CN116426647A

CN116426647A - 一种鉴定天津猴鸡品种的分子标记组合及其应用

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Publication number: CN116426647A
Application number: CN202310228225.1A
Authority: CN
Inventors: 周成浩; 夏树立; 韩威; 李国辉; 张会永; 殷建玫; 薛倩; 蒋一秀; 苏一军; 赵向华; 于海涛
Original assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Current assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Priority date: 2023-03-10
Filing date: 2023-03-10
Publication date: 2023-07-14

Abstract

本发明公开了一种鉴定天津猴鸡品种的分子标记组合及其应用，涉及分子生物学检测领域。该分子标记组合包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑19所示的分子标记。本发明基于包括天津猴鸡在内的25个代表性中国地方鸡种和2个引进品种的大规模群体，鉴定特异性SNPs位点，筛选出鉴定天津猴鸡的分子标记，结合现有特异性SNP位点的检测方法和AHP层次分析法综合考虑特异性位点的等位基因频率和基因型类型，在确保鉴定准确性的同时，提高了检测效率和评价的科学性。本发明通过使用分子标记技术对天津猴鸡进行科学的品种特异性鉴定和评价，操作简单且结果可靠，可以为地方鸡遗传资源保护和合理利用提供科学依据。

Description

一种鉴定天津猴鸡品种的分子标记组合及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，特别是涉及一种鉴定天津猴鸡品种的分子标记组合及其应用。

背景技术

天津猴鸡(又名天津河源猴鸡)是我国极具特点的兼用型地方品种，原产地和中心产区位于天津河源地区，体型较大，蛋肉品质优良。该品种外貌特征为颈部裸露无羽或头顶部仅有几根冠羽。与常羽鸡相比其羽区之间的裸域增宽，胸部、腿部和其他部位的羽区明显减小，颈部羽区最为明显，羽毛几乎消失，是我国珍贵的裸颈鸡遗传资源。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)，主要指基因组水平上单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性，包括转换、颠换、缺失与插入，所形成的遗传标记数量多、多态性强，每个SNP位点理论上可存在四种不同变异形式，但事实上只发生了转换与颠换两种情况，两者之比是2:1。SNP作为基因组最为普遍的多态形式之一，具有很高的遗传稳定性。

限制性酶切位点关联DNA测序技术(restriction-site-associated DNAsequencing，RAD-seq)是在二代测序技术基础上发展起来的一种简化基因组技术。简化基因组测序(reduced-representation sequencing)采用限制性内切酶酶切基因组，仅选择基因组中的某一区域测序，使基因组复杂程度降低。RAD测序文库的构建就是将基因组DNA片段酶切并随机切断，筛选出一端具有酶切位点另一端具有随机中断位点的片段用于建库测序。RAD-seq可以在不受参考基因组局限的情况下减少基因组复杂度且操作简单，能快速识别高密度SNP。但目前评价天津猴鸡的分子标记功能简单，很难进行天津猴鸡遗传多样性评价，且存在纯种识别方法不确切等问题，为此，在简化基因组测序的基础上，以天津猴鸡为研究对象，筛选单核苷酸多态性的分子标记并进行综合评价是非常有意义的。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定天津猴鸡品种的分子标记组合及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的分子标记组合可以高效、准确评价天津猴鸡个体的血缘纯度，实现品种鉴定，有利于缓解现有技术中由于缺少能够评价茶花鸡遗传多样性的分子标记和现有纯种鉴定方法不准确的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种鉴定天津猴鸡品种的SNP位点组合，包括下表所示的SNP位点：

本发明还提供一种鉴定天津猴鸡品种的分子标记组合，所述分子标记组合包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-19所示的分子标记；

SEQ ID NO.1所示分子标记的11bp处碱基存在突变位点SNP1，为A/G突变；

SEQ ID NO.2所示分子标记的11bp处碱基存在突变位点SNP2，为C/T突变；

SEQ ID NO.3所示分子标记的11bp处碱基存在突变位点SNP3，为C/T突变；

SEQ ID NO.4所示分子标记的11bp处碱基存在突变位点SNP4，为A/T突变；

SEQ ID NO.5所示分子标记的11bp处碱基存在突变位点SNP5，为C/T突变；

SEQ ID NO.6所示分子标记的11bp处碱基存在突变位点SNP6，为A/G突变；

SEQ ID NO.7所示分子标记的11bp处碱基存在突变位点SNP7，为G/A突变；

SEQ ID NO.8所示分子标记的11bp处碱基存在突变位点SNP8，为G/A突变；

SEQ ID NO.9所示分子标记的11bp处碱基存在突变位点SNP9，为G/A突变；

SEQ ID NO.10所示分子标记的11bp处碱基存在突变位点SNP10，为T/C突变；

SEQ ID NO.11所示分子标记的11bp处碱基存在突变位点SNP11，为T/C突变；

SEQ ID NO.12所示分子标记的11bp处碱基存在突变位点SNP12，为A/G突变；

SEQ ID NO.13所示分子标记的11bp处碱基存在突变位点SNP13，为C/T突变；

SEQ ID NO.14所示分子标记的11bp处碱基存在突变位点SNP14，为A/C突变；

SEQ ID NO.15所示分子标记的11bp处碱基存在突变位点SNP15，为T/C突变；

SEQ ID NO.16所示分子标记的11bp处碱基存在突变位点SNP16，为C/G突变；

SEQ ID NO.17所示分子标记的11bp处碱基存在突变位点SNP17，为C/A突变；

SEQ ID NO.18所示分子标记的11bp处碱基存在突变位点SNP18，为A/T突变；

SEQ ID NO.19所示分子标记的11bp处碱基存在突变位点SNP19，为T/C突变。

进一步地，所述SNP1的基因型为AA、AG或GG；所述SNP2的基因型为CC、CT或TT；所述SNP3的基因型为CC、CT或TT；所述SNP4的基因型为AA、AT或TT；所述SNP5的基因型为CC、CT或TT；所述SNP6的基因型为AA、AG或GG；所述SNP7的基因型为GG、GA或AA；所述SNP8的基因型为GG、GA或AA；所述SNP9的基因型为GG、GA或AA；所述SNP10的基因型为TT、TC或CC；所述SNP11的基因型为TT、TC或CC；所述SNP12的基因型为AA、AG或GG；所述SNP13的基因型为CC、CT或TT；所述SNP14的基因型为AA、AC或CC；所述SNP15的基因型为TT、TC或CC；所述SNP16的基因型为CC、CG或GG；所述SNP17的基因型为CC、CA或AA；所述SNP18的基因型为AA、AT或TT；所述SNP19的基因型为TT、TC或CC。

本发明还提供一种鉴定天津猴鸡品种的引物对组合，所述引物对组合包括如下表所示的引物对1-19：

本发明还提供上述的SNP位点组合、分子标记组合或引物对组合在鉴定天津猴鸡品种中的应用。

本发明还提供上述的引物对组合在制备天津猴鸡品种鉴定试剂盒中的应用。

本发明还提供一种天津猴鸡品种鉴定试剂盒，包括上述的引物对组合。

本发明还提供一种鉴定天津猴鸡品种的方法，包括以下步骤：

(1)获取待测鸡个体的全基因组DNA，以所述全基因组DNA为模板，PCR扩增得到含有上述的SNP位点组合的基因片段组合；

(2)对所述基因片段组合进行测序，鉴定出所述SNP位点组合中各SNP位点的基因型；

(3)根据步骤(2)鉴定得出的基因型，以下列公式计算血缘评价总得分S：

其中，Ai为SNPi对应基因型的最终权重；i为大于0且小于20的整数；

所述Ai的值根据下表得出：

(4)当所述血缘评价总得分S>50时，所述待测鸡个体为天津猴鸡。

进一步地，所述PCR扩增采用上述的引物对组合。

进一步地，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性40s，57.2℃退火温度40s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃延伸10min。

本发明公开了以下技术效果：

本发明基于包括天津猴鸡在内的25个代表性中国地方鸡种和2个引进品种的大规模群体，鉴定特异性SNPs位点，筛选出鉴定天津猴鸡的分子标记，结合现有特异性SNP位点的检测方法和AHP层次分析法综合考虑特异性位点的等位基因频率和基因型类型，在确保鉴定准确性的同时，提高了检测效率和评价的科学性。本发明通过使用分子标记技术对天津猴鸡进行科学的品种特异性鉴定和评价，操作简单且结果可靠，可以为地方鸡遗传资源保护和合理利用提供科学依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为天津猴鸡及其他鸡种聚类图；

图2为AHP层次分析法进行权重计算流程图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1天津猴鸡SNP分子标记的筛选

1、血液样品采集

基于前期针对地方鸡(Gallusgallus)种的遗传进化研究，进一步根据不同鸡种的遗传背景选取25个地方鸡种和2个引进品种(元宝鸡和独龙鸡)作为研究对象。天津猴鸡等25个鸡种来源于国家级地方鸡种基因库(江苏)，每个品种公鸡10只、母鸡20只；元宝鸡样品来源于江苏省家禽科学研究所实验群体；独龙鸡序列来源于NCBI数据库(表1)；地方鸡种素材及2个引入品种主要来源于国家地方鸡种基因库(江苏)的纯种保种群体，确保不会出现杂交群体的干扰，如图1所示系统进化树上每一个品种个体可形成独立的分支。

对上述实验个体采用无菌翅静脉采血1mL，加入柠檬酸钠抗凝剂混匀，-80℃保存备用。

表1样品信息

2、DNA样品获取

常规酚-氯仿法提取所有品种基因组DNA。将获得的DNA进行质检，包括Nanodrop初步检测DNA样品浓度；电泳检测DNA的完整性，包括DNA有无降解，是否存在蛋白质和RNA等其他杂质污染；Qubit2.0对DNA样品进行准确定量，选取质量≥1μg的样品。将合格样品置于-80℃保存，以备建库测序使用。

3、简化基因组RAD-seq建库测序

抗凝血样提取DNA，对DNA质检合格的样品采用ddRAD建库方式构建长度范围在300～500bp的Pair-end文库，进行简化基因组RAD-seq测序，对测序得到的原始reads(双端序列)进行数据评估，得到各个样品的原始reads，将reads使用BWAMEM0.7.15软件比对到鸡参考基因组(GRCg6a，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/1375922358？report＝fasta)上。

4、数据质控

对原始测序数据进行质量控制，利用samtools程序对原始测序数据进行质量控制，对正确率99％的碱基数目比例(Q20)≥95％进行过滤；通过GATK软件进行SNP检测，双酶切基因组测序的覆盖深度≥60％，SNP在鸡群中单核苷酸多态性检出(Callrate)≥70％，最小等位基因频率(MAF)≥0.05；在此基础上，单个鸡种中SNP的检出率≥90％。

5、统计分析及位点筛选

使用Haploview4.1软件进行连锁不平衡(LD)分析；PopGene软件计算平均杂合度(Ho)、近交系数(Fis)和群体分化指数(Fst)；Admixture软件进行群体聚类分析，利用极大似然法(Maximum likelihood，ML)构建系统进化树(phylogenetic tree)，并使用Shimodaira-Hasegawa test方法判断每个节点的可信度；对经过质量控制后的SNP进行选择信号分析，通过PLINK1.9软件采用遗传分化系数(Fst)方法，以100kb为窗口，10kb为步长进行滑动进行检测，酶切效果不好的染色体片段或个体删除，不用做分析，确保等位基因频率计算准确。利用DAVID进行基因功能能富集分析并用R语言中ggplot2进行结果的可视化。

6、特异性位点筛选确定

通过统计分析和位点筛选确定19个特异性SNP位点。(见表2)

表2鉴定得到的特异性SNPs信息

注：上表中带有下划线的为单核苷酸多肽性突变位点。

7、天津猴鸡特异SNP性位点权重计算

建立特异性位点的层次结构模型(如图2所示)，并使用1～9标度法构造准则层两两比较矩阵(表3)，根据表3的结果，针对现有特异性位点检测效率较低和综合评价准确性较差的薄弱环节，充分考量等位基因频率和优势等位基因型，初始评分使用1～9标度法分级，分别对等位基因频率和优势等位基因型进行分级：

1代表两个位点相比，在等位基因频率或优势等位基因型上具有相同的重要性；

3代表两个位点相比，在等位基因频率或优势等位基因型上前者比后者稍重要；

5代表两个位点相比，在等位基因频率或优势等位基因型上前者比后者明显重要；

7代表两个位点相比，在等位基因频率或优势等位基因型上前者比后者极其重要；

9代表两个位点相比，在等位基因频率或优势等位基因型上前者比后者强烈重要；

2，4，6，8表示上述相邻判断的中间值。

表3构造准则层两两比较矩阵

采用AHP层次分析结果的方法对筛选到的种质特异性SNP位点进行加权评分。利用AHP层次分析法进行权重计算时，需要进行一致性检验分析，用于研究评价权重计算结果的一致性检验结果，即计算一致性指标组合信度(CR值)，具体如下：

第一：先描述上述计算得到的置信区间(CI值)[CI＝(最大特征根-n)/(n-1)]；

第二：结合判断矩阵阶数得到平均随机一致性指标(RI值)；

第三：计算CR值，并且进行一致性判断。

计算公式如下，其中CI为置信区间，λmax为最大特征根，n为对象特征数，A特征矩阵，W为A矩阵的均一化矩阵，公式如下：

结合特征向量(如表4)可计算出最大特征根，接着利用最大特征根值计算得到CI值，CI值在后面的一致性检验中使用。

表4AHP层次分析结果

注：其中基因型1为野生型纯合子，基因型2为杂合子，基因型3为突变型纯合子，缺失位点权重为0；i＝1，2，3…16。

根据表3计算的最终权重值，评价待测天津猴鸡个体的评分：

其中S为血源评价总得分，Ai为SNPi对应基因型的最终权重(见表4)；i＝1，2，3…16。

实施例2天津猴鸡分子标记的应用

1、天津猴鸡保种群个体血液采集

使用医用一次性注射器随机采集天津猴鸡及近缘鸡种(极端鸡种对比，非近缘鸡种较易鉴别区分)公、母鸡翅静脉全血1.0mL，每个鸡种以5只为例，采集后迅速注入含有2μL0.5mol/L EDTA-2Na抗凝剂的无酶管中，然后将无酶管置于4℃环境下保存备用。

2、DNA提取和质量检测

常温下吸出无酶管中保存备用的公、母鸡个体血液0.2mL，采用常规动物外周血苯-酚抽提法提取个体血液DNA；琼脂糖凝胶电泳分析DNA完整度，分光光度计检测DNA的纯度；将合格样品置于-80℃保存，以备SNP检测使用。

3、天津猴鸡品种特异性基因的SNP标记检测

引物设计：对筛选得到的天津猴鸡品种特性基因的SNP位点在参考基因组中进行染色体定位，获得包含这些SNPs位点的一段序列。利用鸡基因组DNA作为模板，使用Oligo等软件设计引物(见表5)进行PCR扩增。

PCR扩增和检测：

PCR扩增总体积为20μL：1μLDNA模板，其浓度为100ng/μL；2μL10×PCRBuffer；1.5μLdNTP，浓度为10mmol/L；上下游引物各1μL，浓度为10pmol/μL；Taq酶为0.2μL，浓度为5U/μL；ddH₂O13.3μL。

PCR扩增程序：95℃预变性5min；94℃变性40s，57.2℃退火温度40s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存备用；送测。

表5PCR扩增引物序列

4、天津猴鸡品种鉴定

天津猴鸡与近缘鸡种基因型鉴定结果见表6。

表6天津猴鸡与近缘鸡种基因型鉴定

5、天津猴鸡鸡个体鉴定评价和T检验，结果如下表7所示。

表7天津猴鸡鸡个体鉴定评价和T检验

注：**标示差异极显，P<0.01。

表7结果显示：利用本发明筛选的分子标记可高效、准确评价天津猴鸡个体的血缘纯度，实现品种鉴定，当血缘评价总得分S>50时，即可判定待测鸡个体为天津猴鸡。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种鉴定天津猴鸡品种的SNP位点组合，其特征在于，包括下表所示的SNP位点：

SNP编号染色体 SNP位置野生型突变型 SNP1 1 15489955 A G SNP2 1 147664085 C T SNP3 2 5827124 C T SNP4 2 63190025 A T SNP5 2 63743100 C T SNP6 2 137709694 A G SNP7 2 63324454 G A SNP8 2 63324312 G A SNP9 3 27703538 G A SNP10 3 419581 T C SNP11 3 16722114 T C SNP12 3 96077689 A G SNP13 5 52536888 C T SNP14 5 53123820 A C SNP15 6 4815477 T C SNP16 6 6106395 C G SNP17 7 18150879 C A SNP18 10 13186500 A T SNP19 13 3747754 T C

。

2.一种鉴定天津猴鸡品种的分子标记组合，其特征在于，所述分子标记组合包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-19所示的分子标记；

3.根据权利要求2所述的分子标记组合，其特征在于，所述SNP1的基因型为AA、AG或GG；所述SNP2的基因型为CC、CT或TT；所述SNP3的基因型为CC、CT或TT；所述SNP4的基因型为AA、AT或TT；所述SNP5的基因型为CC、CT或TT；所述SNP6的基因型为AA、AG或GG；所述SNP7的基因型为GG、GA或AA；所述SNP8的基因型为GG、GA或AA；所述SNP9的基因型为GG、GA或AA；所述SNP10的基因型为TT、TC或CC；所述SNP11的基因型为TT、TC或CC；所述SNP12的基因型为AA、AG或GG；所述SNP13的基因型为CC、CT或TT；所述SNP14的基因型为AA、AC或CC；所述SNP15的基因型为TT、TC或CC；所述SNP16的基因型为CC、CG或GG；所述SNP17的基因型为CC、CA或AA；所述SNP18的基因型为AA、AT或TT；所述SNP19的基因型为TT、TC或CC。

4.一种鉴定天津猴鸡品种的引物对组合，其特征在于，所述引物对组合包括如下表所示的引物对1-19：

5.一种如权利要求1所述的SNP位点组合、如权利要求2或3所述的分子标记组合或如权利要求4所述的引物对组合在鉴定天津猴鸡品种中的应用。

6.一种如权利要求4所述的引物对组合在制备天津猴鸡品种鉴定试剂盒中的应用。

7.一种天津猴鸡品种鉴定试剂盒，其特征在于，包括权利要求4所述的引物对组合。

8.一种鉴定天津猴鸡品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获取待测鸡个体的全基因组DNA，以所述全基因组DNA为模板，PCR扩增得到含有权利要求1所述的SNP位点组合的基因片段组合；

(2)对所述基因片段组合进行测序，鉴定出权利要求1所述SNP位点组合中各SNP位点的基因型；

所述Ai的值根据下表得出：

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增采用如权利要求4所述的引物对组合。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性40s，57.2℃退火温度40s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃延伸10min。