CN113774144A

CN113774144A - 抗猪蓝耳病的分子标记及其检测试剂盒研发与应用

Info

Publication number: CN113774144A
Application number: CN202111006066.8A
Authority: CN
Inventors: 刘榜; 刘雯悦; 周翔; 吴清清; 谌阳; 高国丽; 张庆德; 官凯锋
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2021-08-30
Filing date: 2021-08-30
Publication date: 2021-12-10
Anticipated expiration: 2041-08-30
Also published as: CN113774144B

Abstract

本发明提供了抗猪蓝耳病(PRRS)相关的SNP分子标记，属于分子遗传学领域，具体涉及猪EFL1基因第12内含子和DBNL基因第9内含子变异位点的分子标记检测方法及其在抗猪蓝耳病育种中的应用。所述抗猪蓝耳病相关SNP标记的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.1～NO.2所示。本发明提供了用于检测抗猪蓝耳病相关分子标记检测试剂盒，即扩增EFL1和DBNL基因SNPs的检测试剂盒。本发明提供的分子标记不受猪年龄、性别以及环境所限制，可在仔猪出生后检测筛选抗病个体，实施早期选择和抗病育种。

Description

抗猪蓝耳病的分子标记及其检测试剂盒研发与应用

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种筛选抗猪蓝耳病猪的育种方法，通过判断猪EFL1基因第12内含子和DBNL基因第9内含子突变位点的多态性进行早期选择，并应用该突变位点实现蓝耳病抗病育种。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)俗称“蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome Virus,PRRSV)引起的一种以各年龄段猪呼吸障碍、母猪繁殖障碍和仔猪高死亡率为主要特征的高度传染性疾病，对全球生猪养殖业造成巨大损失。目前，我国PRRS防控主要依赖于疫苗，然而当前PRRSV商业灭活疫苗大多是基于单个PRRSV病毒株，对具有高度变异的PRRSV感染并没有很好的保护效力，而弱毒苗还会带来疫苗毒株感染、毒力返强等潜在威胁。因此，从遗传水平增强宿主对PRRS的抗病力，选育抗PRRS的优良品种，对于防控PRRSV大规模流行提供了一个研究途径，为解决PRRS防控难题带来了新希望。

病毒载量是病毒感染后宿主与病毒相互斗争进而影响疾病进程的指标。感染PRRSV早期会对宿主产生免疫抑制，从而促进病毒大量繁殖，感染后期机体免疫应答与病毒的博弈决定着机体抗病性和个体存活能力，而抗病个体的免疫系统将抑制病毒增殖并使病毒载量逐渐降低，甚至完全被清除。发明人课题组前期发现通城猪与大白猪相比表现出较强的抗病力，通过人工感染PRRSV后发现两品种在临床症状、细胞因子水平、血常规指标、血清中的病毒载量等性状中存在较大差异，病毒血症最高值约为大白猪最高值的2/5(Liang等，Differences of immune responses between Tongcheng(Chinese local breed)andLarge White pigs after artificial infection with highly pathogenic porcinereproductive and respiratory syndrome virus.Virus Res.2016 Apr 2；215:84-93.)。据此，发明人课题组以大白猪×通城猪高代横交群体为研究对象，通过PRRSV人工感染，以感染后第14天个体存活情况划分易感组和抗病组，结果表明抗病组的病毒载量在第4、7、11天均显著低于易感组(P<0.05)(高国丽等，HP-PRRSV人工感染后猪血清病毒载量和体重增长的变化规律[J].华中农业大学学报,2020,39(05):56-61.)。血液病毒载量高低能够反映不同个体对PRRS抗病和易感程度，但其必须在病毒感染后才能检测，如果能通过检测免疫相关性状的分子标记就可在疾病发生前筛选抗病个体，实施抗PRRS的早期选择和抗病育种。因此本发明通过将SNP位点与猪感染PRRSV后不同时间点病毒载量性状进行关联分析，以期为猪抗病育种提供有效的分子标记。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明通过筛选猪抗PRRS的分子标记，并建立相应的检测方法，为PRRS抗病育种提供有效的分子遗传标记和技术方法。

本发明通过与猪感染PRRSV后不同时间点(第4、7、11、14、21天)的病毒载量性状关联分析，发掘猪EFL1第12内含子和DBNL第9内含子的SNP位点作为猪PRRS抗性相关的分子标记，其中DBNL基因是一种含有多个蛋白相互作用结构域的接头蛋白，能够激活T细胞和B细胞的增殖分化能力、细胞因子产生能力，在免疫反应中起到重要作用(Jiang Y等，Multi-omic analysis reveals HIP-55-dependent regulation of cytokines release.BiosciRep.2020 Mar 27；40(3):BSR20200298.)。本发明为猪抗病育种和标记辅助选择提供了2个新的分子育种标记，只需通过检测上述分子标记中的一个或多个就能实现抗病个体的早期选种。

本发明的目的之一在于提供与猪感染PRRSV后病毒载量相关的分子标记，所述分子标记的基因序列是：

1)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，其中第342位的碱基R为A或G；

2)SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，其中第287位的碱基Y为C或T。

具体地，所述的分子标记位于EFL1第12内含子和DBNL第9内含子的SNP位点，所述EFL1基因第12内含子的SNP位点即rs321292465如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第342位的碱基R为G或A的等位基因突变，所述DBNL基因第9内含子的SNP位点即rs332085527如SEQID NO.2所示核苷酸序列的第287位的碱基Y为C或T的等位基因突变。

本发明的目的之二在于提供如上所述的分子标记在猪抗病育种标记辅助选择中的应用。

如上所述的应用，优选地，在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列第342位的碱基R为A是抗病性强的指示；在SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列第287位的碱基Y为C是抗病性强的指示。

本发明的目的之三在于提供含有所述引物的分子标记检测试剂盒。优选地，其还包括下述试剂中的一种或多种：Taq酶、dNTPs、MgCl₂、PCR缓冲液、双蒸水。

其中，所述引物为：

(1)用于检测含rs321292465位点的扩增片段SEQ ID NO.1所示序列的EFL1引物对，所述EFL1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.6所示；

(2)用于检测含rs332085527位点的扩增片段SEQ ID NO.2所示序列的DBNL引物对，所述DBNL引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.10所示。

本发明的目的之四在于提供使用所述检测试剂盒检测猪感染PRRSV后病毒载量性状相关SNP分子标记的方法。

具体地，包括以下步骤：

步骤一、提取待测样品中的基因组DNA。

步骤二、以步骤1提取的DNA为模板，通过所述SEQ ID NO.3～6、SEQ ID NO.7～10所示两组内外引物对分别对EFL1和DBNL基因构建Tetra-primer ARMS-PCR扩增体系进行PCR扩增；

步骤三、对PCR扩增产物进行电泳检测和结果判定。

如上所述的方法，优选地，所述结果判定为：

(A)rs321292465位点(EFL1基因)检测，若扩增片段为三条，大小分别为610、364和298bp，则判定该待测样品的个体基因型为杂合子GA；若扩增片段为两条，如分别为610和364bp，则判定该待测样品的个体基因型为纯合子AA；如分别为610和298bp，则判定该待测样品的基因型为纯合子GG；

(B)rs332085527位点(DBNL基因)检测，若扩增片段为三条，大小分别为519、304和257bp，则判定该待测样品的个体基因型为杂合子CT；若扩增片段为两条，如分别为519和304bp，则判定该待测样品的个体基因型为纯合子TT；如分别为519和257bp，则判定该待测样品的个体基因型为纯合子CC；

分子标记rs321292465位点等位基因为A，且为纯合子AA基因型和/或rs332085527位点等位基因为C，且为纯合子CC基因型的检测个体对PRRS具有更强的抗病力。通过选择rs321292465位点为AA基因型和/或rs332085527为CC基因型的个体留种，具有对PRRS较强的抗病性，可提高群体抗病力，有助于猪的抗病育种。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了2个与猪PRRSV抗性相关的分子标记位点(rs321292465和/或rs332085527)。所述的分子标记分别位于猪EFL1基因的第12内含子和DBNL基因的第9内含子DNA序列中的SNP位点，可通过检测这2个SNP的碱基类型来筛选抗病个体，既可分别单独使用，也可一起联合使用，本发明为猪的分子育种提供了2个新的分子标记。依照本发明，所述与猪PRRS抗性相关分子标记可应用在猪标记辅助选择中。

附图说明

图1是本发明中rs321292465的Tetra-primer ARMS-PCR扩增PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱，其中，M泳道为DNA分子量标记(DL2000)。

图2是本发明中rs332085527的Tetra-primer ARMS-PCR扩增PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱，其中，M泳道为DNA分子量标记(DL2000)。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明通过分析大白猪×通城猪高代横交群体的基因组DNA，发现2个与猪PRRSV抗性相关的分子标记位点(rs321292465和rs332085527)。本发明以筛选得到的SNP为具体实例，用以说明本发明的方法及对相关位点的验证。

实施例1 Tetra-primer ARMS-PCR检测方法的建立

1.1采集猪耳组织样品提取猪基因组DNA

使用经75％酒精棉消毒的耳号钳剪下一块黄豆大小耳样，用眼科剪剪碎后，采用常用的苯酚-氯仿粗提法(萨姆布鲁克J,弗里奇E F,曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M].第2版.金冬雁,黎孟枫.北京:科学出版社,1999.465-467)或者公认的、具有相同效力的其他提取方法制备DNA模板。

1.2引物设计

根据NCBI数据库中EFL1、DBNL基因的DNA信息，利用Tetra-primer ARMS-PCR引物在线设计程序进行引物设计，共设计4组引物。针对每个SNP位点设计两条3’末端分别与SNP两个等位基因碱基配对且延伸方向相反的内引物和2个方向相反的外引物，同时在内引物3’端第3位碱基引入错配以增加扩增特异性(表2，画下划线的字母代表错配碱基)。引物合成由武汉擎科创新生物科技有限公司完成。

表1 SNP位点基本信息

SNP编号：Ensembl genome browser数据库；参考基因组：Sscrofa11.1

表2引物序列信息

1.2 Tetra-primer ARMS-PCR扩增

PCR反应总体积20μL，其中猪基因组DNA约30ng，含2×Taq PCR Mix(购自深圳市艾伟迪生物科技有限公司)，引物终浓度为10μM。

PCR扩增程序：95℃3min，30×(95℃30s,55/57℃30s,72℃38s)，最后72℃延伸5min。扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察电泳结果并保存，根据扩增片段的大小和条带数目区分不同基因型。

1.3 Tetra-primer ARMS-PCR扩增检测结果判断

对rs321292465位点多态性检测结果判定方法：

对于rs321292465位点(EFL1基因)的检测中，若扩增片段为三条，大小分别为610、364和298bp，则判定该待测样品的个体基因型为杂合子GA；若扩增片段为两条，如分别为610和364bp，则判定该待测样品的个体基因型为纯合子AA；如分别为610和298bp，则判定该待测样品的基因型为纯合子GG；三种基因型的带型分别为：AA(610bp+364bp)，GA(610bp+364bp+398bp)，GG(610bp+298bp)，结果见图1。

对rs332085527位点多态性检测结果判定方法：

对于rs332085527位点(DBNL基因)的检测中，若扩增片段为三条，大小分别为519、304和257bp，则判定该待测样品的个体基因型为杂合子CT；若扩增片段为两条，如分别为519和304bp，则判定该待测样品的个体基因型为纯合子TT；如分别为519和257bp，则判定该待测样品的个体基因型为纯合子CC；三种基因型的带型分别为：TT(519bp+304bp)，CT(519bp+304bp+257bp)，CC(519bp+257bp)，结果见图2。

实施例2本发明的分子标记在人工感染PRRSV后病毒载量性状关联分析中的应用

试验共检测159头大白猪×通城猪高代横交群体，人工感染PRRSV后，准确记录每个个体的血清病毒载量，确定其基因型，并进行基因突变位点与病毒载量的关联分析。

建立如下所述的模型：Y_ijk＝μ+G_i+S_j+W_k+e_ijk

其中，Y_ijk代表性状测定值，μ代表群体均数，G_i代表基因型效应，S_j代表性别效应，W_k代表试验初始体重，e_ijk代表随机误差。

表4 rs321292465位点多态性与病毒载量的关联分析

表4的说明：

(1)加性效应a＝(GG-AA)/2；显性效应d＝GA-(AA+GG)/2。

(2)同一基因同行中肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)；

SNP位点与性状关联分析的结果是：rs321292465多态位点与病毒载量显著相关(P＜0.05)，GG基因型的表型值显著高于AA基因型和GA基因型的表型值(P<0.05)，通过观察可以看出A等位基因在群体中为优势等位基因(见表4)。在育种中可以通过选育得到AA纯合型猪作为种猪进行育种。

表5 rs332085527位点多态性与病毒载量的关联分析

表5的说明：

(1)加性效应a＝(TT-CC)/2；显性效应d＝CT-(CC+TT)/2。

(2)同一基因同行中肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)；

SNP位点与性状关联分析的结果是：rs332085527多态位点与病毒载量显著相关(P＜0.05)，CC基因型的表型值显著低于TT基因型的表型值(P<0.05)，通过观察可以看出C等位基因在群体中为优势等位基因(见表5)。在育种中可以通过选育得到CC纯合型猪作为种猪进行育种。

本发明建立了rs321292465和rs332085527的Tetra-primer ARMS-PCR快速检测方法，仅需一步PCR和电泳即可鉴定个体的基因型。rs321292465和rs332085527可作为猪PRRSV抗病力的分子标记，为后续解析猪的PRRSV抗病分子机制及猪的抗病育种提供了理论基础和技术支撑。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 抗猪蓝耳病的分子标记及其检测试剂盒研发与应用

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 610

<212> DNA

<213> Sus

<220>

<221> misc_feature

<222> (342)..(342)

<223> "R" is "A" or "G".

<400> 1 attattacaa caggagagaa aaaagccccg aggcacctgt tagtatatgg agagaaacag60 tctcttccaa caggctcatc actgatccag acattgtgtt aatcatttta catacactac 120agcacatatt tatcacaaca attaaatggc acagatatta ttactcctat tttacagata 180agcaagtgga ggcttaggaa acttacatga cttgacccaa agtcacacag atgataaacg 240gaggagctgt aattcaaatt cagatctgac tccaaactct atacttgtta tcatcaggct 300ttgtctccca ctcagaagga attaaagatg ataaaacatc arctcattaa gttaagtgtg 360gttttatttt aactggttaa gaaagaagca tattcgttca catatctttt tcctacgccg 420cagccacagc aacgcaggat ccgagcagca tctgcgacct acaccacagc tcacggcaat 480gccagatcct taacccactc actgagcaag gccagggatt gaatctgtac cctcatggat 540gctagttggg ttcattaacc actgagccac catgggaact ccctgctcac atatcttaaa 600

tcatcacttt 610

<210> 2

<211> 519

<212> DNA

<213> Sus

<220>

<221> misc_feature

<222> (287)..(287)

<223> "Y" is "C" or "T"

<400> 2 ctcctcctcc tcctccacct gcacaggaca cggaggggcg ctgggcaccg gctcctcgtg60

gagatctgct ggggaagaca cagcccacgc tgaccctggg gaggggagag ggcatccaac 120

cccctcccca cctccctccc cccggggaag ccgggagtct tgcctgccgc gggccttgag 180

gcggcagggg ctgactctct gctgagggag gtctcgggct gggtgagctg cttctgcagg 240

aaggggctcc tcagcttgcc tgcaaaccag tggtaaacac acaggayatc acagcatcac 300

accgccgcag cagggacggg ccaagcagcc tctggcttcg ctgtgccctg tactgcccgg 360

agggtgcacc tgctctgggc caccggctgt cacccaggga gtgaatgggg agccgcagca 420

ggtgcatgac caccacccgg tgtgcacaca tcacatgcag ctccatgggg gccttgcact 480

gtgctggaga gctgaccaga gcacaatctg atcttctct 519

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3 attattacaa caggagagaa aaaagc 26

<210> 4

<211> <212> <213> 26 DNA 人工序列

<400> 4 aaagtgatga tttaagatat gtgagc 26

<210> <211> <212> <213> 5 29 DNA 人工序列

<400> 5 agaaggaatt aaagatgata aaacataac 29

<210> <211> <212> <213> 6 23 DNA 人工序列

<400> 6 aaaccacact taacttaatg cga 23

<210> <211> <212> <213> 7 23 DNA 人工序列

<400> 7 gcatcatgtt cacagtgcaa agg 23

<210> <211> <212> <213> 8 23 DNA 人工序列

<400> 8 accccaagag gctgaactac gtc 23

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9 gtcatcagat tatgcaacat gtttacga

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccctaggaaa acaccagtac ataaggg 27

Claims

1.与感染猪蓝耳病毒后猪血清病毒载量相关的分子标记物，所述标记物选自以下基因序列中的一个或两个：SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，其中第342位的碱基R为A或G的等位基因突变；或，如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，其中第287位的碱基Y为C或T的等位基因突变。

2.用于特异性扩增包含权利要求1所述分子标记物的突变位点的引物。

3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于，所述引物为：

1)EFL1引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.6所示；和/或，

2)DBNL引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.10所示。

4.包含权利要求2或3所述引物的试剂盒。

5.如权利要求4所述的快速检测试剂盒，其特征在于，其还包括下述试剂中的一种或多种：Taq酶、dNTPs、MgCl₂、PCR缓冲液、双蒸水。

6.权利要求1所述的分子标记物或权利要求2或3所述的引物或权利要求4或5所述的试剂盒在鉴定猪抗病相关性状或猪抗病标记辅助选择育种中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗病是抗感染PRRSV。

8.鉴定猪抗PRRSV感染相关性状的方法，包括以下步骤：

步骤1：提取待测样品中的基因组DNA；

步骤2：以步骤1提取的DNA为模板，通过所述SEQ ID NO.3～6、SEQ ID NO.7～10所示的两组内外引物对分别对EFL1和DBNL基因构建Tetra-primer ARMS-PCR扩增体系进行PCR扩增；

步骤3：对PCR扩增产物进行电泳检测和结果判定。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述结果判定为：

(A)对EFL1基因检测，若扩增片段为三条，大小分别为610bp、364bp和298bp，则判定该待测样品的个体基因型为杂合子GA；若扩增片段为两条，如分别为610bp和364bp，则判定该待测样品的个体基因型为纯合子AA；如分别为610bp和298bp，则判定该待测样品的个体基因型为纯合子GG；

(B)对DBNL基因检测，若扩增片段为三条，大小分别为519bp、304bp和257bp，则判定该待测样品的个体基因型为杂合子CT；若扩增片段为两条，如分别为519bp和304bp，则判定该待测样品的个体基因型为纯合子TT；如分别为519bp和257bp，则判定该待测样品的个体基因型为纯合子CC。

10.一种猪辅助育种方法，其包括采用权利要求8或9所述的方法对猪抗PRRSV感染相关性状进行检测，选择抗性优势品种。