CN116179714A - 一种与鸡屠宰和肉质性状相关的分子标记及优质、屠宰加工型新品系选育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与鸡屠宰和肉质性状相关的分子标记及优质、屠宰加工型新品系选育方法，同时提供了检测该SNP分子标记的试剂盒，还提供了一种利用这两个SNP位点筛选优质鸡品系的方法。本发明中，所述分子标记包括rs312715211，其含有肉鸡27号染色体上第6，017，027bp处多态性为T/A的核苷酸序列；rs315349829，其含有肉鸡18号染色体上第4，910，969bp处多态性为G/A的核苷酸序列。该发明通过降低肉鸡屠宰后的腹脂率，提高全净膛重以及鸡肉C14:0含量进而提升肉鸡屠宰性状和鸡肉品质，加快肉鸡遗传改良进展。本发明试剂盒操作简单，灵敏度高，准确性强，检测成本低，具有重要应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种与鸡屠宰和肉质性状相关的分子标记及优质、屠宰加工型新品系选育方法。
背景技术
鸡是当今世界上饲养最普遍的家禽，鸡肉以风味独特、营养丰富、高蛋白、低脂肪等诸多特点成为世界上最受欢迎的肉制品之一。目前，鸡肉作为人类食品的主要来源，对其屠宰性状及肉品质的研究已成为当前热点。而且近些年冰鲜鸡取代活鸡也逐渐被推广。冰鲜鸡是指屠宰后的活鸡胴体在严格执行检疫制度和无公害管理程序后，迅速进行冷却处理，胴体温度在2h内降至0～4℃范围内的鲜鸡肉。市场的转化，让生产者更关注肉鸡屠宰性状和鸡肉的品质。因此，提升屠宰性状和鸡肉中肌内脂肪含量是家禽的育种目标。
肉鸡的屠宰性状是活重，全净膛重，腹脂重，腹脂率等，提升肌内脂肪的主要手段是增加脂肪酸含量，而肉豆蔻酸C14:0含量对鸡肉重要风味前体脂肪酸C16:1具有重要的作用。肉鸡的屠宰性状属于中高遗传力，其中全净膛重遗传力为0.668，腹脂率遗传力为0.71；C14:0含量性状的遗传力为中等，约为0.4-0.5。这为畜禽屠宰性状和肉质的遗传选育提供了理论支撑。
由于鸡屠宰性状和肉质含量的复杂性，传统的选育方法在实施上具有一定的难度，因此通过分子标记手段从遗传上可同时对肉鸡的屠宰性状和肉质进行选择，达到选育优质、屠宰加工型品系的效果。全基因组关联分析是鉴定表型和基因型之间遗传联系的最主要手段之一。为鉴定表型和基因型之间的遗传关系，便于对屠宰性状和肉质进行早期选择，节省生产成本并加快遗传进展，更好地服务于鸡的育种。因此，研究鸡屠宰和肉质性状相关的分子标记以及选育优质、屠宰加工型新品系的方法具有重要意义。
发明内容
本发明为了准确地确定待测鸡的基因型以方便同时对屠宰性状和肉质进行早期选择，节省生产成本并加快遗传进展，提供了一种与鸡屠宰和肉质性状相关的分子标记及优质、屠宰加工型新品系选育方法。
一种与鸡屠宰和肉质性状相关的分子标记及优质、屠宰加工型新品系选育方法，所述2个SNP(单核苷酸多态性)分子标记位于27号染色体第6，017，027位置，rs312715211；位于18号染色体第4，910，969位，rs315349829。
上述应用中，当rs312715211位点为TT基因型时个体具有较低的腹脂率和较高的全净膛重，rs315349829位点表现为GG基因型时个体具有较高的C14:0含量和全净膛重，以及同时表现为TTGG基因型的个体具有较低的腹脂率，较高的全净膛重和鸡肉C14：0含量。
本发明还提供用于扩增rs312715211和rs315349829分子标记的引物。其序列如SEQ ID NO:1-4所示。
rs312715211
上游引物：AAACCTGTTCATGAGCCTGC(SEQ ID NO.1)
下游引物：CAACCATCTCCCACACAGTG(SEQ ID NO.2)
rs315349829
上游引物：GAAGGTTTTACACCACAGGC(SEQ ID NO.3)
下游引物：GTTCTGCCTTCCTCTGTGGT(SEQ ID NO.4)
本发明提供了上述SNP分子标记在检测肉鸡屠宰性状和肉质中的应用。
本发明还提供一种用于同时检测鸡肉鸡屠宰性状和肉质的试剂盒，包括上述的引物。
本发明还提供一种同时检测肉鸡屠宰性状和肉质的方法，检测待测样本鸡中如上述的分子标记的基因型。
一种与鸡屠宰和肉质性状相关的分子标记及优质、屠宰加工型新品系选育方法，为根据上述SNP位点的基因型对鸡上述性状进行早期选择，包括如下步骤：
(1)提取待测鸡的基因组DNA；
(2)利用上述的引物进行PCR扩增，检测待测鸡27号染色体第6，017，027位SNP位点的基因型和18号染色体第4，910，969位SNP位点的基因型；
(3)将所述扩增产物经测序后，获取分子标记的基因型；
(4)根据基因分型结果，判断所述待测样本鸡的屠宰性状和肉质。
步骤(1)中所述提取待测鸡的基因组DNA的方法为：对待测鸡进行鸡翅静脉采血，用抗凝剂进行抗凝处理后经裂解、蛋白酶消化处理，然后采用酚仿法提取基因组DNA，以ddH2O溶解。
步骤(2)中PCR方法的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火34s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min。
步骤(2)中所述PCR扩增的扩增体系包括：DNA 1μL，2xTaqMasterMix 10μL，上下游引物各1μL，ddH2O 7μL。
本发明公开了以下有益效果：
鸡本发明为了解决同时选择肉鸡屠宰性状和肉品质这一难题，提供一种与鸡屠宰和肉质性状相关的分子标记及优质、屠宰加工型新品系选育方法，该分子标记位于鸡27号染色体第6，017，027位和18号染色体第4，910，969位，通过研究发现，当rs312715211位点为TT基因型时个体具有较低的腹脂率和较高的全净膛重，rs315349829位点表现为GG基因型时个体具有较高的C14:0含量和全净膛重，以及同时表现为TTGG基因型的个体具有较低的腹脂率，较高的全净膛重和鸡肉C14：0含量。这为鸡屠宰性状和肉品质进行早期选择提供了理论基础和参考数据。
附图说明
图1为京星黄鸡在27号染色体上关于腹脂率的全基因组关联分析(GWAS)曼哈顿图；横坐标表示为鸡的染色体编号；纵坐标表示为SNP位点的-logP值。
图2为京星黄鸡在18号染色体上关于肉豆蔻酸C14:0的全基因组关联分析(GWAS)曼哈顿图；横坐标表示为鸡的染色体编号；纵坐标表示为SNP位点的-logP值。
图3为rs312715211、rs315349829纯合基因型鉴定。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
DNA全基因组重测序
一、SNP分子标记的检测
(1)动物群体
本发明使用来自于第十六世代鸡IMF选择系(n＝256)和对照系(n＝264)群体，共计520只母鸡。IMF选择系和对照系群体源于同一个基础群(京星黄鸡，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所)，自2000年起以IMF性状为主选性状进行定向选育。与对照系相比，选育后可使IMF选择系群体的IMF含量显著提高(P<0.001)，腹脂重，全净膛重等性状也显著提高。饲养过程中采用自由采食和饮水，日粮参考黄羽肉鸡饲养标准(NY/T33-2004)。
(2)DNA提取与表型测定
用采血管收集所有试验鸡的翅静脉血0.5mL，使用标准的苯酚-氯仿发提取全基因组DNA，经NanoPhotometer核酸蛋白检测仪准确测定DNA样品的浓度和纯度(OD值：OD260/280、OD260/230)；检测合格的DNA样品，使用2％琼脂糖凝胶进行电泳，检测DNA样品的纯度和完整性。
所有待测鸡于98日龄屠宰。采集520个个体的胸肌组织样品，并使用绞肉机将每只个体的胸肌组织搅碎混匀。每只个体取20克胸肌样品经冷冻干燥处理后，使用高效气相色谱法(GC)测定每只个体胸肌的脂肪酸组成。并对体重、腹脂重、全净膛重等表型进行测量。腹脂率(AFP)公式为：腹脂率＝腹脂重/(全净膛重+腹脂重)*100％。
(3)腹脂率全基因组SNP关联分析
所有待测鸡的DNA样品送到北京博奥公司进行全基因组重测序检测，共得到17，915，382个SNP位点。在GWAS模型中对批次效应，群体结构进行了校正固定。本研究利用GEMMA软件，将质控后的472个个体(选择系，n＝217；对照系，n＝255)以及8，940，029个SNPs用于腹部脂肪性状的GWAS分析。经Bonferroni多重检验校正和去掉LD连锁后得到基因组显著性阈值为-log10(0.05/378，446＝6.879，建议性阈值为-log10(1/378，446)＝5.578。
GWAS分析结果如图1所示，腹脂率与27号染色体上0.13Mb的区域(Chr 27:5953371-6079471)存在显著关联，进一步对基因组关联区域所有位点进行验证，最终锁定了rs312715211位点作为候选位点，该位点突变后可以增加全净膛重，降低腹脂率。
(4)鸡肉中脂肪酸C14:0含量相关SNP标记的确定
对上述重测的数据利用GEMMA软件，将质控后的516个个体(选择系，n＝252；对照系，n＝264)以及9，614，883个SNPs用于C14:0含量性状的GWAS分析。经Bonferroni多重检验校正后得到基因组显著性阈值为-log10(0.05/9，614，458)＝8.28，建议性阈值为-log10(1/9，614，458)＝6.98。
GWAS分析结果如图2所示，胸肌C14:0含量与18号染色体上1.151Mb的区域(chr18:4，607，668-5，758，791)存在显著关联，结合上述腹脂率的结果，最终锁定rs315349829位点作为候选位点，该位点GG型具有高C14:0含量。
实施例2.rs312715211和rs315349829基因型与鸡腹脂重性状的相关性
(1)表型优势基因型确定
使用与实施例1中GWAS分析相同的动物群体(第十六世代鸡IMF选择系，n＝252；和对照系，n＝264)，采用R 4.0.4软件ggpubr包对表型进行计算。
在京星黄鸡群体中(表1和表2)，rs312715211位点TT基因型比TA型和AA型具有低腹脂率和高全净膛重；rs315349829位点表现GG基因型时个体比GA和AA具有高C14:0含量和全净膛重；另外，同时携带rs312715211位点的TT型和rs315349829位点的GG型个体具有低腹脂率，高全净膛重和C14：0含量，说明TTGG型对同时筛选屠体性状和鸡肉品质有利。
表1rs312715211、rs315349829位点基因型之间表型比较
表2京星黄鸡TTGG和AAAA基因型个体之间屠宰性状和肉质含量比较
实施例3.位点rs312715211、rs315349829分子标记检测方法建立及其在育种中的应用
(1)分子标记方法建立
引物设计
根据Ensemble网站(6.0版本)提供的鸡27号和18号染色体DNA序列，利用NCBI引物设计软件设计扩增rs312715211、rs3153498298的各1对特异性引物，引物由北京华大基因公司合成。引物的DNA序列如下所示：
rs312715211
上游引物：AAACCTGTTCATGAGCCTGC(SEQ ID NO.1)
下游引物：CAACCATCTCCCACACAGTG(SEQ ID NO.2)
rs315349829
上游引物：GAAGGTTTTACACCACAGGC(SEQ ID NO.3)
下游引物：GTTCTGCCTTCCTCTGTGGT(SEQ ID NO.4)
PCR反应程序优化
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火34s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min。PCR反应体系以20μl计为：血液DNA 1μl，2×TaqMasterMix 10μl，上、下游引物各1μl，ddH2O7μl。
DNA序列鉴定采用直接测序法，由北京华大基因公司进行。每个PCR扩增片段测序执行正向测序。所测得的PCR产物序列与NCBI基因组序列比对，确认扩增序列的真实性；同时，确认对应SNP位点的突变。PCR扩增产物测序结果显示rs312715211、rs315349829位点的不同等位基因如图3所示。
(2)利用本发明SNP分子标记进行辅助选择优质、屠宰加工型新品系选育方法
选择京星黄鸡为选育对象，随机挑选1000只个体作为待测群体，公母比例1:1。记为F0代。
所有个体于30日龄左右翅静脉采血，加入ACD抗凝剂，-20℃保存备用。采用常规酚仿法提取基因组DNA ，溶于ddH2O中，用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法双重检测DNA的纯度和浓度，然后稀释至浓度50ng/μl。
采用上述2个SNP的特异性引物进行PCR扩增反应；采用直接测序法对rs312715211、rs315349829位点基因型进行分型；根据基因分型结果选留TTGG或AAAA基因型的健康公、母鸡。
每个基因型公鸡不低于30只，公、母比例不低于1:3的数量留种。记录每只鸡的编号建立系谱，产蛋高峰期按照公鸡半同胞、母鸡全同胞家系的方法组建TTGG基因型个体或AAAA基因型个体的纯系，记为F1代。
对于TTGG基因型个体或AAAA基因型个体的纯系，每个家系至少随机选择1只后代母鸡个体，合计每个纯系屠宰50只，记为F2代。所有选择的100只个体均于98日龄屠宰，采集称量体重，全净膛重，腹脂重，采集胸肌，使用高效气相色谱法(GC)测定胸肌脂肪酸含量。统计选育后TTGG基因型或AAAA基因型的屠宰性状重量和鸡肉C14:0含量。
本发明通过提供鸡rs312715211、rs315349829的GWAS分析获得、突变位点的检测、以及在屠宰加工型新品系选育的应用等方法，目前市面上都是屠宰型或者加工型的肉鸡品系，而我们通过对上述的分子标记进行选育，携带优势基因型的肉鸡，在肉质和屠体性状上具有一定优势，既可适用于整鸡冰鲜上市，也可适用于分割上市，达到屠体和肉质同时选育提高的效果，提高经济价值的同时为鸡屠宰和肉质性状相关的分子标记辅助选择及在优质、屠宰加工型新品系选育上提供了基础。
以上所述的实施例仅是对本发明的技术方案进行描述，非对本发明保护范围的限制，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围。
Claims (10)
1.一种与鸡屠宰性状和肉质性状相关的SNP分子标记，所述的SNP分子标记包括rs312715211和rs315349829，对以上两个分子标记进行同时选择，可选育优质屠宰加工型肉鸡，所述屠宰性状指全净膛重和腹脂率，其中，rs312715211的序列为AACGTGCTTTTTTGCCTTGTA/TAAACTTGGCGTGGCGTTGCC(SEQ ID NO.5)
根据对应于NCBI中公布的鸡参考基因组Gallus_gallus-6.0版本序列信息27号染色体第6，017，027位SNP位点的基因型对屠宰性状进行早期选择；SNP位点处碱基为T或A，基因型为TT、TA、AA；TT基因型腹脂率低于TA型和AA基因型，TT基因型的全净膛重高于AA和TA型；
rs315349829的序列为GTAACAACGATAAGTAACACA/GGCGATAACACTGGGATCCCG(SEQ IDNO.6)，根据对应于NCBI中公布的鸡参考基因组Gallus_gallus-6.0版本序列信息18号染色体第4，910，969位SNP位点的基因型对鸡肉C14:0含量进行早期选择；SNP位点处碱基为G或A，基因型为GG、GA、AA；GG基因型C14:0含量高于GA型和AA基因型。
2.一种用于检测权利要求1所述SNP分子标记的引物对，其特征在于，针对rs312715211的引物序列为
上游引物：AAACCTGTTCATGAGCCTGC(SEQ ID NO.1)
下游引物：CAACCATCTCCCACACAGTG(SEQ ID NO.2)
针对rs315349829的引物序列为
上游引物：GAAGGTTTTACACCACAGGC(SEQ ID NO.3)
下游引物：GTTCTGCCTTCCTCTGTGGT(SEQ ID NO.4)。
3.一种检测权利要求1所述SNP分子标记的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测鸡的基因组DNA；
(2)利用权利要求2所述的引物对，以所述待测鸡DNA为模板，对rs312715211和rs315349829位点的核苷酸进行PCR检测；
(3)直接测序法对获得的PCR扩增产物进行等位基因测序；
(4)基于测序结果，确定待测鸡上述SNP分子标记的基因型，进行留种、繁种。
4.根据权利要求3所述的方法，其中经由测序、使用等位基因特异性微阵列的杂交测定法、等位基因特异性PCR、毛细管电泳、单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、修改的HLPC、质谱术、限制片段长度多态性(RFLP)、或TaqManSNP基因型分型测定法实施所述鉴定多核苷酸的基因型。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述提取待测鸡的基因组DNA的方法为：对待测鸡进行鸡翅静脉采血，用抗凝剂进行抗凝处理后经裂解、蛋白酶消化处理，然后采用酚仿法提取基因组DNA，以ddH2O溶解。
6.一种用于检测权利要求1所述SNP分子标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有权利要求2所述引物对。
7.权利要求1所述SNP分子标记在鉴定鸡屠宰性状和肉质相关基因型并在优质鸡育种中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，所述屠宰性状指全净膛重和腹脂率。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，检测鸡国际参考基因组6.0版本27号染色体上chr27:6017027和18号染色体上chr18:4910969的基因型，表明携带chr27:6017027位点的TT基因型个体具有较低的腹脂率和较高的全净膛重，chr18:4910969位点GG基因型的个体具有较高的C14:0含量和全净膛重，以及同时携带TTGG基因型的个体具有较低的腹脂率，较高的全净膛重和鸡肉C14：0含量，对TTGG基因型进行选育，同时获得优质鸡肉品质和屠宰加工型肉鸡。
10.一种权利要求1所述的SNP分子标记、权利要求2所述的引物、权利要求6所述的试剂盒在鸡育种中的应用。
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