CN105018483B - Dock2基因片段作为猪免疫性状的分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及DOCK2基因片段作为猪免疫性状的分子标记及应用。所述的分子标记由猪DOCK2基因克隆得到，所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，在该序列的第35位碱基处有一个A35‑G35的碱基突变，通过在正向引物倒数第四位碱基位置引入突变，使得A35‑G35形成BstZ17I‑RFLP多态。本发明为猪免疫性状的标记辅助选择提供了一个新的SNP分子标记。

Description

DOCK2基因片段作为猪免疫性状的分子标记及应用

技术领域

本发现属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及DOCK2基因片段作为猪免疫性状的分子标记及应用。

背景技术

我国养猪历史悠久，养猪经验和品种资源极为丰富，养猪数量稳居世界榜首，并推动了世界养猪业的发展。然而，养猪业的发展也面临着很多挑战，其中突出的问题是对某些疫病的控制能力尚低，在疾病监测、诊断、预防和扑灭等环节仍存在很多问题，因此，在养殖生产过程中的疾病问题是影响养猪业发展的关键性问题之一。生猪养殖过程中疾病的爆发可直接导致生猪的死亡，出栏率降低，进而影响生猪养殖的经济效益。于此同时，为了预防疾病而大量使用药物一方面增加养殖成本，另一方面也导致了病菌耐药性出现而使得养殖场疾病的防治更加艰难，药物大量使用也使得猪肉食品安全问题突出。因此，在生猪养殖过程中的疾病防控，直接关系到这一产业的发展和猪肉食品市场。尽量避免大量使用药物，寻找抗病新策略，从培育抗病品系入手，是改善养猪行业行情的热门研究方向。

外来种猪在育成的过程中生长性状受到强烈选择，有研究表明生长与免疫存在负相关(唐国庆等,猪抗病育种研究进展.中国畜牧兽医,2002,29(6):29-32；严燕等,猪遗传抗性与抗病育种研究进展.猪业科学,2007,6:58-61.)，中外猪种在抗病、抗逆性状中存在明显差异(唐利洲等,MHC基因对地方保护猪种抗病选育的应用前景.畜牧与饲料科学,2010,31(2):142-143；施启顺等,不同猪种E.coli F1 8受体基因的多态性.遗传学报,2003,30(3):221-224.)。本申请人利用全基因组信息进行进化分析，发现DOCK2(Dedicatorof Cytokinesis2)基因在中外猪种中基因频率存在显著差异，这表明该基因受到了强烈选择。功能分析发现，DOCK2基因的第3内含子区在物种间高度保守，其中一个高度保守的CEBPβ转录因子结合位点存在一个A/G多态，在中国地方猪品种中G等位基因频率很高，外来猪品种中A等位基因频率很高。

大量的研究表明DOCK2基因在机体免疫抗病中发挥重要作用。DOCK2属于造血细胞特异表达的CDM蛋白家族成员(Nishihara,T等,Non-adherent cell-specific expressionof DOCK2,a member of the human CDM-family proteins.Biochem,1999,1452:179-187.)；研究表明CDM蛋白家族在细胞表面延伸过程起重要作用(Y.C.Wu等,C.elegansphagocytosis and cell-migration protein CED-5is similar to humanDOCK180.Nature,1998,392:501-504.)。功能研究表明DOCK2主要通过激活Rac促进免疫细胞伪足形成，促进免疫细胞迁移，而免疫细胞迁移在机体免疫作用中发挥重要功能(Lauffenburger,D.A等,Cell migration:a physically integrated molecularprocess.Cell,1996,84:359-369；Yoshinori Fukui等,Haematopoietic cell-specificCDM family protein DOCK2is essential for lymphocyte migration.Nature,2001,412:826-831.)。Rac属于Rho家族，具有GTP酶活性，Rac激活会引起免疫细胞表面肌动蛋白纤维丝的组装，从而导致免疫细胞表面形成伪足和褶皱，促使免疫细胞往高浓度趋化因子部位迁移(Alan Hall,Rho GTPases and the actin cytoskeleton.Science,1998,279:1995；Hiroshi Nishihara等,DOCK2associates with CrkL and regulates Rac1 inhuman leukemia cell lines.Blood,2002,100:3968-3974.)。另外，DOCK2还能够通过调节肌动蛋白细胞骨架，影响淋巴细胞归巢和免疫突触形成；DOCK2缺陷的受体因在器官移植中MHC抗原递呈存在障碍，从而降低免疫排斥反应(Hongsi Jiang等,Deletion of DOCK2,aregulator of the actin cytoskeleton in lymphocytes,suppresses cardiacallograft rejection..JEM,2005,202:1121-1130.)。DOCK2基因突变会抑制体内Rac1活化，从而减低T细胞、B细胞和NK细胞在趋化因子诱导时的迁移能力；而当侵入性病毒感染DOCK2基因突变的外周血单核细胞时，IFN-α和IFN-λ分泌显著减少。在DOCK2缺陷的成纤维细胞中，病毒复制增加，被病毒感染的细胞的死亡的发生也增加(Kerry Dobbs,B.S.等,Inherited DOCK2deficiency in patients with early-onset invasiveinfections.The New England Journal of Medicine,2015,372:2409-2422.)。这些研究都表明DOCK2在机体免疫抗病中发挥重要作用。

本发明申请中，申请人克隆了DOCK2基因的第3内含子片段，鉴定了一个与猪免疫性状密切相关的功能突变位点，为猪免疫性状的的标记辅助选择提供了新的SNP分子标记。

发明内容

本发明的目的在于通过PCR扩增DOCK2基因第3内含子片段，利用CRS-PCR-RFLP技术，在杜洛克×二花脸F2代群体中进行分型，分型结果与该群体的免疫指标关联分析，进而鉴定与猪免疫性状相关的分子标记，为猪的抗病育种提供了新的分子标记。

申请人通过基因克隆的方法，得到DOCK2基因第3内含子序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。在该序列的35bp处存在一个A35-G35等位基因的碱基突变，通过在正向引物倒数第四位碱基位置引入突变，使得A35-G35形成BstZ17I-RFLP多态。申请人将该基因片段作为检测猪免疫性状的分子标记。

为了扩增DOCK2基因第3内含子序列，申请人设计了如下所示的引入酶切位点的引物对：

正向引物：5’-AGATAAGCCACCACGGAATGGAGAAATTGCgTAT-3’(见序列表SEQ ID NO：2)

反向引物：5’-ATCCCTGGTCTGTGGCATGTCC-3’(见序列表SEQ ID NO：3)。

同时申请人制备了检测上述与猪免疫性状相关的分子标记的引物对，该引物对的DNA序列如下所示：

正向引物：5’-AGATAAGCCACCACGGAATGGAGAAATTGCgTAT-3’(见序列表SEQ ID NO：2)

反向引物：5’‐ATCCCTGGTCTGTGGCATGTCC‐3’(见序列表SEQ ID NO：2)。

申请人提供了一种猪免疫性状的分子标记的制备方法，其包括下列步骤：

1)提取猪耳样组织基因组DNA；

2)对DOCK2基因第3内含子片段进行扩增、纯化与测序；

3)利用CRS‐PCR‐RFLP方法对该片段在突变位点进行分型；

4)利用SAS 9.1软件进行基因型与猪免疫性状间的关联分析。

更详细的技术方案请参见说明书的《附图说明》及《具体实施方式》中的实施例。

本发明应用常规的PCR-RFLP的方法对序列表SEQ ID NO：1所示的第35位碱基突变进行了检测，并初步进行其基因型与猪免疫性状之间的关联分析的应用，为猪免疫性状的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

与现有技术相比本发明具有的有益效果：

本发明可通过在体外CRS-PCR-RFLP检测猪的基因型，作为非诊断目的的评价猪的免疫能力，与目前ELISA、流式细胞仪等方法相比，本发明更简便、检测更准确、成本更低廉、速度也更快。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的DOCK2基因内含子，即本发明制备的分子标记的核苷酸序列。序列长度为116bp，在该序列的35bp处存在一个A/G等位基因突变(35bp处的碱基“G”为突变后的碱基)。

序列表SEQ ID NO：2是本发明克隆的DOCK2基因内含子和本发明分子标记的正向引物序列。序列长度为34bp。

序列表SEQ ID NO：3是本发明克隆的DOCK2基因内含子和本发明分子标记的反向引物序列。序列长度为22bp。

图1：本发明的总体技术流程示意图。

图2：本发明克隆的DOCK2基因内含子序列PCR产物电泳图谱，附图标记说明：泳道2-11为扩增个体，泳道1的M为DL 2000。

图3：DOCK2基因内含子序列BstZ17I-RFLP的三种基因型(AA GG AG)电泳图谱，附图标记说明：泳道2-9为酶切个体，泳道1的M为DL 500。

图4：是本发明克隆的DOCK2基因内含子和本发明分子标记的核苷酸序列。图中序列的35bp处存在一个A/G等位基因突变(35bp处的英文字母“R”为突变位点)。

具体实施方式

实施例1猪DOCK2基因内含子序列的克隆

(1)利用苯酚抽提法提取杜洛克×二花脸F2代群体的耳样组织总DNA

1)将杜洛克×二花脸F2代群体(广东华农温氏畜牧股份有限公司提供)的耳样组织在液氮中磨碎，加入等体积1×SET(1mL),蛋白酶K(10ng/mL)至终浓度200ug/mL，十二烷基硫酸钠(即SDS，10％)至终浓度0.5％，摇匀。55℃水浴温育过夜消化。

2)将消化后的组织样加入等体积的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管15min，于低温冷冻离心机中4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清液转移至另一离心管中，注意标上相应的记号。

3)加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比25：24：1)，缓慢颠倒离心管10min，于低温离心机中4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清，转移至另一个干净的离心管中。

4)加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24：1)缓慢颠倒离心管10min，于低温冷冻离心机中4℃、11000rpm离心10min。

5)将上清液吸入标记好的的离心管中，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，即可以看到白色絮状DNA。

6)用枪头将DNA沉淀挑出，置于装有对应号码的EP管中，室温下让乙醇挥发干净，加入适量的超纯水(一般300ul左右)溶解DNA。

7)在DNA浓度测定仪上测定其浓度与纯度，并在1％琼脂糖凝胶80伏电泳约2h，紫外灯下检测提取的DNA质量。

(2)引物设计

以猪DOCK2第3内含子序列为模板，利用生物学引物设计软件Primer Premier5.0，设计扩增包含突变位点的引物，该引物对的DNA序列如下：

正向引物：5’-AGATAAGCCACCACGGAATGGAGAAATTGCgTAT-3’(将该引物序列的第31位的原碱基T错配成g，见序列表SEQ ID NO：2)

反向引物：5’-ATCCCTGGTCTGTGGCATGTCC-3’(见序列表SEQ ID NO：3)

(3)PCR扩增

PCR反应体系总体积为20ul：双蒸水10.5ul，10x PCR Buffer2ul，dNTP Mix1.6ul，正向引物0.4ul，反向引物0.4ul，rTaq酶0.1ul，杜洛克×二花脸F2代群体基因组DNA5ul。扩增条件：95℃预变性1min、95℃变性30s、59℃退火30s、72℃延伸15s、35个循环、72℃再延伸5min。取2ulPCR产物经3％琼脂糖凝胶电泳检测，得到如图2所示的效果，将所得的阳性样品用于下一步酶切检测，共检测382个样本。

(4)PCR产物的纯化和测序

PCR产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml离心管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自OMEGA公司，按该试剂盒的说明书操作)纯化PCR产物，所得纯化PCR产物-20℃保存备用。

(5)DNA序列测定

序列测定由武汉擎科创新生物科技有限公司完成，基因片段测反向反应。

实施例2：CRS-PCR-RFLP基因型检测方法的建立

(1)引物设计

针对多态位点A35-G35引入酶切位点设计了一对引物，用于基因型检测，所述的引物对的DNA序列如下所示：

正向引物：5’-AGATAAGCCACCACGGAATGGAGAAATTGCgTAT-3’(将该引物序列的第31位的原碱基T错配成g，见序列表SEQ ID NO：2)

反向引物：5’-ATCCCTGGTCTGTGGCATGTCC-3’(见序列表SEQ ID NO：3)

(2)PCR扩增

PCR反应体系总体积为20ul：双蒸水10.5ul，10x PCR Buffer2ul，dNTP Mix1.6ul，正向引物0.4ul，反向引物0.4ul，rTaq酶0.1ul，杜洛克×二花脸F2代群体基因组DNA5ul。扩增条件：95℃预变性1min、95℃变性30s、59℃退火30s、72℃延伸15s、35个循环、72℃再延伸5min。取2ulPCR产物经3％琼脂糖凝胶电泳检测，得到如图2所示的效果，将所得的阳性样品用于下一步酶切检测，共检测382个样本。

(3)RFLP检测结果

酶切体系总体积为10ul：PCR产物8.9ul、10x Buffer 0 1ul、限制性内切酶BstZ17I 0.1ul(10U/ul)，37℃培养箱酶切10h，取10ul酶切产物用3.5％琼脂糖凝胶电泳检测分型。分子标记基因型分析的结果如图3所示，分别代表A35-G35处单核苷酸多态性3种不同基因型即AA、GG、AG，电泳结果显示AA基因型(可见有两条带，长度为83bp和33bp)、GG基因型(可见只有一条带，长度为116bp)、AG基因型(可见有三条带，长度为116bp、83bp、33bp)。基因型检测结果表明在382个个体中AA基因型有96个个体，占25％；GG基因型有88个个体，占23％；AG基因型有198个个体，占52％。

实施例3：DOCK2分子标记分型方法在免疫性状关联分析中的应用

(1)DOCK2分子标记分型结果与免疫性状关联分析

用于基因型与免疫性状关联检测分析所用的实验猪群的原始来源来自广东华农温氏畜牧股份有限公司培育的的杜洛克×二花脸杂交的F2代群体(为常规品种)。基因分型所用的DNA由杜洛克×二花脸杂交的F2代(以下正文内容和表1-8中的“杜洛克×二花脸杂交的F2代”简称“猪”)耳样提取，用于血常规检测和流式分析的血液采自20、33、35和80日龄的猪，其中20、33日龄的猪未接种聚肌胞(PolyI:C)，第35日龄的仔猪接种聚肌胞(PolyI:C)4小时后采集血样，用于ELISA分析的血清也来自35日龄的猪接种聚肌胞(PolyI:C)4小时后采集的血样。运用固定模型统计分析DOCK2基因第3内含子序列SNP位点的基因型效应与免疫指标的关系。

数学模型如下：Y＝Xβ+e

其中：Y为免疫性状测定值向量；X为固定效应关联矩阵；β为固定效应参数向量，包括基因型效应、公畜效应、公畜内母畜效应；e为随机残差效应。

采用SAS9.1进行统计分析，结果见表1、2、3、4。

表1 DOCK2基因内含子片段35A/G多态性与20日龄猪部分免疫性状的关联分析检测

表2 DOCK2基因内含子片段35A/G多态性与33日龄猪部分免疫性状的关联分析检测

嗜碱性粒细胞比率 0.0325

表3 DOCK2基因内含子片段35A/G多态性与35日龄猪部分免疫性状的关联分析检测

表4 DOCK2基因内含子片段35A/G多态性与80日龄猪部分免疫性状的关联分析检测

(2)与DOCK2基因内含子序列A35-G35(BstZ17I-RFLP)分子标记关联的免疫性状

对猪DOCK2基因内含子序列BstZ17I-RFLP位点与免疫性状进行关联分析，所分析的性状主要包括20、33、35、80日龄的22个血常规指标，20、33、35日龄的T细胞亚型，35日龄的细胞因子。所得到相关的性状是20日龄的三阴性T细胞CD4-CD8-CD3-，33日龄的平均血小板体积(MPV)，35日龄的白介素10(IL-10)，80日龄的白细胞数(WBC)、中性粒细胞数(NE)，整理结果见表5、6、7、8。

表5 DOCK2基因内含子片段35A/G多态性不同基因型对20日龄猪免疫性状的影响

注：同一列中使用相同的上标的最小二乘均数彼此间存在显著差异。

表6 DOCK2基因内含子片段35A/G多态性不同基因型对33日龄猪免疫性状的影响

注：同一列中使用相同的上标的最小二乘均数彼此间存在显著差异。

表7 DOCK2基因内含子片段35A/G多态性不同基因型对35日龄猪免疫性状的影响

注：同一列中使用相同的上标的最小二乘均数彼此间存在显著差异。

表8 DOCK2基因内含子片段35A/G多态性不同基因型对80日龄猪免疫性状的影响

注：同一列中使用相同的上标的最小二乘均数彼此间存在显著差异。

由表5、6、7、8可知，AA基因型个体20日龄的三阴性T细胞CD4-CD8-CD3-，33日龄的平均血小板体积(MPV)，80日龄的白细胞数(WBC)、中性粒细胞数(NE)性状都显著高于AG或GG基因型(P<0.05)；AA基因型个体35日龄的白介素10(IL-10)显著低于AG或GG基因型(P<0.05)。因此，A等位基因对20日龄的三阴性T细胞CD4-CD8-CD3-，33日龄的平均血小板体积(MPV)，35日龄的白介素10(IL-10)，80日龄的白细胞数(WBC)、中性粒细胞数(NE)等性状是有利等位基因，因此选择A等位基因对猪免疫性状选择是有利的。

Claims (2)

1.一种猪免疫性状分子标记在猪免疫性状标记辅助选择中的应用，其特征在于，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述，在所述的序列的35bp处有一个A35‐G35的碱基突变，导致BstZ17I‐RFLP多态性。

2.一种猪免疫性状的引物对在猪免疫性状标记辅助选择中的应用，其特征在于，所述引物对的DNA序列如下所示：

正向引物：AGATAAGCCACCACGGAATGGAGAAATTGCgTAT，

反向引物：ATCCCTGGTCTGTGGCATGTCC。