CN106614386A - 抗大肠杆菌F4ac感染的新品系猪的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗大肠杆菌F4ac感染的新品系猪的培育方法。本发明提供了一种既有抗大肠杆菌F4ac感染的猪的优点，又有引入猪品种的生长快、瘦肉率高等特点的抗大肠杆菌F4ac感染新品系猪的培育方法。本发明包括：利用抗大肠杆菌F4ac感染母猪与新美系杜洛克公猪杂交培育第1世代母猪核心群；第1世代母猪核心群与抗大肠杆菌F4ac感染的公猪级进杂交2次或与新美系杜洛克猪公猪级进杂交2次；从第3世代开始分别采用群体闭锁繁殖和选育，进行2～3个世代的横交，用综合选择指数和分子标记辅助选择的方法进行选留，形成抗大肠杆菌F4ac感染的新品系猪。

Description

抗大肠杆菌F4ac感染的新品系猪的培育方法

技术领域

本发明涉及一种猪新品系的培育方法，特别是涉及一种抗大肠杆菌F4ac感染的新品系猪的培育方法。

背景技术

我国是世界上养猪生产和猪肉消费第一大国，世界上几乎一半的猪饲养在中国。猪肉是我国传统肉食品来源，约占肉食品消费的66％。仔猪腹泻是养猪生产中的常见传染病，给世界养猪业造成了巨大经济损失。产肠毒素大肠杆菌F4(EnterotoxigenicEscherichia coli F4，ETEC F4)是引发新生和断奶前仔猪腹泻病的最主要致病菌。其中分别有约40％的仔猪腹泻病是因ETEC F4侵染而引起的，即使是病愈个体，也会严重影响生长发育，有的形成僵猪，导致饲养成本增加，销售收入下降。利用断奶前腹泻抗病基因MUC13，开展抗断奶前疾病的抗性选育，培育出能抵大肠杆菌F4ac感染的优质抗性核心群，并进行产业化推广，不仅能在技术市场抢占先机，通过抗腹泻种猪的推广也将为企业带来丰厚的经济效益，更能改善我区乃至我国种猪健康品质。

在过去的几十年中，我国在地方猪种的选育提高及与外来猪种的杂交改良及杂种优势利用方面做出了大量的工作，大大提高了我国养猪业的生产水平。随着分子生物学和分子数量遗传学的发展，猪的育种已逐步从常规育种走向常规育种与分子育种相结合的道路。分子标记己应用于猪的不 同品系或品种的等位基因之组合、性状的标记辅助选择，大大提高了选择的准确性和育种效率。然而现有抗大肠杆菌F4ac感染的猪生长较慢快、瘦肉率和出栏率较低。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷，提供了一种抗大肠杆菌F4ac感染的新品系猪的培育方法，包括以下步骤：

第一阶段：

以抗大肠杆菌F4ac感染的优秀个体作为母本，以外来瘦肉型品种新美系杜洛克公猪中来源于不同家系的优秀个体作为父本进行杂交，在所产后代中选留母猪，组成第1世代母猪核心群；

第二阶段：

第1世代母猪产生的猪卵母细胞去核；使所述卵母细胞与供体猪成纤维细胞融合，所述成纤维细胞的基因组包含至少一个抗大肠杆菌F4ac感染等位基因；激活所述卵母细胞以产生胚胎；

第三阶段：

以胚胎中的母猪核心群为母本、抗大肠杆菌F4ac感染的公猪为父本进行级进杂交，在所生后代中用分子标记和综合选择指数方法选留母猪，组成第2世代母猪核心群，其含有75％的抗大肠杆菌F4ac感染的猪血统，25％的杜洛克猪血统；

以第1世代母猪核心群为母本、新美系杜洛克公猪为父本进行级进杂交，杜洛克公猪来源于不同的家系，在所生后代中用分子标记和综合选择指数方法选留母猪，组成第3世代母猪核心群，其含有75％的杜洛克猪血 统，25％的抗大肠杆菌F4ac感染的猪血统；

第四阶段：

以第2世代母猪核心群为母本，再以抗大肠杆菌F4ac感染的公猪为父本进行级进杂交，在所生后代中用分子标记和综合选择指数方法选留公猪和母猪，组成第4世代猪核心群，其含有87.5％的抗大肠杆菌F4ac感染猪的血统，12.5％的杜洛克猪血统；

以第3世代母猪为母本，再以新美系杜洛克猪公猪为父本进行级进杂交，杜洛克公猪来源于不同的家系，在所生后代中用分子标记和综合选择指数方法选留公猪和母猪，组成第5世代猪核心群，其含有87.5％的杜洛克猪血统，12.5％的抗大肠杆菌F4ac感染猪的猪血统；

第五阶段：

分别以第4世代猪核心群中的公、母猪交配，以第5世代猪核心群心群中的公、母猪交配，从第4世代开始分别采用群体闭锁繁殖和选育，进行2～3个世代的横交，在横交各代猪中用分子标记和综合选择指数方法选留公猪和母猪，得到横交各代猪核心群。同一世代公猪与母猪交配，每个世代选留母猪和公猪，进行2～3个世代的横交后，得到抗大肠杆菌F4ac感染的新品系猪。

在某些实施方式中，所述第二阶段的重构胚胎具体过程为：将成熟的卵母细胞置于显微操作盘工作滴中，随后将固定针固定住卵母细胞，将注射针针口正对极体且位于透明带间隙内，缓缓吸取1/5-1/4的细胞质并同时吸走极体，去除卵母细胞的细胞核，然后选取中等大小、活力较好的细胞注入卵母细胞卵周隙，最后采用电融合的方法形成重构胚胎，融合电击参数为1.3kv/mm、30us、2次脉冲，30min后观察融合率，未融合的进行二次融合，将融合后的卵母细胞放入38℃、5％CO₂中培养，48h后观察卵裂 率，6d后观察囊胚发育情况。

在某些实施方式中，所述第二阶段后还包括胚胎移植过程，具体为：当重组胚胎体发育至2～4细胞期后，挑选形态和发育较好的胚胎进行移植，每头受体移植150～250枚胚胎，共移植3～10头母猪，胚胎移植后进行B超妊娠检测。

在某些实施方式中，所述第五阶段后还包括转基因猪的鉴定的过程：小猪出生后采取耳朵与尾部组织提取基因组DNA，以此为模板进行PCR、Real-time PCR和染色体步移方法来鉴定其阳性。

在某些实施方式中，第一次选留在28日龄断奶时进行，且选择被毛黑色，体重大于4kg，乳头数7对及以上，体形匀称，体质好的母猪。

在某些实施方式中，第二次选留时淘汰生长速度慢，体质差的猪。

在某些实施方式中，第三次选留时测定6月龄体重、背膘厚、计算断奶后至90kg体重阶段的日增重，料肉比，选择日增重500g以上、料肉比小于3.2∶1的母猪留种。

在某些实施方式中，第三次选留时选择90kg时活体背膘厚20mm以下的母猪留种。

在某些实施方式中，第三次选留时选择眼肌面积大于25cm²的母猪留种。

在某些实施方式中，猪种选自华南、华中、华北、江海、西南或高原型地方猪种中的任意一种。本发明提供的一种抗大肠杆菌F4ac感染的新品系猪的培育方法的有益效果是：

本发明可以显著提高种群断奶仔猪的抗腹泻病能力，大大减少仔猪死亡率。该种培育方法培育的猪既有抗大肠杆菌F4ac感染的猪的优点，又有引入猪品种的生长快、瘦肉率高等特点。提高了养猪出栏率的同时，提升 了商品猪质量，降低了经济成本，保证了经济效益。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面结合具体实施例及图对本发明的权利要求做进一步的详细说明，可以理解的是，以下仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求范围之内。

本发明提供了一种抗大肠杆菌F4ac感染的新品系猪的培育方法，包括以下步骤：

第一阶段：

以抗大肠杆菌F4ac感染的优秀个体作为母本，以外来瘦肉型品种新美系杜洛克公猪中来源于不同家系的优秀个体作为父本进行杂交，在所产后代中选留母猪，组成第1世代母猪核心群；

第二阶段：

第1世代母猪产生的猪卵母细胞去核；使所述卵母细胞与供体猪成纤维细胞融合，所述成纤维细胞的基因组包含至少一个抗大肠杆菌F4ac感染等位基因；激活所述卵母细胞以产生胚胎；

第三阶段：

以胚胎中的母猪核心群为母本、抗大肠杆菌F4ac感染的公猪为父本进行级进杂交，在所生后代中用分子标记和综合选择指数方法选留母猪，组成第2世代母猪核心群，其含有75％的抗大肠杆菌F4ac感染的猪血统，25％的杜洛克猪血统；

以第1世代母猪核心群为母本、新美系杜洛克公猪为父本进行级进杂 交，杜洛克公猪来源于不同的家系，在所生后代中用分子标记和综合选择指数方法选留母猪，组成第3世代母猪核心群，其含有75％的杜洛克猪血统，25％的抗大肠杆菌F4ac感染的猪血统；

第四阶段：

以第2世代母猪核心群为母本，再以抗大肠杆菌F4ac感染的公猪为父本进行级进杂交，在所生后代中用分子标记和综合选择指数方法选留公猪和母猪，组成第4世代猪核心群，其含有87.5％的抗大肠杆菌F4ac感染猪的血统，12.5％的杜洛克猪血统；

以第3世代母猪为母本，再以新美系杜洛克猪公猪为父本进行级进杂交，杜洛克公猪来源于不同的家系，在所生后代中用分子标记和综合选择指数方法选留公猪和母猪，组成第5世代猪核心群，其含有87.5％的杜洛克猪血统，12.5％的抗大肠杆菌F4ac感染猪的猪血统；

第五阶段：

分别以第4世代猪核心群中的公、母猪交配，以第5世代猪核心群心群中的公、母猪交配，从第4世代开始分别采用群体闭锁繁殖和选育，进行2～3个世代的横交，在横交各代猪中用分子标记和综合选择指数方法选留公猪和母猪，得到横交各代猪核心群。同一世代公猪与母猪交配，每个世代选留母猪和公猪，进行2～3个世代的横交后，得到抗大肠杆菌F4ac感染的新品系猪。

可以理解的是，该种培育方法显著提高种群断奶仔猪的抗腹泻病能力，大大减少仔猪死亡率。该种培育方法培育的猪既有抗大肠杆菌F4ac感染的猪的优点，又有引入猪品种的生长快、瘦肉率高等特点。提高了养猪出栏率的同时，提升了商品猪质量，降低了经济成本，保证了经济效益。

需要理解的是，由于选择指数法具有很大的优越性，因而迅速地在理 论和方法上成熟起来，从一般的综合选择指数发展为约束选择指数、最宜选择指数、综合育种值估计以及通用选择指数等，因而成为多性状选择重要的方法。由于选择的性状不同、运用时期不同以及性状权重不同等众多因素的影响，所制定的综合选择指数千差万别。

可以理解的是，猪只屠宰后，取小肠空肠部分，提取小肠上皮细胞刷状缘，利E.coliF4ac菌株黏附猪小肠上皮细胞刷状缘，通过相差显微镜检测细菌的黏附结果。每个样品检测20个以上的刷状缘，若有10％以上的刷状缘上至少有2个细菌黏附，判该样品为黏附型，若至少有2个细菌黏附的刷状缘不到10％，但有1～2个细菌黏附的刷状缘多于10％，判该样品为弱黏附型，否则判为不黏附型。

再者，眼肌面积，指家畜背最长肌的横断面面积。由于眼肌面积性状与家畜产肉性能有强相关关系，所以在育种上显得尤为重要。眼肌面积计算方法有多种，即公式法、求积仪法、图像法和坐标纸法等，其中公式法最为简便易行。目前，在猪的屠宰测定上普遍采用高×宽×系数0.7＝眼肌面积，大大简化了眼肌面积的计算。

其次，背膘厚表示猪脂肪多少，背膘厚度越厚廋肉率越低；相反，则廋肉率高。我国现背膘厚的测量大部分单位取三点测量，即肩胛后沿、最后肋处及腰荐接合处距背正中线4厘米处作为膘厚和眼肌厚的测量点，而后取三点平均值。也有人仅作10～11肋间距背正中线4厘米处测量。

需要理解的是，不同阶段综合选择指数如下：

断奶综合选择指数＝断奶个体重×40％/断奶体重均值+同窝活仔数×60％/活仔数均值。

4月龄综合选择指数＝断奶综合选择指数×20％+4月龄个体重×50％/体重均值+体长×30％/体长均值。

6月龄综合选择指数＝4月龄综合选择指数×20％+个体6月龄个体重×50％/体重均值+6～7肋背膘厚×30％/6～7肋背膘厚均值。

可以理解的是，猪卵母细胞体外成熟培养：从屠宰场收集猪的卵巢置于37℃生理盐水中，2小时内运回实验室。采用带有18号针头的10ml一次性注射器采集3～6mm卵泡中的卵泡液并放入15ml离心管中，静止10分钟后弃去上清，用采卵液(名称PVA-TL-HEPES，配方：称取聚乙烯醇0.1g，NaCl 6.6633g，KCl 0.2386g，NaH₂PO₄ 0.0408g，NaHCO₃ 0.168g，羟乙基哌嗪乙硫磺酸Hepes 2.383g，酚红0.0022g，山梨醣醇2.186g，丙酮酸钠0.022g，乳酸钠1.868ml，青霉素G0.065g，硫酸链霉素0.025g，MgCl₂·6H₂O 0.1017g，CaCl₂·2H₂O 0.294g，用双蒸水定容至100ml，并将pH调至7.4洗两遍。在显微镜下挑选形态规则，细胞质均匀，外围有3～5层卵丘细胞紧密包裹的卵丘细胞-卵母细胞复合体(简称COCs)置于38.5℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养42～44小时，随后用透明质酸酶消化，吹打成裸卵，以第一极体排出为猪卵母细胞成熟的标准。猪卵母细胞成熟培养液配方：基础培养液为培养基Medium199(购自Gibco公司)，在其中添加10％(体积比)猪卵泡液(PFF)，0.1％聚乙烯醇(PVA)30mM NaHCO₃，10μg/ml庆大霉素(Gentamicin)，3.05mM D-葡萄糖(D-Glucose)，0.91mM丙酮酸钠(Na-pyruvate)，0.07g/L L-胱氨酸盐酸盐(L-cystine)，12.5ng/ml表皮生长因子(EGF 10IU/ml促黄体生成素(LH)，10IU/ml促卵泡生成素(FSH)。

将猪的卵母细胞置于显微操作盘工作滴中，随后将固定针(Holder)固定住卵母细胞，注射针(injection)针尖快速刺破透明带后收针，轻柔地破开细胞膜，然后缓慢回针，使针口正对极体且位于透明带间隙内，缓缓吸取1/5-1/4的细胞质并同时吸走极体，沿横轴方向快速出针，迅速推动油压泵，使吸取物顺着透明带涌出。利用胰酶将用于移核的细胞消化并置于显微操 作盘中，将显微操作针调节到最佳位置，选取中等大小、活力较好的细胞约30～50个吸入injection中。Holder固定胚胎后，调节焦距，使胚胎与injection在同一平面，稍微给injection一点向外打细胞的力，待细胞将要出injection口的瞬间快速刺入卵母细胞卵周隙，等细胞进入胚胎后迅速移出injection。

需要理解的是，重构胚的融合与激活：将移核完毕的卵母细胞平铺于加满激活液(配方：0.3M甘露醇，0.5mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1.0mM CaCl2·2H₂O，0.1mM MgCl₂·6H₂O)的融合槽中(BTX，槽宽0.5mm或1mm)，电融合仪为BLS(CF-150B)。用针拨动卵母细胞将卵母细胞与供体细胞接触面垂直于场强方向，供体细胞面向正极方向。30min后观察融合率，未融合的进行二次融合。将融合后的卵母细胞放入38℃、5％CO₂中培养，48h后达4-细胞期，6d后观察重组囊胚的发育情况。

国外采用胴体探测仪测定离背中线6至8cm处倒数第三到第四肋间的背膘厚称为边膘厚。

进一步的，所述第二阶段的重构胚胎具体过程为：将成熟的卵母细胞置于显微操作盘工作滴中，随后将固定针固定住卵母细胞，将注射针针口正对极体且位于透明带间隙内，缓缓吸取1/5-1/4的细胞质并同时吸走极体，去除卵母细胞的细胞核，然后选取中等大小、活力较好的细胞注入卵母细胞卵周隙，最后采用电融合的方法形成重构胚胎，融合电击参数为1.3kv/mm、30us、2次脉冲，30min后观察融合率，未融合的进行二次融合，将融合后的卵母细胞放入38℃、5％CO₂中培养，48h后观察卵裂率，6d后观察囊胚发育情况。

进一步的，所述第二阶段后还包括胚胎移植过程，具体为：当重组胚胎体发育至2～4细胞期后，挑选形态和发育较好的胚胎进行移植，每头受 体移植150～250枚胚胎，共移植3～10头母猪，胚胎移植后进行B超妊娠检测。

进一步的，所述第五阶段后还包括转基因猪的鉴定的过程：小猪出生后采取耳朵与尾部组织提取基因组DNA，以此为模板进行PCR、Real-time PCR和染色体步移方法来鉴定其阳性。

进一步的，第一次选留在28日龄断奶时进行，且选择被毛黑色，体重大于4kg，乳头数7对及以上，体形匀称，体质好的母猪。

进一步的，第二次选留时淘汰生长速度慢，体质差的猪。

进一步的，第三次选留时测定6月龄体重、背膘厚、计算断奶后至90kg体重阶段的日增重，料肉比，选择日增重500g以上、料肉比小于3.2∶1的母猪留种。

进一步的，第三次选留时选择90kg时活体背膘厚20mm以下的母猪留种。

进一步的，第三次选留时选择眼肌面积大于25cm²的母猪留种。

进一步的，猪种选自华南、华中、华北、江海、西南或高原型地方猪种中的任意一种。

申请人声明，本发明通过上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程。并且即不意味着本发明应依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种抗大肠杆菌F4ac感染的新品系猪的培育方法，其特征在于包括以下步骤：

第一阶段：

以抗大肠杆菌F4ac感染的优秀个体作为母本，以外来瘦肉型品种新美系杜洛克公猪中来源于不同家系的优秀个体作为父本进行杂交，在所产后代中选留母猪，组成第1世代母猪核心群；

第二阶段：

第1世代母猪产生的猪卵母细胞去核；使所述卵母细胞与供体猪成纤维细胞融合，所述成纤维细胞的基因组包含至少一个抗大肠杆菌F4ac感染等位基因；激活所述卵母细胞以产生胚胎；

第三阶段：

以胚胎中的母猪核心群为母本、抗大肠杆菌F4ac感染的公猪为父本进行级进杂交，在所生后代中用分子标记和综合选择指数方法选留母猪，组成第2世代母猪核心群，其含有75％的抗大肠杆菌F4ac感染的猪血统，25％的杜洛克猪血统；

以第1世代母猪核心群为母本、新美系杜洛克公猪为父本进行级进杂交，杜洛克公猪来源于不同的家系，在所生后代中用分子标记和综合选择指数方法选留母猪，组成第3世代母猪核心群，其含有75％的杜洛克猪血统，25％的抗大肠杆菌F4ac感染的猪血统；

第四阶段：

以第2世代母猪核心群为母本，再以抗大肠杆菌F4ac感染的公猪为父本进行级进杂交，在所生后代中用分子标记和综合选择指数方法选留公猪和母猪，组成第4世代猪核心群，其含有87.5％的抗大肠杆菌F4ac感染猪的血统，12.5％的杜洛克猪血统；

以第3世代母猪为母本，再以新美系杜洛克猪公猪为父本进行级进杂交，杜洛克公猪来源于不同的家系，在所生后代中用分子标记和综合选择指数方法选留公猪和母猪，组成第5世代猪核心群，其含有87.5％的杜洛克猪血统，12.5％的抗大肠杆菌F4ac感染猪的猪血统；

第五阶段：

分别以第4世代猪核心群中的公、母猪交配，以第5世代猪核心群心群中的公、母猪交配，从第4世代开始分别采用群体闭锁繁殖和选育，进行2～3个世代的横交，在横交各代猪中用分子标记和综合选择指数方法选留公猪和母猪，得到横交各代猪核心群。同一世代公猪与母猪交配，每个世代选留母猪和公猪，进行2～3个世代的横交后，得到抗大肠杆菌F4ac感染的新品系猪。

2.如权利要求1所述的抗大肠杆菌F4ac感染的新品系猪的培育方法，其特征在于，所述第二阶段的重构胚胎具体过程为：将成熟的卵母细胞置于显微操作盘工作滴中，随后将固定针固定住卵母细胞，将注射针针口正对极体且位于透明带间隙内，缓缓吸取1/5-1/4的细胞质并同时吸走极体，去除卵母细胞的细胞核，然后选取中等大小、活力较好的细胞注入卵母细胞卵周隙，最后采用电融合的方法形成重构胚胎，融合电击参数为1.3kv/mm、30us、2次脉冲，30min后观察融合率，未融合的进行二次融合，将融合后的卵母细胞放入38℃、5％CO₂中培养，48h后观察卵裂率，6d后观察囊胚发育情况。

3.如权利要求1所述的抗大肠杆菌F4ac感染的新品系猪的培育方法，其特征在于，所述第二阶段后还包括胚胎移植过程，具体为：当重组胚胎体发育至2～4细胞期后，挑选形态和发育较好的胚胎进行移植，每头受体移植150～250枚胚胎，共移植3～10头母猪，胚胎移植后进行B超妊娠检测。

4.如权利要求1所述的抗大肠杆菌F4ac感染的新品系猪的培育方法，其特征在于，所述第五阶段后还包括转基因猪的鉴定的过程：小猪出生后采取耳朵与尾部组织提取基因组DNA，以此为模板进行PCR、Real-time PCR和染色体步移方法来鉴定其阳性。

5.如权利要求2所述的抗大肠杆菌F4ac感染的新品系猪的培育方法，其特征在于，第一次选留在28日龄断奶时进行，且选择被毛黑色，体重大于4kg，乳头数7对及以上，体形匀称，体质好的母猪。

6.如权利要求3所述的抗大肠杆菌F4ac感染的新品系猪的培育方法，其特征在于，第二次选留时淘汰生长速度慢，体质差的猪。

7.如权利要求4所述的抗大肠杆菌F4ac感染的新品系猪的培育方法，其特征在于，第三次选留时测定6月龄体重、背膘厚、计算断奶后至90kg体重阶段的日增重，料肉比，选择日增重500g以上、料肉比小于3.2∶1的母猪留种。

8.如权利要求4所述的抗大肠杆菌F4ac感染的新品系猪的培育方法，其特征在于，第三次选留时选择90kg时活体背膘厚20mm以下的母猪留种。

9.如权利要求4所述的抗大肠杆菌F4ac感染的新品系猪的培育方法，其特征在于，第三次选留时选择眼肌面积大于25cm²的母猪留种。

10.如权利要求1所述的抗大肠杆菌F4ac感染的新品系猪的培育方法，其特征在于：猪种选自华南、华中、华北、江海、西南或高原型地方猪种中的任意一种。