CN107653326B - Pappa2基因上游片段作为猪免疫性状的分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于猪分子标记筛选技术领域，具体涉及PAPPA2基因的上游序列片段作为猪免疫性状相关检测的分子标记及应用。所述的分子标记由猪PAPPA2基因的上游序列中克隆得到。本发明筛选得到一种与猪免疫性状相关的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在该序列的第52位碱基处存在一个A/G的等位基因突变，该突变导致Sequenom

Description

PAPPA2基因上游片段作为猪免疫性状的分子标记及应用

技术领域

本发现属于猪的分子标记筛选技术领域，具体涉及PAPPA2基因上游片段作为猪免疫性状的分子标记及应用。

背景技术

猪病已经成为当前制约养猪业健康发展的关键因素之一，尤其是规模化猪场的普及，对疫病的防治更是生猪养殖过程中的重中之重。但是往往由于对某些疫病控制能力弱，疾病检测、诊断、预防和扑灭等措施处理不及时，造成猪病频发。疾病的爆发可直接导致生猪的死亡，出栏率降低，进而影响生猪养殖的经济效益。同时为了预防和治疗疾病而大量使用药物增加了养殖成本和药物残留，残留的药物对生态环境造成一定程度的破坏。而抗生素的滥用不仅导致病菌出现耐药性，增加了养殖场疾病防治的难度，而且还造成猪肉食品存在安全隐患。因此，在生猪养殖过程中的疾病防控，直接关系到这一产业的发展和猪肉食品市场。尽量避免大量使用药物，寻找抗病新策略，从培育抗病品系入手，是改善养猪行业行情的热门研究方向。

研究表明免疫与生长具有一定的关系，二者之间存在负相关(唐国庆等,猪抗病育种研究进展.中国畜牧兽医,2002,29(6):29-32；严燕等,猪遗传抗性与抗病育种研究进展.猪业科学,2007,6:58-61.)，而用于检测免疫指标的因子在中外猪种中存在显著差异(刘筱等,猪Toll样受体4基因(TLR4)外显子SNP检测及生物信息学分析.江苏农业学报,2011,27(4):782-789；董文华等,猪CD14基因多态性及其对部分免疫指标的遗传效应分析.中国畜牧杂志,2014,50(13):1-5.)，且在一定程度上可以反映机体的生长状态。因此可以筛选与免疫性状关联的基因作为检测免疫性状的遗传标记。

文献报道PAPPA2(Pappalysin2)基因参与调控机体的免疫及生长。PAPPA2又称冠毛素2，是胰岛素生长因子结合蛋白5(IGFBP5)的裂解酶(Overgaard MT等,Pregnancy-associated plasma protein-A2(PAPP-A2),a novel insulin-like growth factor-binding protein-5 proteinase.Biol Chem,2001,276(24):21849-21853.)，而IGFBP5则属于胰岛素样生长因子结合蛋白家族的一员，在血液和多种组织中表达。作为胰岛素样生长因子(IGF)家族的重要组成部分，胰岛素样生长因子结合蛋白对延长胰岛素样因子的半衰期和调节其生物学功能发挥重要作用(Richer M M等,The insulin-like growthfactors and IGF type I receptor during postnatal growth of the murine mammarygland:Sits of mRNA expression and potential functions.Endocrinology,1999,140:454-461.)。据报道，IGF不仅可以通过内分泌作用在神经内分泌和免疫系统间传递信号而且还能够以自分泌和旁分泌的方式调节免疫系统(王宇鸿,IGF-1的免疫调节作用.国外医学免疫学分册,2001,24(4):187-190.)。功能研究表明，向小鼠体内注射重组的IGF-1蛋白，B细胞合成免疫球蛋白的能力增强，小鼠机体的免疫机能提高，而该基因的缺陷则会造成机体内各种免疫细胞功能的紊乱(Clark R等,Insulin-like growth factor-1stimulationof lymphopoiesis.J Clin Invest,1993,92(2):540-8.)。另外，IGF可以通过自身、受体及其结合蛋白的方式介导由垂体生长激素(GH)参与的调控身体各器官生长的过程(汪波等,胰岛素样生长因子的研究进展.黑龙江畜牧兽医,2010,(5):25-27.)，而上述调控过程主要依靠IGFBP蛋白的裂解酶参与完成。IGFBP可以被IGFBP酶解而释放出IGF。在众多的结合蛋白中，IGFBP5与IGF的亲和性最高，其主要与细胞外基质结合对IGF-1分子活性起到正向调节作用。研究报道，IGFBP5基因编码区及5’调控区SNP位点的突变会影响猪的生长性状(赵晓枫等,胰岛素生长因子结合蛋白5基因(IGFBP5)部分编码序列的SNP快速筛查及其多态性对猪生产性能的影响.农业生物技术学报,2009,17(5):758-762；吴庆燕等,IGFBP-5基因在不同猪种间的表达差异及5’端序列特征分析.中古兽医学报,2015,35(4):655-660.)。PAPPA2基因作为IGFBP5的裂解酶，可以通过酶解IGFBP5，影响IGFBP5基因调控IGF的分子活性，进而对机体免疫功能和正常生长产生影响，且该基因的异常表达可能与孕妇孕期并发症有关，因此PAPPA2蛋白也被用来作为检测胎盘异常的标记物(Wang等,Expression ofpregnancy-associated plasma protein A2during pregnancy in human and mouse.JEndocrinol,2009,202(3):337-345)。上述研究结果均表明PAPPA2基因在机体免疫和生长过程中发挥重要作用，而该基因上游序列位点的突变则可能会通过调控基因自身表达的活性从而影响动物机体免疫和生长性能的维持。

本发明申请中，申请人分析了PAPPA2基因的上游片段，鉴定了一个与猪免疫性状密切相关的功能突变位点，为猪免疫性状的标记辅助选择提供了新的SNP分子标记。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供PAPPA2基因上游片段作为猪免疫性状的分子标记及应用。本发明通过PCR扩增PAPPA2基因上游片段，利用Sequenom

SNP技术，在猪品种杜洛克×二花脸F2代群体中进行分型，分型结果与该群体的免疫指标关联分析，进而鉴定获得与猪免疫性状相关的分子标记。本发明为猪的抗病育种提供了新的分子标记资源和应用。

本发明的技术方案如下所述：

申请人通过基因克隆的方法，得到PAPPA2基因上游序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。具体的序列如下所示：

AACAAGACCATAGAGGAAACTATGAAATTTCTTCTCACAATAAGAACAGGARTTTCTTAAAAGTCGGTACGTTCATTATTCC

上述序列的52bp碱基处的R是A或G，该突变导致Sequenom

SNP分型多态性。

该基因片段可以作为检测分诊断目的的与猪免疫性状相关的分子标记。

申请人提供了一种检测如序列表SEQ ID NO：1所述的分子标记的引物对(即扩增PAPPA2基因上游序列的引物对)，在该引物对的正、反向引物的起始处(即下划线所示的序列)各包含10bp的序列标签。该引物对的核苷酸序列如下所示：

正向引物：5’-ACGTTGGATGAACAAGACCATAGAGGAAAC-3’

反向引物：5’-ACGTTGGATGGGAATAATGAACGTACCGAC-3’。

申请人提供了一种检测如序列表SEQ ID NO：1所述的分子标记的用于基因分型的延伸引物组合，该引物组合序列的起始处(即下划线所示的序列)各包含4bp的序列标签。该引物组合的核苷酸序列如下所示：

引物1：5’-CCCATTCTCACAATAAGAACAGGA-3’；

引物2：5’-CCCATTCTCACAATAAGAACAGGAA-3’；

引物3：5’-CCCATTCTCACAATAAGAACAGGAG-3’。

一种筛选猪免疫性状的分子标记的方法，包括下列步骤：

①提取猪耳朵组织基因组DNA并对DNA进行质量检测；

②根据SNP位点序列信息，使用Sequenom公司的引物设计软件Assay design3.1，设计PCR反应和单碱基扩增引物；

③利用Sequenom

SNP方法进行分型检测；

④采用SAS9.1软件进行基因型与猪免疫性状间的关联分析。

本发明分子标记可用于非诊断目的的猪免疫性状标记辅助选择中。

本发明筛选的分子标记可用于非诊断目的的对猪相关基因的基因型或与猪免疫性状之间的关联分析中，为猪免疫性状的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记资源。

与现有技术相比本发明具有的有益效果：

本发明可通过在体外采用Sequenom

SNP方法检测猪的基因型，作为非诊断目的的评价猪的免疫能力，与目前的PCR-RFLP、ELISA、流式细胞仪等方法相比，本发明具有简单、快捷、灵敏度高和特异性好等突出优点。

更详细的技术方案请参见说明书的《附图说明》及《具体实施方式》中的实施例。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的PAPPA2基因上游序列片段，即本发明筛选的分子标记的核苷酸序列。序列长度为82bp，在该序列的52位碱基处的R存在一个A/G的等位基因突变(52bp处的碱基“G”为突变后的碱基)。

序列表SEQ ID NO：2是本发明克隆PAPPA2基因的上游序列片段和分子标记的正向引物序列。

序列表SEQ ID NO：3是本发明克隆PAPPA2基因的上游序列片段和分子标记的反向引物序列。

序列表SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6是检测序列表SEQ ID NO：1的Sequenom

SNP多态性的延伸引物序列组合。。

图1：本发明的总体技术流程示意图。

图2：是本发明克隆的PAPPA2基因的上游序列和本发明分子标记的核苷酸序列。附图说明：图2中序列的52位碱基处存在一个A/G等位基因突变(52bp处的英文字母“R”为突变位点)。

图3：是本发明分子标记的SNP位点的峰图。

具体实施方式

实施例1：基因分型检测

(1)利用苯酚抽提法提取杜洛克猪×二花脸猪F2代群体的耳朵组织DNA

1)将杜洛克×二花脸F2代群体(广东华农温氏畜牧股份有限公司提供)的耳样组织在液氮中磨碎，加入等体积1×SET(1mL)，蛋白酶K(10ng/mL)至终浓度200ug/mL，十二烷基硫酸钠(即SDS，10％)至终浓度0.5％，摇匀。55℃水浴温育过夜消化。

2)将消化后的组织样加入等体积的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管15min，于低温冷冻离心机中4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清液转移至另一离心管中，标上相应记号。

3)加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比25：24：1)，缓慢颠倒离心管10min，于低温离心机中4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清，转移至另一个干净的离心管中。

4)加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24：1)，缓慢颠倒离心管10min，于低温冷冻离心机中4℃、11000rpm离心10min。

5)将上清液吸入标记好的的离心管中，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，即可以看到白色絮状DNA。

6)用枪头将DNA沉淀挑出，置于装有对应号码的EP管中，室温下让乙醇挥发干净，加入适量的超纯水(一般300ul左右)溶解DNA。

7)在DNA浓度测定仪上测定其浓度与纯度，并在1％琼脂糖凝胶80伏电泳约2h，紫外灯下检测提取的DNA质量。

(2)引物设计

根据SNP位点序列信息，以猪PAPPA2基因(ENSSSCG00000015512)上游序列为模板，使用Sequenom公司的引物设计软件Assay design3.1，设计PCR反应和单碱基扩增引物。

PCR扩增引物(引物序列的前10个碱基为标签序列，见下划线所示的序列)：

正向引物：5’-ACGTTGGATGAACAAGACCATAGAGGAAAC-3’

反向引物：5’-ACGTTGGATGGGAATAATGAACGTACCGAC-3’。

PCR产物延伸引物组合(引物序列的前4个碱基为标签序列，见下划线所示的序列)：

引物1：5’-CCCATTCTCACAATAAGAACAGGA-3’(如序列表SEQ ID NO：4所示序列对应)；

引物2：5’-CCCATTCTCACAATAAGAACAGGAA-3’(如序列表SEQ ID NO：5所示序列对应)；

引物3：5’-CCCATTCTCACAATAAGAACAGGAG-3’(如序列表SEQ ID NO：6所示序列对应)。

(3)PCR扩增

反应体系(384孔PCR版+38％的试剂损耗)，见表1。

表1 PCR反应体系-1

扩增条件：94℃预变性900s，(94℃变性20s、56℃退火30s、72℃延伸60s)45个循环，72℃延伸180s，4℃终止反应。将PCR产物进行碱性磷酸酶处理。

(4)碱性磷酸酶(SAP)消化：

反应体系(384孔PCR板+38％的试剂损耗)，见表2。

表2 PCR反应体系-2

扩增条件：37℃40min，85℃5min，4℃终止反应，将PCR产物进行延伸反应。

(5)延伸反应：

反应体系(384孔PCR板+38％的试剂损耗)，见表3。

表3 PCR反应体系-3

扩增条件：94℃预变性30s，{94℃变性5s，(52℃退火5s，80℃延伸5s)5个循环}40个循环，72℃延伸180s，4℃终止反应。将PCR产物进行上机检测。

(6)上机检测：

A)将反应产物(共9μL)稀释3倍，按常规方法，使用树脂进行脱盐。

B)将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶。

C)上机进行质谱检测，并收集数据。

根据收集数据统计基因型分型检测结果。基因型检测结果表明，在384个样品中检测出317个样品，检出率为82.55％。其中：在317个个体中AA基因型有108个个体，占34.07％；GG基因型有54个个体，占17.03％；AG基因型有155个个体，占48.90％。

实施例2：PAPPA2分子标记分型方法在猪免疫性状关联分析中的应用

(1)PAPPA2分子标记分型结果与免疫性状关联分析

用于基因型与免疫性状关联检测分析所用的实验猪群来自广东华农温氏畜牧股份有限公司培育的杜洛克×二花脸杂交的F2代群体(为常规品种)。基因分型所用的DNA由杜洛克×二花脸杂交的F2代(以下正文内容和表中的“杜洛克×二花脸杂交的F2代”简称“猪”)耳样提取，用于血常规检测和流式分析的血液采自20、33、35和80日龄的猪，其中20、33日龄的猪未接种聚肌胞(PolyI:C)，第35日龄的仔猪接种聚肌胞(PolyI:C)4小时后采集血样，用于ELISA分析的血清也来自35日龄的猪接种聚肌胞(PolyI:C)4小时后采集血样。运用固定模型统计分析PAPPA2基因上游序列SNP位点的基因型效应与免疫指标的关系。

建立了如下所示的数学模型：

数学模型如下：Y＝Xβ+e

其中：Y为免疫性状测定值向量；X为固定效应关联矩阵；β为固定效应参数向量，包括基因型效应、公畜效应、公畜内母畜效应；e为随机残差效应。

采用SAS9.1进行统计分析，结果见表4、5、6。

表4 PAPPA2基因上游序列52A/G多态性与20日龄猪部分免疫性状的关联分析检测

注：表4中，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

表5 PAPPA2基因上游序列52A/G多态性与33日龄猪部分免疫性状的关联分析检测

注：表5中，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

表6 PAPPA2基因上游序列52A/G多态性与35日龄猪部分免疫性状的关联分析检测

注：表6中，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

由表4-6可知，GG基因型在20日龄的白细胞数(WBC)、淋巴细胞数(LY)、单核细胞数(MO)、血红蛋白浓度(HGB)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)，33日龄的红细胞平均血红蛋白浓度、红细胞分布宽度(RDW)，35日龄的白细胞数、嗜中性细胞数(NE)、嗜酸性细胞数(EO)、红细胞平均血红蛋白浓度性状都显著高于AA或AG基因型(P<0.05)；GG基因型在33日龄的红细胞分布宽度性状显著低于AA或者AG基因型(P<0.05)。因此G等位基因对20日龄的白细胞数(WBC)、淋巴细胞数(LY)、单核细胞数(MO)、血红蛋白浓度(HGB)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)，33日龄的红细胞平均血红蛋白浓度，红细胞分布宽度(RDW)，35日龄的白细胞数(WBC)、嗜中性细胞数、嗜酸性细胞数、红细胞平均血红蛋白浓度等性状是有利等位基因，因此选择G等位基因对猪免疫性状选择是有利的。

主要参考文献：

1.唐国庆等,猪抗病育种研究进展.中国畜牧兽医,2002,29(6):29-32.

2.严燕等,猪遗传抗性与抗病育种研究进展.猪业科学,2007,6:58-61.

3.刘筱等,猪Toll样受体4基因(TLR4)外显子SNP检测及生物信息学分析.江苏农业学报,2011,27(4):782-789.

4.董文华等,猪CD14基因多态性及其对部分免疫指标的遗传效应分析.中国畜牧杂志,2014,50(13):1-5.

5.Overgaard MT,Boldt HB,Laursen LS,Sottrup-Jensen L,Conover CA,OxvigC:Pregnancy-associated plasma protein-A2(PAPP-A2),a novel insulin-like growthfactor-binding protein-5 proteinase.The Journal of biological chemistry 2001,276(24):21849-21853.

6.Richert MM,Wood TL:The insulin-like growth factors(IGF)and IGF typeI receptor during postnatal growth of the murine mammary gland:sites ofmessenger ribonucleic acid expression and potential functions.Endocrinology1999,140(1):454-461.

7.王宇鸿等,IGF-1免疫调节作用.国外医学免疫学分册,2001,24(4):187-190.

8.Clark R,Strasser J,McCabe S,Robbins K,Jardieu P:Insulin-like growthfactor-1stimulation of lymphopoiesis.The Journal of clinical investigation1993,92(2):540-548.

9.汪波等,胰岛素样生长因子的研究进展.黑龙江畜牧兽医,2010,(5):25-27.

10.赵晓枫等,胰岛素生长因子结合蛋白5基因(IGFBP5)部分编码序列的SNP快速筛查及其多态性对猪生产性能的影响.农业生物技术学报,2009,17(5):758-762.

11.吴庆燕等,IGFBP-5基因在不同猪种间的表达差异及5’端序列特征分析.中古兽医学报,2015,35(4):655-660.

12.Wang J,Qiu Q,Haider M,Bell M,Gruslin A,Christians JK:Expression ofpregnancy-associated plasma protein A2during pregnancy in human and mouse.TheJournal of endocrinology 2009,202(3):337-345。

序列表

<110> 广西扬翔股份有限公司；华中农业大学

<120> PAPPA2基因上游片段作为猪免疫性状的分子标记及应用

<141> 2017-09-17

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 82

<212> DNA

<213> 猪(sus scrofa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(82)

<220>

<221> mutation

<222> (52)..(52)

<400> 1

aacaagacca tagaggaaac tatgaaattt cttctcacaa taagaacagg agtttcttaa 60

aagtcggtac gttcattatt cc 82

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 猪(sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(30)

<400> 2

acgttggatg aacaagacca tagaggaaac 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 猪(sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(30)

<400> 3

acgttggatg ggaataatga acgtaccgac 30

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 猪(sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(24)

<400> 4

cccattctca caataagaac agga 24

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 猪(sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(25)

<400> 5

cccattctca caataagaac aggaa 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 猪(sus scrofa)

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(25)

<400> 6

cccattctca caataagaac aggag 25

Claims (2)

1.一种分子标记在非诊断目的的杜洛克猪×二花脸猪F2代免疫性状辅助选择中的应用，所述的免疫性状为20日龄的白细胞数、淋巴细胞数、单核细胞数、血红蛋白浓度、红细胞平均血红蛋白浓度，33日龄的红细胞平均血红蛋白浓度，红细胞分布宽度，35日龄的白细胞数、嗜中性细胞数、嗜酸性细胞数和红细胞平均血红蛋白浓度性状，所述的分子标记的核苷酸序列为：

AACAAGACCATAGAGGAAACTATGAAATTTCTTCTCACAATAAGAACAGGARTTTCTTAAAAGTCGGTACGTTCATTATTCC，

上述序列52bp处的R是一个等位基因的突变，即由A突变为G，G是有利等位基因，该突变引起Sequenom MassARRAY®SNP分型多态性。

2.一种引物组合在非诊断目的的杜洛克猪×二花脸猪F2代免疫性状辅助选择中的应用，所述的免疫性状为20日龄的白细胞数、淋巴细胞数、单核细胞数、血红蛋白浓度、红细胞平均血红蛋白浓度，33日龄的红细胞平均血红蛋白浓度，红细胞分布宽度，35日龄的白细胞数、嗜中性细胞数、嗜酸性细胞数和红细胞平均血红蛋白浓度性状，所述的引物组合的序列为：

引物1：CCCATTCTCACAATAAGAACAGGA，

引物2：CCCATTCTCACAATAAGAACAGGAA，

引物3：CCCATTCTCACAATAAGAACAGGAG。

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