CN101792798A - 苏太猪抗f18大肠杆菌病新品系的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及苏太猪抗F18大肠杆菌病新品系的培育方法，具体是：第一步：利用FUT1基因标记对苏太猪核心群检测基因型，选择AG个体为亲本进行杂交，杂交后代组建为抗病育种基础群；第二步：选留基础群中AA型个体，对AA型群体重要经济性状进行检测和选择，进行分子标记育种效率评估，同时运用BLUP模型进行种猪的遗传评估，组建第一个世代；第三步：采用常规育种技术并结合分子标记辅助选择进行持续测定分析和世代选育提高，经过4-5个世代，育成的新品系猪具有抗断奶仔猪腹泻和水肿病、瘦肉率高、肉质优、饲料报酬高、产仔数多、抗应激、适应环境能力强的优点。本发明还可为其他培育猪种的抗断奶仔猪腹泻和水肿病抗病育种提供指导。

Description

苏太猪抗F18大肠杆菌病新品系的培育方法

技术领域

本发明涉及优质高效苏太猪抗F18大肠杆菌病新品系的培育方法，属于动物遗传育种与繁殖、分子生物学技术领域。

背景技术

产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是引起仔猪腹泻的主要病原。其致病性决定于它们在宿主上皮细胞上的定居能力和产生肠毒素的能力，两者缺一不可。依靠黏附素，ETEC特异性吸附在小肠上皮细胞表面，其产生的肠毒素进入肠上皮细胞内发挥病理效应。F18大肠杆菌是目前在养猪业中发生最普遍、危害最大的肠毒素大肠杆菌病原之一。Vogeli等(1997)研究表明，FUT1基因是ETEC F18受体蛋白基因，位于猪染色体6q11区段，开放阅读框(ORF)的长度为1098bp；FUTI基因开放阅读框架第307bp的G-A碱基转换(M307^G-A)导致其编码产物-FUT1酶第103氨基酸由丙氨酸(Ala)替换为苏氨酸(Thr)，改变了FUT1酶的活性，进而阻抑了ETEC F18对仔猪小肠的粘附。因此，FUT1基因型为AA型的猪抗大肠杆菌F18(ETEC F18)的侵染，而AG与GG型猪对ETEC F18易感。不同品系猪的FUT1基因突变的频率不同，FUT1酶基因突变可以作为一个遗传标记，用于筛选对F18菌毛化大肠杆菌具抵抗力的新品系。Meijerink等(2000)对FUT1酶基因多态性作了深入研究，遗传学和酶动力学的研究结果都支持这样一个结论，即FUT1酶的第103个氨基酸(即FUT1基因M307位点)对小肠粘膜F18菌毛受体的表达具有重要的作用。这个突变改变了蛋白质的构象和功能，使得苏氨酸(中性-极性)代替了丙氨酸(中性-非极性)，该基因的表达造成了红细胞酶系统的改变，导致猪对F18黏附素的抗性和敏感性，AA基因型猪表现为抗性，GG基因型猪表现为敏感性，杂合子AG型也同样为易感猪。本课题组已经系统研究了国内外部分猪种(其中包括18个国内地方猪种、1个培育猪种和野猪)FUT1基因M307位点的多态性，发现群体中AA基因型(抗性型)个体占少数且只出现在外来猪种中。国内许多学者如晏学明等(2003)、施启顺等(2002，2003)和刘月环(2001)等人，分别对杜洛克、皮特兰、约克夏、长白猪和汉普夏等5个外来猪种和几十个国内地方猪种FUT1基因M307位点的研究中发现，在所有的中国地方猪种中不仅也同样均未检测到AA型个体，也均未检测到AG型个体，全部为GG型，呈极端偏态分布，这与本课题组研究的结果完全一致(吴圣龙等，2006；Bao et al，2008)。

苏太猪，是以太湖猪为母本，杜洛克为父本，由苏州市苏太猪育种中心历经十五年培育成功的瘦肉型猪新品种，具有生产性能优良、肉质鲜美等优点，受到了广大饲养者和消费者的欢迎。但是F18大肠杆菌等病原引起的腹泻病和水肿也是在苏太猪生产中常见的疾病之一。由于苏太猪具有引进猪种杜洛克的血统，推测在苏太猪群体中应该具有FUT1基因M307位点的多态性，因此利用FUT1基因标记对苏太猪核心群全面检测基因型，结果在643头苏太猪母猪和17头苏太公猪分别存在65头和3头AG型个体；结合生产性能确定交配组合，组建了苏太猪F18大肠杆菌抗病育种基础群，并成功地建立了在菌体表面展示表达的F18黏附素体外黏附和黏附抑制试验系统，可以对猪不同抗病基因多态性与大肠杆菌F18抗性/易感性的相关性进行准确快速的分析鉴定，通过持续测定基础群中AA基因型(抗性型)的繁殖性能、生长速度、瘦肉率、胴体品质等性状，建立若干家系，进行选种和选配，通过4-5个世代的培育，最终培育出苏太猪抗F18大肠杆菌病新品系，充分发挥苏太猪的遗传潜力和综合经济效益。

发明内容

本发明的目的是提供一种在苏太猪中科学可行的抗F18大肠杆菌病新品系的培育方法，新品系猪具有抗断奶仔猪腹泻和水肿病、瘦肉率高、肉质优、饲料报酬高、产仔数多、抗应激、适应环境能力强的优点，该方法还可以为国内其他培育猪种的抗断奶仔猪腹泻和水肿病抗病育种提供指导。

本发明的技术方案是：利用FUT1基因标记对苏太猪核心群全面检测基因型，利用在公猪和母猪中检测到的AG型个体，结合生产性能确定交配组合，组建苏太猪F18大肠杆菌抗病育种基础群，并对抗性个体(AA基因型)大肠杆菌F18抗性/易感性进行进一步验证，对AA抗性型群体的繁殖性能、生长速度、瘦肉率、胴体品质等性状持续进行检测和选择，进行分子标记育种效率评估，建立MAS育种体系，并运用BLUP模型进行种猪的遗传评估。群体继代选育和分子标记辅助选择的方法，通过4-5个世代的培育，最终培育出苏太猪抗F18大肠杆菌病新品系。

所述的新品系培育方法包括以下步骤：

(1)以苏太猪核心群中FUT1基因M307AG型个体为亲本，杂交后代按常规选种标准选留后代个体，组建苏太猪F18大肠杆菌抗病育种基础群；

(2)对基础群中AA抗性型群体的繁殖性能、生长速度、瘦肉率、胴体品质等性状进行检测和选择，组建第一个世代；

(3)用群体继代选育和分子标记辅助选择的方法，经过4-5个世代，逐步实现既定育种目标，建立新品系核心群。

所述抗F18大肠杆菌病新品系猪的性能指标为：

抗病力：抗断奶仔猪腹泻和水肿病，并具有很强的抗应激能力和抗逆性。

繁殖性能：新品系猪总产仔数最高达到19头，核心群经产母猪产仔在14.5头以上。

生长性能：175日龄体重90Kg，料重比3.0∶1。

屠宰性能及肉质：胴体瘦肉率57％以上，肉质优良，肌内脂肪≥2.5％，无肉色苍白、质地松软、切面渗出和深色、硬实、干燥肉，系水力≤3％，大理石纹评分2.8-3.0，肉色评分3.0-4.0，屠宰后45分钟内测定的酸碱度在6.3-6.6之间，屠宰后24小时测定的酸碱度在5.4-5.8之间，嫩度≤3.6％。

本发明的有益技术效果主要体现在：

1)传统的新品系培育技术，主要基于表型性状进行选择，存在周期长、遗传进展缓慢等缺点，本发明的培育技术将分子标记辅助选择和常规选种选育有机结合，克服了上述缺点，在仔猪初生时进行耳号标记时顺带收集耳组织样本，利用有利分子遗传标记和常规育种值估计，确定分子综合选择指数，缩短世代间隔、加快育种进程，首次在国内培育猪种中培育出了抗F18大肠杆菌病新品系。

2)本发明培育的新品系猪不仅抗断奶仔猪腹泻和水肿病，还具有瘦肉率高、肉质优、饲料报酬高、产仔数多、抗应激、适应环境能力强的优点，可以直接用于优质瘦肉型商品猪生产，还可以组成杂交配套系的母系，同时该方法为国内其他培育猪种的抗断奶仔猪腹泻和水肿病抗病育种提供了指导。

附图说明

图1为苏太猪F18大肠杆菌抗病育种基础群FUT基因M307检测结果。

其中泳道1-5、8、10-12为GG型，泳道13、14为AA型，泳道6、7、9为AG型，M为pUC19 DNA/Msp I(Hpa II)Marker。

图2为苏太猪F18大肠杆菌抗病育种基础群FUT基因M307的3种基因型大肠杆菌F18抗性/易感性验证结果。

其中：

A是：M307^GG基因型断奶仔猪小肠上皮细胞黏附表达F18ab菌毛的标准菌株107/86

D是：M307^AG基因型断奶仔猪小肠上皮细胞黏附表达F18ab菌毛的标准菌株107/86

G是：M307^AA基因型断奶仔猪小肠上皮细胞黏附表达F18ab菌毛的标准菌株107/86

B是：M307^GG基因型断奶仔猪小肠上皮细胞黏附诱导表达F18ab菌毛的重组大肠杆菌rE.coli1534

E是：M307^AA基因型断奶仔猪小肠上皮细胞黏附诱导表达F18ab菌毛的重组大肠杆菌rE.coli1534

H是：M307^AG基因型断奶仔猪小肠上皮细胞黏附诱导表达F18ab菌毛的重组大肠杆菌rE.coli1534

C是：M307^GG基因型断奶仔猪小肠上皮细胞黏附诱导表达F18ab FedF亚单位的重组大肠杆菌pnirBMisL-fedF

F是：M307^AA基因型断奶仔猪小肠上皮细胞黏附诱导表达F18ab FedF亚单位的重组大肠杆菌pnirBMisL-fedF

I是：M307^AG基因型断奶仔猪小肠上皮细胞黏附诱导表达F18ab FedF亚单位的重组大肠杆菌pnirBMisL-fedF

图3是组建苏太猪F18⁺大肠杆菌抗病育种基础群杂交示意图

具体实施方式

1)利用FUT1基因标记对苏太猪核心群全面检测基因型

利用FUT1基因标记对苏太猪核心群(643头苏太猪母猪和17头苏太公猪)全面检测基因型，在仔猪出生后正常进行猪耳号标记时每个个体留取耳组织块约1.0g，放入1.5mL的Eppendoff管内于冰盒中取回扬州大学动物遗传育种与繁殖重点学科实验室备用。按常规酚-氯仿法提取DNA。根据已公布的猪FUT1基因序列L50534设计引物，上游引物为：5′-CCAACGCCTCCGATTCCTGT-3′，下游引物为：5′-GTGCATGGCAGGCTGGATGA-3′，预期扩增片段为161bp。PCR扩增反应体系为20μL：DNA模板1.0μL(约100ng)，10×PCR buffer 2μL，引物(10μmol/L)各1μL，dNTP(2.5mmol/L)1.5μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，以及ddH₂O 13.3μL。反应条件：样品经94℃变性5min后，按照下列程序进行扩增：94℃40s，60℃40s，72℃45s，32个循环后，72℃延伸10min，4℃保存。酶切反应体系为10μL，包括PCR产物3μL，限制性内切酶Hin6 I(5U/μL)0.2μL，10×buffer 1μL，ddH₂O 5.8μL，置37℃恒温反应3h后，经10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳银染分析。

2)检测到的AG型个体结合生产性能确定交配组合，组建了苏太猪F18大肠杆菌抗病育种基础群

在643头苏太猪母猪和17头苏太公猪分别存在65头和3头AG型个体；结合生产性能确定交配组合，组建了苏太猪F18⁺大肠杆菌抗病育种基础群(图3)。

将苏太猪F18⁺大肠杆菌抗病育种基础群(F1代)继续进行FUT1基因的基因型测定(图1)，结合常规选种的标准，选留了576头个体，并且在相同饲养管理环境条件下按家系分开饲养。

3)对基础群中AA基因型个体大肠杆菌F18抗性/易感性进行进一步验证

将仔猪剖杀后，各取十二指肠、空肠肠段15cm立即放入预冷的PBR溶液中，每段肠管用PBR溶液轻柔冲洗三遍后，再用30mL预冷IPBR冲洗一遍，将肠道外翻后短暂地在IPBR溶液中清洗一下，然后转移到盛有200mL IPBR溶液的烧杯中，于室温下以100r/min的速度匀速搅拌10min。弃肠段，将烧杯中液体转移至离心管，在0℃下，200g，离心10min。沉淀重新悬浮在PBR溶液中轻轻洗涤一次，再次离心，用预冷的MEM重新悬浮沉淀的细胞，将细胞浓度调整到10⁶-10⁷个细胞/ml。

将987P和107/86标准株大肠杆菌的单个菌落分别接种到3～5mL LB培养基，37℃振荡培养过夜(16～18h)，次日将细菌用PBS反复离心洗涤3次，调整细菌浓度至约1×10⁹CFU/mL。

将重组菌rE.coli1534的单个菌落首先接种于含100μg/mL氨苄青霉素的3～5ml LB培养基，37℃振荡培养过夜，次日取出50μL再接种于5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡培养约2h，使细菌处于大约对数生长中期，OD₆₀₀＝0.5-0.7时，加入诱导剂100mmoL/L IPTG至终浓度为0.2mmol/L，37℃继续培养3h后终止诱导，然后将细菌用PBS反复离心洗涤3次，调整细菌浓度至约1×10⁹CFU/mL。

将重组菌pnirBMisL-fedF的单个菌落接种于含100μg/mL氨苄青霉素的5mlLB培养基，于37℃首先在有氧的环境中振荡培养过夜，再置于厌氧罐中诱导表达6h，然后将细菌用PBS反复离心洗涤3次，调整细菌浓度至约1×10⁹CFU/mL。

上述培养的野生型大肠杆菌及诱导表达后的重组菌与相应单克隆抗体或抗血清作玻板凝集试验，在确认凝集试验阳性，而阴性对照不凝集后，将上述细菌用于黏附和黏附抑制试验。分别取上述野生菌或诱导表达的重组菌菌液0.5mL，在其中添加终浓度为1％甘露糖于37℃作用30min后和0.5mL小肠上皮细胞混合，再于37℃孵育30min，1000r/min离心5min，用PBR溶液悬浮后取50μL滴于洁净玻片上，自然干燥，火焰固定，用美兰染色3-5min，油镜观察结果。发现M307^AA基因型30～35日龄断奶仔猪的小肠上皮细胞均不能与表达F18ab菌毛标准菌株107/86、诱导表达的重组大肠杆菌rE.coli1534及诱导表达的重组大肠杆菌pnirBMisL-fedF发生黏附作用，为抗性型(见图2)。

4)对AA抗性型群体的早期生长速度、繁殖性能、一般抗病力等性状持续进行检测和选择，组建第一个世代

以AG和GG敏感型群体为对照，对AA抗性型群体初生重；35日龄断奶重；60kg(后备猪)体长、体高、后躯宽和背膘厚；繁殖性能已经稳定的第3和第4胎次的总产仔数(TNB)；产活仔数(NBA)、初生窝重(BWL)、断奶成活数(NW)及断奶窝重(WWL)；异嗜性粒细胞与淋巴细胞比率(Heterophil/Lymphocyte，H/L)、绵羊红细胞(sheep blood red cell，SRBC)抗体滴度、红细胞计数(RBC)、红细胞压积(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白含量(MCH)，红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)、血小板计数(PLT)、血小板平均体积(MPV)、血小板压积(PCT)、血小板体积分布宽度(PDW)、红细胞体积分布宽度(RDW)、血红蛋白(HGB)、白细胞计数(WTBC)等指标进行持续测定，发现苏太猪抗病育种基础群中FUT1基因第307位点的AA基因型(大肠杆菌病抗性型)不仅对仔猪断奶后水肿病和腹泻病具有抗性，而且具有较高的早期生长发育性能、繁殖性能和一般抗病力(见表1-表5)。

表1苏太猪F18⁺抗病育种基础群FUT1基因与早期生长发育的关系

注：字母相同为差异不显著，字母不同差异显著

表2苏太猪F18⁺抗病育种基础群FUT1基因与第3胎繁殖性能关系

注：字母相同为差异不显著，字母不同差异显著

表3苏太猪F18⁺抗病育种基础群FUT1基因与第4胎繁殖性能关系

注：字母相同为差异不显著，字母不同差异显著

表4苏太猪F18⁺抗病育种基础群FUT1基因与血常规指标关系

注：字母不同差异显著

表5苏太猪F18⁺抗病育种基础群FUT1基因与部分免疫的指标关系

注：字母不同差异显著

5)将苏太猪F18⁺大肠杆菌抗病育种基础群继续进行FUT1基因的基因型测定，选留AA基因型个体，对AA抗性型群体的早期生长速度、繁殖性能、一般抗病力等性状进行检测和选择，利用有利分子遗传标记和常规育种值估计，确定分子综合选择指数(I＝MS+EBV，其中MS代表分子评分，EBV为估计育种值)，建立分子标记辅助择(MAS)体系。

6)对试验猪实行五阶段选择，运用BLUP模型进行种猪的遗传评估。测定的主要项目有生长速度、活体膘厚、体尺、体型外貌评定、繁殖性能等，同时剔除出现遗传损征的个体。通过测定和评定，选留符合育种目标的个体。

第一次选择阶段：仔公猪在25日龄前初选，仔母猪在40日龄左右，体重约8-9Kg

第二次选择阶段：公猪在体重约17-18Kg，进入测定站前选留，母猪在种猪出售前体重约20-25Kg之间进行，选中母猪进入测定站

第三次选择阶段：公猪达50Kg，母猪达60Kg体重时进行

第四次选择(♂选择)阶段：公猪体重达80Kg时(所有项目都测定结束)

第五次选择阶段：公母猪年龄一岁半，有2胎产仔成绩

7)公母猪根据综合指数值及体质外貌鉴定选留，公猪留种率约30％，母猪留种率约50％，即综合指数在平均数以上部分。个别数量性状表现很好，得分在单项总分的90％以上种猪也可入选(主要为综合育种值及产仔数2项)。

8)每个世代选留公猪20头，母猪100头；母猪选留强度达到60∶1，种公猪达到220∶1，这样就保证了十分优秀的后备猪才能被留作种用。

9)实行继代选育与世代重叠相结合的选育方法。为了保留高繁殖力和提高生长速度与瘦肉率，还采取了高强度的选留办法，为此要扩大每个世代的留种数量，做到有充分选择余地。到后备母猪选定时，母亲已繁殖第二胎，多了一胎的产仔信息，有利于选择的正确度。

10)采取综合指数法进行选择。为了尽可能地客观评定每一头后备种猪的种用价值，采取综合指数法对后备猪进行选择。反映瘦肉率和生长速度的活体膘厚及日增重的综合育种值在综合指数中公猪占70％，母猪占55％，体长、臀宽占10％，两项合计分别占80％、65％，在综合指数中占了很大比例，这为提高新品系猪瘦肉率、生长速度创造了条件。

11)每隔二个世代对后备猪同胞进行屠宰，测定其瘦肉率、肉质性状和生长速度、饲料报酬等，掌握选育进展与效果，为该世代后备猪选留提供依据。

12)在苏太猪抗F18大肠杆菌病新品系的培育过程中，系统地开展了产仔数选择方法、提高瘦肉率选择方法、生长发育性状遗传参数估测、180日龄体重遗传趋势分析、用BLUP法估计不同日龄体重的育种值、种质特性研究、配套杂交组合筛选、窝产瘦肉量试验等配套技术，用群体继代选育和分子标记辅助选择的方法，逐步实现既定育种目标，抗病力：抗断奶仔猪腹泻和水肿病，并具有很强的抗应激能力和抗逆性；繁殖性能：新品系猪总产仔数最高达到19头，核心群经产母猪产仔在14.5头以上；生长性能：175日龄体重90Kg，料重比3.0∶1；屠宰性能及肉质：胴体瘦肉率57％以上，肉质优良，肌内脂肪≥2.5％，无肉色苍白、质地松软、切面渗出(PSE)和深色、硬实、干燥肉(DFD)，系水力(滴水损失)≤3％，大理石纹评分2.8-3.0，肉色评分3.0-4.0，屠宰后45分钟内测定的酸碱度(PH45)在6.3-6.6之间，屠宰后24小时测定的酸碱度(PH)在5.4-5.8之间，嫩度≤3.6％。建立的新品系核心群目前在600头以上。

Claims (3)

1.一种苏太猪抗F18大肠杆菌病新品系的培育方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)以苏太猪核心群中FUT1基因M307AG型个体为亲本，杂交后代按常规选种标准选留后代个体，组建苏太猪F18大肠杆菌抗病育种基础群；

(2)对基础群中AA抗性型群体的繁殖性能、生长速度、瘦肉率、胴体品质等性状进行检测和选择，组建第一个世代；

(3)用群体继代选育和分子标记辅助选择的方法，经过4-5个世代，逐步实现既定育种目标，建立新品系核心群。

2.根据权利要求1所述的苏太猪抗F18大肠杆菌病新品系的培育方法，其特征在于：

步骤(1)所述的苏太猪F18大肠杆菌抗病育种基础群的组建方法具体是：

1)利用FUT1基因标记对苏太猪核心群全面检测基因型：根据已公布的猪FUT1基因序列L50534设计引物，上游引物为：5′-CCAACGCCTCCGATTCCTGT-3′，下游引物为：5′-GTGCATGGCAGGCTGGATGA-3′，预期扩增片段为161bp，PCR产物经10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳银染分析；

2)利用检测到的AG型个体为亲本，结合生产性能确定交配组合进行杂交，结合生产性能确定交配组合；

3)对杂交后代大肠杆菌F18抗性/易感性进行进一步验证，结合常规选种的标准，选留后代个体，并且在相同饲养管理环境条件下按家系分开饲养，组建苏太猪F18⁺大肠杆菌抗病育种基础群。

3.根据权利要求1所述的苏太猪抗F18大肠杆菌病新品系的培育方法，其特征在于：步骤(2)第一世代的组建具体是：

1)将苏太猪F18⁺大肠杆菌抗病育种基础群继续进行FUT1基因的基因型测定，选留AA基因型个体，对AA抗性型群体的早期生长速度、繁殖性能、一般抗病力等性状进行检测和选择，利用有利分子遗传标记和常规育种值估计，确定分子综合选择指数，建立MAS体系；

2)对试验猪实行五阶段选择，运用BLUP模型进行种猪的遗传评估：测定的主要项目有生长速度、活体膘厚、体尺、体型外貌评定、繁殖性能等，同时剔除出现遗传损征的个体；通过测定和评定，选留符合育种目标的个体；第一次选择阶段：仔公猪在25日龄前初选，仔母猪在40日龄左右，体重约8-9Kg；

第二次选择阶段：公猪在体重约17-18Kg，进入测定站前选留，母猪在种猪出售前体重约20-25Kg之间进行，选中母猪进入测定站；

第三次选择阶段：公猪达50Kg，母猪达60Kg体重时进行；

第四次选择阶段：公猪体重达80Kg时；

第五次选择阶段：公母猪年龄一岁半，有2胎产仔成绩；

3)公母猪根据综合指数值及体质外貌鉴定选留，公猪留种率约30％，母猪留种率约50％，即综合指数在平均数以上部分；个别数量性状表现很好，得分在单项总分的90％以上种猪也可入选。

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