゲン受容体遺伝子、あるいは検出可能な標識で 標識化した遺伝子フラグメントでプローブを構成し、制限酵素をＰｖｕ　Ｉ　Ｉ で構成する。さらに、キットには検出可能な標識を検出又は測定する、あるいは 対照となる試薬を追加バックしておくのが好ましい。また、所望ならば、文殊　 予交凰　ＤＮＡ抽出等に使用する試薬も追加パックしておくことも可能である。

また、本発明の方法及び物は、全般的にいえば、ブタＤ　Ｎ　Ａ、各ブタの遺伝 子型を検定するために、そしてブタの遺伝的差異を検出するためにも使用するこ とができる。特に、ブタのゲノムＤＮＡのサンプルをひとつ以上の対照と対照す ることによって評価することができる。

また、ブタエストロゲン受容体遺伝子についてＲＦＬＰ分析を行い、結果を対照 と比較することもできる。この対照は、異種ブタのエストロゲン受容体遺伝子の ＲＦＬＰ分析の結果である。同様に、ブタのゲノムＤＮＡのサンプルを得てから 、このＤＮＡのエストロゲン受容体遺伝子をＲＦＬＰ分析し、結果を対照と比較 することによって、このブタの遺伝子型を決定することもできる。上記と同様に 、この対照も異種ブタのエストロゲン受容体遺伝子のＲＦＬＰ分析の結果である 。最後に、少なくとも２品種のブタからゲノムＤＮＡをサンプルを得てから、多 形性の有無をエストロゲン受容体遺伝子について同定し、結果を比較することに よってブタ間の遺伝的差異を検出することも可能である。

これら検定は、既に説明したように一腹産子数に関係する遺伝的標識を同定して 、他の特徴と相関関係かあるかもしれないエストロゲン受容体遺伝子の他の多形 性を同定するために、またブタの遺伝子型及び表現型を一般的に科学的に分析す るためにも有用である。

なお、本発明の開示を科学的問題や環境に適用することは、本開示かある限り、 当業者か実施可能な範囲にある。以下、本発明の方法及び産生物について実施例 により説明する。

実施例Ｉ Ｍｅ　ｉ　ｓ　ｈ　ａ　ｎ種ブタにおける一腹産子数増加に関与する遺伝的標識 実験物及び実験方法 ＲＦＬＰ検出を次の方法で行っｔ：、、各ブタから１０ｍ１の殺菌血液を採血し ｆ二　白血球からゲノムＤＮＡを分離してから、Ｐｖｕ　Ｉ　Ｉ制限エンドヌク レアーゼでタイジエスション処理し、エストロゲン受容体遺伝子に交雑させ總　 この方法の概略については、参考として、Ｆｌａｎａｇａｎ等のＩｍｍｕｎｏｇ ｅｎｅ　ｔ　ｉ　ｃｓ２７：４６５−４６９　（１９８８）を挙げておく。交雑 ゲルに平行に支持したＨｉｎｄＩＩ　ｃｕｔ　Ｉａｍｂｄ’ａＤＮＡの分子サイ ズ標識と比較することによって制限フラグメントの分子サイズを決定し７′ｏ　 Ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ ｏｎ　ＮＩＨｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　ａｎｄ　Ｍｏｕｓｅ　 ＤＮＡ　Ｐｒｏｂｅｓ　（ＡＴＣＣＮｏ、５７６８１）がら入手した、ヒト（遺 伝子座ＥＳＲ）から分離されたエストロゲン受容体遺伝子から得た１、３ｋｂの プローブをエストロゲン受容体プローブとして使用しな 結果 プローブとしてヒトエストロゲン受容体遺伝子を使用して、　ＣｈｉｎｅｓｅＳ 　Ａｍｅｒｉｃａｎ及びＮ１８種小形ブタにＲＦＬＰ分析を実施して、ブタにお ける相同性エストロゲン受容体遺伝子座の遺伝的差異を検出した。この結果、少 なくとも４つのフラグメントが多形性であることが判明し九　これらフラグメン トは３．　７．４．３．５．　０及び７．７ｋｂレベルにある。

さらに、２２頭のＭｅｉｓｈａｎ原種雌ブタの一腹産子数に多形性制限フラグメ ントパターンが関係しているからどうかについて調べ總　表１参虱　結果から、 ４３ｋｂのフラグメントをもつものは一腹産子数が増えたが、４．３ｋｂのフラ グメントをもたないものは欠陥ブタであることが判明し九　即ち、本発明はＭｅ ｉｓｈａｎ種ブタにおける一腹産子数の遺伝子標識を見いたしたものである。

表１ Ｍｅ　ｉ　５ｈａｎ種雌ブタのおける一腹産子数の出産順位による平均値及び標 準誤差、及びエストロゲン受容体フラグメント ｆ：　ｊ３Ｅ フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、ＳＤ、　５Ｅ （７２）発明者　ジャコブソン、キャロル　ディー。

アメリカ合衆国　アイオワ州　５００１０．エイムズ、プレアリ−ビュー　イー スト

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. １．ブタをスクリーニングして、どのブタが−腹産子数が多いかを鑑別する方法 において、 対象とするブタのゲノムＤＮＡのサンプルを取り出し、次に、−腹産子数増加に 関与する、エストロゲン受容体遺伝子における多形性の有無を決定する工程から なるブタのスクリーニング鑑別方法。
2. ２．上記多形性が制限フラグメント長さ多形性（ＲＦＬＰ）である請求の範囲第 １項に記載の方法。
3. ３．上記ＲＦＬＰの有無を同定する工程が、ブタエストロゲン受容体遺伝子を少 なくとも１箇所で分割する制限エンドヌクレアーゼでダイジェスション処理し、 この処理により得られたフラグメントを分離し、該フラグメントに交雑できるプ ローブで該フラグメントを検出することによって、制限パターンを形成し、そし て 該制限エンドヌクレアーゼ及び該プローブ又はその等価物を使用して得たブタエ ストロゲン受容体遺伝子の第２ＲＦＬＰパターンを該制限パターンと比較する工 程からなり、該第２ＲＦＬＰパターンが−腹産子数増加に関与する請求の範囲第 ２項に記載の方法。
4. ４．上記制限エンドヌクレアーゼがＰｖｕＩＩである請求の範囲第３項に記載の 方法。
5. ５．上記分離をゲル電気泳動により行う請求の範囲第３項に記載の方法。
6. ６．上記プローブがヒトエストロゲン受容体遺伝子かその実質的等価物で、該遺 伝子又は実質的等価物を検出可能な標識で標識化した請求の範囲第３項に記載の 方法。
7. ７．上記制限パターンを比較する上記工程で、特異的フラグメントをサイズによ り同定し、該フラグメントのサイズを比較する請求の範囲第３項に記載の方法。
8. ８．上記ダイジェスション処理工程に先立って、上記ブタエストロゲン上記遺伝 子を増量する工程を実施する請求の範囲第３項に記載の方法。
9. ９．上記ＲＦＬＰの有無を同定する上記工程が、ブタエストロゲン受容体遺伝子 をフラグメントに分割する制限酵素を上記サンプルに加え、そして該フラグメン トの異なるサイズを検出する工程からなる請求の範囲第２項に記載の方法。
10. １０．上記フラグメントの異なるサイズを検出する上記工程が、既知サイズの対 象ＤＮＡフラグメントの存在下でゲル電気泳動を使用して、該フラグメントをサ イズにより分離し、 分離したフラグメントを、該フラグメントに交雑して、プローブーフラグメント 複合体を形成するプローブに接触させ、そして 該プローブーフラグメント複合体の存在を検出し、そして該対象ＤＮＡフラグメ ントに対するその相対位置を決定することによって分離したフラグメントのサイ ズを決定する工程からなる請求の範囲第９項に記載の方法。
11. １１．上記ＲＦＬＰの有無を同定する上記工程が、ブタエストロゲン受容体遺伝 子をフラグメントに分割する制限酵素を上記サンプルに加え、そして既知サイズ のＤＮＡフラグメントの有無を決定する工程からなる請求の範囲第２項に記載の 方法。
12. １２．既知サイズの上記ＤＮＡフラグメントの有無を決定する上記工程が、 既知サイズの上記ＤＮＡフラグメントに交雑して、プローブーフラグメント複合 体を形成するプローブに上記サンプルを接触させ、そして 該複合体の有無を検出する工程からなる請求の範囲第１１項に記載の方法。
13. １３．同種又は異種の、あるいは遺伝的に同系統の雌雄のブタを繁殖させ、 各雌ブタの産子数を決定し、 各ブタのエストロゲン受容体遺伝子における多形性を決定し、そして 該産子数を該多形性に関連づける工程からなるブタ−腹産子数の遺伝的標識を同 定する方法。
14. １４．上記多形性をＲＦＬＰ分析によって決定する請求の範囲第１３項に記載の 方法。
15. １５．上記品種がＭｅｉｓｈａｎ、Ｆｅｎｇｊｉｎｇ、Ｍｉｎｚｈｕ、Ｄｕｒｏ ｃ、Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、Ｌａｎｄｒａｃｅ、Ｌａｒｇｅ　Ｗｈｉｔｅ、Ｙｏｋ ｓｈｉｒｅ、及びＣｈｅｓｔｅｒ　Ｗｈｉｔｅからなる群から選択した請求の範 囲第１３項に記載の方法。
16. １６．上記品種がＭｅｉｓｈａｎで、上記多形性をＲＦＬＰ分析によって決定す る請求の範囲第１５項に記載の方法。
17. １７．上記ＲＦＬＰ分析で、制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩＩでゲノムＤＮＡ をダイジェスション処理する請求の範囲１６項に記載の方法。
18. １８．上記ＲＦＬＰ分析により、−腹産子数増加に相関関係がある４．３ｋｂの フラグメントが産生する請求の範囲第１７項に記載の方法。
19. １９．対照に対照することによってブタのゲノムＤＮＡのサンプルを評価する方 法において、 ブタエストロゲン受容体遺伝子のＲＦＬＰ分析を行い、そして 該分析の結果を対照と比較する工程からなり、該対照が、ゲノムＤＮＡのサンプ ルを採取したブタとは異なるブタのエストロゲン受容体遺伝子のＲＦＬＰ分析の 結果からなる方法。
20. ２０．ブタの遺伝子型を決定する方法において、ブタからゲノムＤＮＡのサンプ ルを取り出し、該ＤＮＡにおけるエストロゲン受容体遺伝子についてＲＦＬＰ分 析を行い、そして 該分析の結果を対照と比較する工程からなり、該対照が異種のブタのエストロゲ ン受容体遺伝子のＲＦＬＰ分析の結果からなるブタの遺伝子型を決定する方法。
21. ２１．ブタ間にある遺伝的差異を検出する方法において、少なくとも２品種のブ タからゲノムＤＮＡのサンプルを採取し、 該サンプルのエストロゲン受容体遺伝子における多形性の有無を同定し、そして 該同定工程の結果を比較する工程からなる遺伝的差異の検出方法。
22. ２２．多形性の有無を同定する上記工程で、上記エストロゲン受容体遺伝子のＲ ＦＬＰ分析を行う請求の範囲第２１項に記載の方法。
23. ２３．請求の範囲第１３項に記載の方法で同定した遺伝的標識。
24. ２４．ブタから分離したＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩＩでダイジェ スション処理することによって得た４．３ｋｂの制限フラグメントからなるブタ の−腹産子数の遺伝的標識。
25. ２５．ブタエストロゲン受容体遺伝子における多形性を同定する試薬を容器にパ ックした、ブタＤＮＡのサンプルを評価するキット。
26. ２６．上記試薬がブタエストロゲン受容体遺伝子か、あるいはそのフラグメント にこう雑するプローブである請求の範囲第２５項に記載のキット。
27. ２７．上記プローブが検出可能な標識で標識化したヒトエストロゲン受容体遺伝 子か、あるいはその等価物である請求の範囲第２６項に記載のキット。
28. ２８．更に、ブタエストロゲン受容体遺伝子を少なくとも１箇所で分割する制限 酵素を含む請求の範囲第２５項に記載のキット。
29. ２９．更に、上記プローブを検出する手段を含む請求の範囲第２８項に記載のキ ット。
30. ３０．更に、対照手段を含む請求の範囲第２９項に記載のキット。