CN117568484A - 与肉鸡屠宰性状相关的分子标记及生长高效肉鸡品系的选育方法 - Google Patents
与肉鸡屠宰性状相关的分子标记及生长高效肉鸡品系的选育方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种与肉鸡屠宰性状相关的分子标记及生长高效肉鸡品系的选育方法，为了提高肉鸡屠宰性状，本发明提供一种与肉鸡屠宰性状相关的分子标记及生长高效新品系选育方法，该分子标记位于鸡8号染色体第7395009bp处，研究发现，当rs315435578位点为CC基因型时个体具高全净膛率、高半净膛率，从而为鸡屠宰性状和肉品质进行早期选育提供了理论基础和参考数据。本发明提供的检测该分子标记的试剂盒，操作简单，灵敏度高，准确性强，检测成本低，具有重要应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体地说，涉及与肉鸡屠宰性状相关的分子标记及生长高效肉鸡品系的选育方法。
背景技术
屠宰性状是动物遗传选育中重要的表型性状，与重要经济性状有着密切的关系，其中，鸡的全净膛重、半净膛重是重要的肉用性能指标，在遗传选育过程中也具有重要作用。半净膛重是屠体去除内脏，仅保留心、肝、腺胃和肌胃(除内容物及角质膜)、腹脂后的重量，半净膛率＝半净膛重/宰前活重×100％；全净膛重是半净膛去除心、肝、腺胃、肌胃、腹脂、头(第一颈椎连接处截下)、脚(跗关节处分割)的重量，全净膛率＝全净膛重/宰前活重×100％。净膛率越高，则说明去除各类杂物后占食用部分的比例越高，鸡肉的产量相对也会更高，对于鸡肉加工和销售来说也具有重要的价值。因此，对于生产商和消费者来说，了解鸡屠宰性状的半净膛率和全净膛率是非常重要的，可以帮助生产商了解其生产效率，提高肉类的品质和产量，同时也能够提高消费者对于食品的安全和信心。
在早期关于复杂表型的研究中，主要利用QTL定位(QTL mapping)来寻找表型变异和基因组变异之间的关联。自20世纪90年代，QTL的连锁分析法广泛应用于鸡生长、胴体、肉质等性状的研究中。虽然该方法是一种经典的基因定位方法，但其更适用于单基因疾病或单基因控制性状的遗传研究，所以其对于复杂疾病和遗传力低的性状，检测效果有限，获得的QTL置信区间较大，可能包括数以百计的基因，不利于后续功能基因的精准定位，同时，在不同群体中的可重复性较差。相比QTL连锁分析的方法，全基因组关联分析(Genome-wideassociation studies,GWAS)具有从整个基因组水平检测SNP和整体分析关联性的特点，不再是单一的考虑个别SNP的关联性，具有结果更加可靠等优点。GWAS是应用基因组中数以百万计的单核苷酸多态性(SNP)为分子遗传标记，进行全基因组水平上的对照分析或相关性分析，通过比较发现影响复杂性状的基因变异的一种新策略，目前已经成为畜禽目的性状精细定位强有效的方法之一。
基因型填充方法是基于单倍型构建原理，利用参考群体(Reference population)的全基因组基因型信息对目标群体(Target population)基因型缺失位点的信息进行推断。该方法广泛运用于GWAS研究中，增加标记密度可在一定程度上提高检验效能，并且鉴定到多个与家畜生产性状显著关联的位点。
发明内容
本发明的目的是提供一种与肉鸡屠宰性状相关的分子标记及生长高效肉鸡品系的选育方法。
本发明构思如下：选用肉鸡配套系终端父系(E系)作为素材，基于基因型填充技术，鉴定全净膛率、半净膛率相关的位点rs14638292、rs14638299、rs14638318、rs317194432、rs315435578及基因TNR，提供一种生长高效肉鸡新品系选育方法。金陵花鸡是由广西金陵农牧有限公司培育的快大型黄羽肉鸡，目前已被纳入广西地方鸡种基因库，成为广西地区应对市场需求和保护本土鸡种资源的重点品种之一。通过连锁不平衡分析(LD)发现，rs14638292、rs14638299、rs14638318、rs317194432、rs315435578位于一个连锁区域内，且rs315435578定位到TNR基因(Gene ID：7143)。TNR基因是家禽的一个体型性状基因，它会影响鸡的生长速度、体型和肉质品质。正常表达的TNR基因在鸡的生长过程中发挥重要作用，能够提高鸡的生长速度和体重，并最终影响鸡肉的产量和质量。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种与肉鸡屠宰性状相关的分子标记，所述分子标记含有鸡如SEQ ID NO：1所示序列第21bp处的多态性为T/C的核苷酸序列。所述分子标记位于鸡参考基因组6.0版本8号染色体第7395009bp处。
进一步地，所述分子标记所含多态性位点的基因型为CC，对应于具有高全净膛率、高半净膛率的生长高效肉鸡个体。
第二方面，本发明提供用于扩增所述分子标记的引物对，所述引物对的序列如SEQID NO：2-3所示。
第三方面，本发明提供含有所述引物对的检测试剂或试剂盒。
第四方面，本发明提供一种生长高效肉鸡品系的鉴定及选育方法，包括以下步骤：
(1)提取待测鸡的基因组DNA；
(2)以待测鸡DNA为模板，利用SEQ ID NO：2-3所示引物对，进行PCR扩增；
(3)分析PCR扩增产物。
进一步地，步骤(2)中所述PCR扩增的扩增体系包括：DNA 1μL，2×TaqMasterMix10μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，ddH2O 7μL。
步骤(2)中PCR方法的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火34s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min。
进一步地，步骤(3)采用直接测序法对获得的PCR扩增产物进行等位基因测序，根据测序结果判定如下：若鸡参考基因组6.0版本8号染色体第7395009bp对应的多态性位点的基因型为CC，判定待测鸡为具有高全净膛率、高半净膛率的生长高效肉鸡个体。
进一步地，步骤(1)中所述提取待测鸡的基因组DNA的方法为：对待测鸡进行鸡翅静脉采血，用抗凝剂进行抗凝处理后经裂解、蛋白酶消化处理，然后采用酚仿法提取基因组DNA，以ddH2O溶解。
第五方面，本发明提供所述分子标记、所述引物对或所述检测试剂或试剂盒的以下任一应用：
(1)用于鉴定肉鸡屠宰性状相关基因TNR的基因型；
(2)用于具有高全净膛率、高半净膛率的生长高效肉鸡品系的早期预测、鉴定及改良；
(3)用于鸡的分子标记辅助育种；
(4)用于制备鸡育种芯片。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
为了提高肉鸡屠宰性状，本发明提供一种与肉鸡屠宰性状相关的分子标记及生长高效新品系选育方法，该分子标记位于鸡8号染色体第7395009bp处，研究发现，当rs315435578位点为CC基因型时个体具高全净膛率、高半净膛率，从而为鸡屠宰性状和肉品质进行早期选育提供了理论基础和参考数据。
本发明提供的检测该分子标记的试剂盒，操作简单，灵敏度高，准确性强，检测成本低，具有重要应用价值。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中肉鸡在8号染色体上关于全净膛率、半净膛率的全基因组关联分析(GWAS)曼哈顿图(Manhattan plot)和Q-Q图(Quantile-quantile plot)；左侧曼哈顿图X轴的1～27表示1～27号染色体，图中红色虚线代表全基因组水平潜在显著阈值线(-log10(1/558635)＝5.747×10-6)，黑色虚线代表显著阈值线(-log10(0.05/558635)＝7.048×10-6)，高于阈值时，认为该SNP位点与该性状显著相关。右侧Q-Q图表示实际观测值与期望值的拟合程度。其中，a为基因型填充半净膛率，b为基因型填充全净膛率。
图2为本发明较佳实施例中5个SNPs连锁不平衡分析结果。方格中的数字为D’，表示连锁不平衡的程度；方格颜色越深，表明SNPs之间的连锁不平衡程度越强。
图3为本发明较佳实施例中基因注释结果。
具体实施方式
为了准确地确定待测肉鸡的基因型以方便同时对半净膛率、全净膛率性状进行早期选择，节省生产成本并加快遗传进展，本发明提供一种与肉鸡屠宰性状相关的分子标记及生长高效新品系选育方法。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种与肉鸡屠宰性状相关的分子标记，所述屠宰性状包括全净膛率和半净膛率，所述分子标记包括rs14638292、rs14638299、rs14638318、rs317194432、rs315435578，5个SNPs位于一个连锁区域内，存在于同一区块内的位点均显著，且作用相同，因此可以对rs315435578分子标记进行选择，选育生长高效肉鸡。
所述SNP分子标记序列为5′-CCCTGGCACCACGTCTCCATNGCAGGCACCTCTTTTTTGTT-3′(SEQ ID NO:1，其中，N为T或C)，根据对应于NCBI中公布的鸡参考基因组Gallus_gallus-6.0版本序列信息8号染色体第7395009位SNP位点；所述SNP位点(rs315435578位点)处碱基为T或C，基因型为TT、TC、CC；基因型为CC或TC的个体的全净膛率、半净膛率显著高于TT基因型。
本发明还提供用于扩增rs315435578分子标记的引物对，引物序列如下(5′-3′)：
上游引物：TTTGCGGTACAAATCGAGCC(SEQ ID NO：2)
下游引物：TCACCAGGTGCATGGTAAGG(SEQ ID NO：3)
本发明提供了上述SNP分子标记在检测肉鸡屠宰性状中的应用。
本发明还提供一种用于同时检测肉鸡屠宰性状的试剂盒，包括上述的引物。
本发明还提供一种同时检测肉鸡屠宰性状的方法，检测待测样本鸡中如上述的分子标记的基因型。
本发明还提供一种与肉鸡屠宰性状相关的分子标记及生长高效新品系选育方法，为根据上述SNP位点的基因型对肉鸡上述性状进行早期选择，包括如下步骤：
(1)提取待测鸡的基因组DNA；
(2)利用上述的引物进行PCR扩增，检测待测鸡8号染色体第7395009bp处SNP位点的基因型；
(3)将所述扩增产物经测序后，获取分子标记的基因型；
(4)根据基因分型结果，判断所述待测样本鸡的屠宰性状。通过确定待测鸡上述SNP标记的基因型，进行留种、繁种。
步骤(1)中所述提取待测鸡的基因组DNA的方法为：对待测鸡进行鸡翅静脉采血，用抗凝剂进行抗凝处理后经裂解、蛋白酶消化处理，然后采用酚仿法提取基因组DNA，以ddH2O溶解。
步骤(2)中PCR方法的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火34s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min。
步骤(2)中所述PCR扩增的扩增体系包括：DNA 1μL，2×TaqMasterMix 10μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，ddH2O 7μL。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning：a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1DNA全基因组重测序
SNP分子标记的检测，具体方法如下：
(1)动物群体
研究群体来自广西金陵农牧集团有限公司家禽育种公司金陵花鸡配套系终端父系E系第1至第4世代共1914只公鸡个体，饲养过程中采用自由采食和饮水，日粮参考黄羽肉鸡饲养标准(NY/T33-2004)。
(2)DNA提取与表型测定
用采血管收集所有试验鸡的翅静脉血0.5mL，使用标准的苯酚-氯仿发提取全基因组DNA，经NanoPhotometer核酸蛋白检测仪准确测定DNA样品的浓度和纯度(OD值：OD260/280、OD260/230)；检测合格的DNA样品，使用2％琼脂糖凝胶进行电泳，检测DNA样品的纯度和完整性。
所有待测鸡于56日龄屠宰。采集1914只个体样品，对宰前活重、屠体重、全净膛重、半净膛重等表型进行测量，并计算全净膛率、半净膛率。
基于“京芯一号”鸡55K SNP芯片检测基因型。使用PLINK(V1.9)软件对SNP进行质量控制，具体过程为：个体基因型检出率≥90％，单个SNP检出率≥90％，最小等位基因频率≥95％，哈代－温伯格平衡检验P≥1×10-6，共有1914只个体和37589个SNPs通过质控。4世代273只个体的DNA样品送至北京康普森农业科技有限公司进行深度为10×的全基因组重测序，参考序列版本为Gallus gallus 6.0(GRCg6a)。将1914只鸡的55K SNP芯片数据作为目标数据集，将273只重测个体的SNPs数据集作为参考数据集，利用Beagle 5.0软件[15]进行基因型填充。经最后综合基因型准确度和SNP的分布密度，经过位点检出率≥0.9、最小等位基因频率(Minimum allele frequency,MAF)≥0.05和个体检出率≥0.9的质控后，共得到7656336个SNPs。用于后续研究。基因型填充55K SNP芯片利用Bonferroni校正多重检验确定显著性阈值为-log10(0.05/558635)＝7.048，全基因组水平潜在显著阈值为-log10(1/558635)＝5.747。
GWAS分析结果如图1所示，全净膛率半净膛率性状与8号染色体上73Mb的区域存在显著关联，进一步对基因组关联区域所有位点进行验证，最终锁定了rs315435578位点作为候选位点，该位点突变后可以增加全净膛率和半净膛率。
实施例2 rs315435578基因型与鸡屠宰性状的相关性
表型优势基因型确定，具体方法如下：
使用与实施例1中GWAS分析的动物群体，采用R 4.0.4软件ggpubr包对表型进行计算。
在肉鸡群体中(表1)，rs315435578位点CC基因型比TT型具有高全净膛率、高半净膛率，表2为表型数据描述性统计。
表1 rs315435578位点基因型之间表型比较
| 基因型频率 | 半净膛率(％) | 全净膛率(％) | |
| CC | 31.17％ | 85.96±1.65 | 80.43±2.17 |
| TC | 49.53％ | 85.78±1.65 | 80.23±2.17 |
| TT | 19.20％ | 85.44±1.65 | 79.85±2.16 |
表2 表型数据描述性统计(N＝1914)
实施例3位点rs14638292、rs14638299、rs14638318、rs317194432、rs315435578分子标记在其他群体中的验证
通过比较上述5个SNP位点，在98日龄京星黄鸡群体(n＝520)中发现，rs317194432位点与本发明素材群体表现一致，TT基因型的平均全净膛率为84.67％，明显高于AA基因型的平均83.17％(P<0.05)。且5个SNPs在京星黄鸡群体中做连锁不平衡分析，发现在一个连锁区域内。5个SNPs连锁不平衡分析结果见图2。
除rs315435578外，其他4个位点可起到相同作用。但因该选择位点可以定位到TNR基因，在群体中更易于挖掘和改良。所以在京星黄鸡群体中也可使用rs315435578作为分子标进行生长高效品系的选育。
实施例4位点rs315435578分子标记检测方法建立及其在育种中的应用
(1)分子标记方法的建立
引物设计：根据Ensemble网站(6.0版本)提供的鸡8号染色体DNA序列，利用NCBI引物设计软件设计扩增rs315435578的1对特异性引物，引物由北京华大基因公司合成。引物序列如下(5′-3′)：
上游引物：TTTGCGGTACAAATCGAGCC(SEQ ID NO：2)
下游引物：TCACCAGGTGCATGGTAAGG(SEQ ID NO：3)
PCR反应程序优化：
反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火34s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min。
PCR反应体系以20μl计为：血液DNA 1μL，2×TaqMasterMix 10μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，ddH2O 7μL。
DNA序列鉴定采用直接测序法，由北京华大基因公司进行。每个PCR扩增片段测序执行正向测序。所测得的PCR产物序列与NCBI基因组序列比对，确认扩增序列的真实性；同时，确认对应SNP位点的突变。PCR扩增产物测序结果显示rs315435578位点的不同等位基因如图3所示。
(2)利用本发明SNP分子标记进行辅助选择生长高效新品系选育方法
选择肉鸡为选育对象，随机挑选1000只个体作为待测群体，公母比例1∶1。记为F0代。
所有个体于30日龄左右翅静脉采血，加入ACD抗凝剂，-20℃保存备用。采用常规酚仿法提取基因组DNA，溶于ddH2O中，用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法双重检测DNA的纯度和浓度,然后稀释至浓度50ng/μl。
采用上述1个SNP的特异性引物进行PCR扩增反应；采用直接测序法对rs315435578位点基因型进行分型；根据基因分型结果选留CC基因型的健康公、母鸡。
每个基因型公鸡不低于30只，公、母比例不低于1:3的数量留种。记录每只鸡的编号建立系谱，产蛋高峰期按照公鸡半同胞、母鸡全同胞家系的方法组建CC基因型个体的纯系，记为F1代。
对于CC基因型个体的纯系，每个家系至少随机选择1只后代母鸡个体，合计每个纯系屠宰50只，记为F2代。所有选择的100只个体均于56日龄屠宰，采集称量宰前活重、屠体重、全净膛重、半净膛重。统计选育后CC基因型的屠宰性状重量。
本发明通过提供鸡rs315435578的GWAS分析获得、突变位点的检测、以及在屠宰加工型新品系选育的应用等方法，目前市面上都是屠宰型或者加工型的肉鸡品系，而通过对上述的分子标记进行选育，携带优势基因型的肉鸡，在屠宰性状上具有一定优势，提高经济价值的同时为鸡体重性状相关的分子标记辅助选择及在优质新品系选育方面提供基础。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.与肉鸡屠宰性状相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记含有鸡如SEQ ID NO:1所示序列第21bp处的多态性为T/C的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述分子标记所含多态性位点的基因型为CC，对应于具有高全净膛率、高半净膛率的生长高效肉鸡个体。
3.用于扩增权利要求1或2所述分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的序列如SEQ ID NO:2-3所示。
4.含有权利要求3所述引物对的检测试剂或试剂盒。
5.生长高效肉鸡品系的鉴定及选育方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测鸡的基因组DNA；
(2)以待测鸡DNA为模板，利用权利要求3所述的引物对，进行PCR扩增；
(3)分析PCR扩增产物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)采用直接测序法对获得的PCR扩增产物进行等位基因测序，根据测序结果判定如下：若鸡参考基因组6.0版本8号染色体第7395009bp对应的多态性位点的基因型为CC，判定待测鸡为具有高全净膛率、高半净膛率的生长高效肉鸡个体。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述提取待测鸡的基因组DNA的方法为：对待测鸡进行鸡翅静脉采血，用抗凝剂进行抗凝处理后经裂解、蛋白酶消化处理，然后采用酚仿法提取基因组DNA，以ddH2O溶解。
8.权利要求1或2所述分子标记、权利要求3所述引物对或权利要求4所述检测试剂或试剂盒的以下任一应用：
(1)用于鉴定肉鸡屠宰性状相关基因TNR的基因型；其中，基因TNR在NCBI上的GeneID:7143；
(2)用于具有高全净膛率、高半净膛率的生长高效肉鸡品系的早期预测、鉴定及改良；
(3)用于鸡的分子标记辅助育种；
(4)用于制备鸡育种芯片。
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