CN110835651A

CN110835651A - 检测鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记的引物、试剂盒及其应用

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Publication number: CN110835651A
Application number: CN201810941617.1A
Authority: CN
Inventors: 李转见; 刘丹丽; 李文雅; 韩瑞丽; 田亚东; 李红; 刘小军; 王永才; 王春秀; 蒋瑞瑞; 李国喜; 闫峰宾; 孙桂荣; 王彦彬; 李文婷; 康相涛
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2018-08-17
Filing date: 2018-08-17
Publication date: 2020-02-25
Anticipated expiration: 2038-08-17
Also published as: CN110835651B

Abstract

本发明涉及检测鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记的引物、试剂盒及其应用，属于生物育种技术领域。本发明的检测引物为：上游引物：P‑F:5′‑GACAGTAAGCTAGTGTAACCA‑3′；下游引物：P‑R:5′‑TTCTGTGATTCTGTGACAAGG‑3′。利用本发明的检测引物、试剂盒及检测方法发现鸡生长性状及屠体性状的差异和CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记有关，进而筛选生长状况良好的品种进行育种。本发明的indel复等位基因标记可用于鸡的辅助选择和分子育种，本发明建立的分子生物学方法大大提高了基因型的判定效率和准确性，而且方法简便，分型时间短，不需要测序和限制性内切酶，不需要特殊的仪器，成本低，易推广普及。该方法可以快速判定出不同体重性状的基因型，从而缩短育种时间，加快育种进程。

Description

检测鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记的引物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种检测鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记的引物、试剂盒及其应用，属于生物育种技术领域。

背景技术

畜禽遗传资源是保护生物多样性、培育新品种、实现畜牧业可持续发展战略的重要生物资源。我国有丰富的地方鸡品种资源，如何对其评估、保护和选育是迫切需要解决的问题。目前，随着人们对畜禽生长环境的重视和饲料品质要求的提高，畜禽的生产性能得到了很大的提升，畜禽的肉质满足了人类稳定蛋白摄入的需要，成为了人类生活所必需的物质基础。但是，对家禽的不利选育又会导致某些优势基因型的丢失，因此借助现代分子标记在种质特性不改变的情况下提高地方畜禽品种的经济性状，从而进一步对畜禽遗传资源进行保护开发利用就显得尤为重要。

indel(insertion-deletion)，插入缺失标记，指的是两种亲本中在全基因组中的差异，相对另一个亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失。indel标记准确性高、稳定性好，分型系统简单，开始应用于动植物群体遗传分析、分子辅助育种、医学诊断等研究领域，有利于优良基因的进一步开发和利用。

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂3(CDKN3)编码一种双特异性蛋白磷酸酶，属于Cip-Kip家族，参与细胞周期的调控。它已被证明是一种细胞周期依赖性激酶抑制剂，且与CDK2相互作用并阻止其活化。据报道，Cip-Kip家族在调节生物体的发育和分化方面发挥着极其重要的作用。然而，CDKN3基因在畜禽生长和胴体性状方面的研究较少，还没有关于鸡的基因多态性的相关报道。

发明内容

本发明提供一种用于检测鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记的引物。该引物的扩增片段覆盖了鸡CDKN3基因启动子区5‘端起的第2-217位，从基因多态性上分析鸡群生长状况。

本发明还提供一种用于检测鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记的试剂盒。该试剂盒包含上述检测鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记的引物。

同时，本发明提供一种检测鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记的方法。

本发明还提供一种利用鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记预测鸡群生长状况方面的应用。

最后，本发明提供一种鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记在鸡育种方面的应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种检测鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记的引物，所述引物的序列为：

P-F:5′-GACAGTAAGCTAGTGTAACCA-3′；

P-R:5′-TTCTGTGATTCTGTGACAAGG-3′。

上述引物序列根据鸡CDKN3基因序列设计，序列如SEQ ID NO.1所示，基因序列的NCBI GenBank登录号为NC_006092.5。上述引物可以采用现有技术中的常用方法设计，也可以根据检测方法的不同进行设计。

上述引物扩增出的indel复等位基因标记位于CDKN3基因的启动子部位，覆盖了鸡CDKN3基因启动子区5‘端起的第2-217位。

包含上述检测鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记的引物的试剂盒，所述引物的序列为：

P-F:5′-GACAGTAAGCTAGTGTAACCA-3′；

P-R:5′-TTCTGTGATTCTGTGACAAGG-3′。

上述试剂盒还包括dNTPs、灭菌超纯水、DNA聚合酶和DNA Marker。

一种检测鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测鸡的基因组DNA，利用上述检测鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记的引物的试剂盒进行PCR扩增；

(2)对PCR扩增产物进行测序；

(3)根据测序结果判定待测鸡的基因型。

步骤(1)中所述的提取待测鸡的基因组DNA采用的方法为苯酚-氯仿粗提法。

步骤(1)所述的PCR扩增的反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

步骤(1)中所述的PCR扩增的反应体系为2×Taq PCR MasterMix 3.0μL、引物P-F(10pmol/L)0.5μL、引物P-R(10pmol/L)0.5μL、待测鸡的基因组DNA(50ng/μL)1.0μL、灭菌超纯水5.0μL。

步骤(3)所述的判定待测鸡的基因型，具体方法如下：

1)若电泳图谱条带大小为219bp，则待测鸡的基因组序列的两个等位基因5‘端无indel复等位基因标记插入，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，对应个体为纯合体；

2)若电泳图谱条带大小为238bp，则待测鸡的基因组序列的两个等位基因5‘端第140-141位均有一段19bp的indel复等位基因标记插入，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，对应个体为纯合体；

3)若电泳图谱条带大小为257bp，则待测鸡的基因组序列的两个等位基因5‘端第159-160位均有两段19bp的indel复等位基因标记插入，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，对应个体为纯合体；

4)若电泳图谱条带大小为257bp和238bp，则待测鸡基因组序列的一个等位基因5‘端第140-141位有一段19bp的indel复等位基因标记插入，另一个等位基因5‘端第159-160位有两段19bp的indel复等位基因标记插入，对应个体为杂合体；

5)若电泳图谱条带大小为238bp和219bp，则待测鸡基因组序列的一个等位基因5‘端第140-141位有一段19bp的indel复等位基因标记插入，另一个等位基因无indel复等位基因标记插入，对应个体为杂合体；

6)若电泳图谱条带大小为257bp和219bp，则待测鸡基因组序列的一个等位基因5‘端第159-160位有两段19bp的indel复等位基因标记插入，另一个等位基因无indel复等位基因标记插入，对应个体为杂合体。

上述步骤1)～6)中的个体对应的基因型分别为C³C³、C⁴C⁴、C⁵C⁵、C⁴C⁵、C³C⁴、C³C⁵。

一种利用鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记预测鸡群生长状况方面的应用，包括如下步骤：

(1)利用上述检测鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记的方法判定待测鸡的基因型；

(2)根据判定鸡基因型的结果预测鸡群生长状况。

上述步骤(2)所述的鸡群生长状况指鸡体重、胫长、胸骨长、半净膛重、净膛重、头重、爪重、翅重、肝脏重、心脏重、脾脏重、腿重、屠体重中的至少一种。

优选的，上述步骤(2)中所述的鸡群生长状况指鸡10周体重、12周体重、12周胫长、半净膛重、全净膛重及屠体重。

鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记在鸡育种方面的应用，包括如下步骤：

(2)根据判定鸡基因型的结果预测鸡群生长状况。

(3)根据步骤(2)鸡群生长状况的预测结果筛选出生长状况良好的基因型的个体，进行育种。

具体的，步骤(3)所述的生长状况良好的基因型为C³C³、C⁴C⁴、C³C⁴的个体进行育种。

进一步优化的，步骤(3)所述的生长状况良好的基因型为C³C³、C⁴C⁴。

本发明的有益效果：

本发明的检测引物、试剂盒及检测方法发现鸡生长性状及屠体性状的差异和CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记有关。本发明的indel复等位基因标记可用于鸡的辅助选择和分子育种，本发明建立的分子生物学方法大大提高了基因型的判定效率和准确性，而且方法简便，分型时间短，不需要测序和限制性内切酶，不需要特殊的仪器，成本低，易推广普及。该方法可以快速判定出不同体重性状的基因型，从而缩短育种时间，加快育种进程。利用本发明检测出了CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记在地方鸡、高产蛋鸡中的分布，分析了indel复等位基因标记在不同品种鸡中基因型的分布及等位基因频率。

附图说明

图1为实施例3的技术流程图；

图2为实施例3中各样本鸡CDKN3基因启动子不同体重性状基因型的PCR电泳图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施方式作进一步说明。

下述实施例中的试验方法，如无特殊的说明，均为现有技术中的方法。下述实施例中的材料、器材和试剂如无特殊的说明均可从商业途径中获得。

实施例1

本实施例中检测鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记的引物，根据NCBI公布的CDKN3基因序列(GenBank Accession NC_006092.5)设计引物，引物序列如下所示：

P-F:5’-GACAGTAAGCTAGTGTAACCA-3’；

P-R:5’-TTCTGTGATTCTGTGACAAGG-3’。

上述引物扩增出的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或如SEQ ID NO.2所示，或如SEQ ID NO.3所示，主要是由于CDKN3基因启动子区域有一段或两段19bp的indel造成的，这两个片段的插入或缺失构成具有六种基因型的复等位基因。

C³C³是CDKN3基因启动子区无片段插入的基因型，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；C⁴C⁴是CDKN3基因启动子区有一段19bp片段插入的基因型，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，(SEQ ID NO.1所示的5‘端起第140-141位插入)；C⁵C⁵是CDKN3基因启动子区有两段19bp片段插入的基因型，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示(SEQ ID NO.1所示5‘端起第159-160位插入)。其中C³C³基因型为GenBank NC_006092.5中的序列。

通过上述的C⁵C⁵、C⁴C⁴、C³C³三种基因型自由组合可以得到C⁵C⁵基因型、C⁴C⁴基因型、C³C³基因型、C⁴C⁵基因型、C³C⁴基因型、C³C⁵基因型六种基因型的鸡个体。

实施例2

本实施例中用于检测鸡CDKN3基因启动子indel复等位基因标记的检测试剂盒包括如实施例1所示的引物，还包括dNTPs、灭菌超纯水、PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和DNAMarker。

实施例3

本实施例中检测鸡CDKN3基因启动子indel复等位基因标记的技术流程图如图1所示，本实施例中PCR反应所用的引物为实施例1提供的引物，PCR反应所用试剂盒为实施例2提供的试剂盒，检测方法包括如下步骤：

(1)样品的采集：

采集河南农业大学种鸡场F2代资源群(固始鸡×安卡)773只、淅川乌骨鸡363只、卢氏鸡97只、东乡鸡155、长顺鸡137只、固始鸡29只、海兰褐壳蛋鸡207只、罗曼褐壳蛋鸡49只和罗斯308 184只(308指罗斯308鸡品种)。翅静脉采血，加1/3抗凝剂，采用苯酚-氯仿粗提法提取基因组DNA，保存于4℃冰箱备用。

(2)PCR扩增：

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分别分装到0.2mL Eppendorf PCR管中，然后分别加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增；PCR反应体系见表1。

PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。其中，2×Taq PCR MasterMix购自北京康为公司。

表1 PCR反应体系

(3)PCR扩增产物的检测及基因型的判定

取7μL PCR扩增产物，2.5％的琼脂糖凝胶电泳(电泳电压：120V；电泳时间：40min)点样，凝胶成像系统检测，电泳图谱中如图2所示，自左至右泳道分别代表基因型C⁵C⁵、C⁴C⁴、C³C³、C⁴C⁵、C³C⁴、C³C⁵的电泳带型和DNA Marker:DL2000。

基因型的判定方法如下：若有257bp的片段，则该待测鸡为C⁵C⁵基因型，个体为纯合体；若扩增片段大小为238bp，则该待测鸡为C⁴C⁴基因型，个体为纯合体；若扩增片段大小为219bp，则该待测鸡为C³C³基因型，个体为纯合体；若扩增片段大小为257bp和238bp，则该待测鸡为C⁴C⁵基因型，个体为杂合体；若扩增片段大小为238bp和219bp，则该待测鸡为C³C⁴基因型，个体为杂合体；若扩增片段大小为219和257bp，则该待测鸡为C³C⁵基因型，个体为杂合体。

对F2分离群体、4个地方品种(淅川鸡、卢氏鸡、东乡鸡、长顺鸡和固始鸡)、高产型蛋鸡(海兰褐蛋鸡、罗曼褐壳蛋鸡)和快大型肉鸡罗斯308的基因型分型结果如表2所示。

表2不同群体基因型检测结果统计表

实施例4

本实施例是在实施例3基因型的判定结果的基础上分析F2资源群体生长性状与CDKN3启动子基因型的关系。

对于检测的773个个体F₂资源群体中具有完整经济性状记录，可用于该多态位点的关联分析。经济性状测定方法参考文献(Han R L，Li Z J，Li M J，et al.Novel 9-bpindel in visfatin gene and its associations with chicken growth.Br Poult Sci，2011，52(1):52-57.)。其中测定的生长、屠宰指标及肉质指标共57项指标。对773只F2资源群体生长性状及屠体性状的统计分析如表3所示。

表3 CDKN3启动子基因型与F2资源群体生长/屠体性状的关联结果

注：^a,b,c同一行上标不同者表明达到了极显著水平(P<0.01)，

^a,b,c同一行上标不同者表明达到了显著水平(P<0.05)。

表3关联分析结果显示：在CDKN3基因启动子5‘端插入一段19bp和/或两段19bp的序列，即CDKN3基因的indel突变多态性与10周体重、12周体重、半净膛重、全净膛重及屠体重等显著相关(P<0.05)，其中，与10周体重、12周体重、半净膛重、全净膛重、屠体重呈极显著相关(P<0.01)。且整体上C³C⁴基因型个体的生长性状以及屠体性状关联分析数值最大，其次为C³C³和C⁴C⁴基因型，而C³C⁵、C⁵C⁵、C⁴C⁵基因型关联分析数值最小。

实施例5

本实施例在实施例4检测结果的基础上对待测个体进行育种，筛选出优良品种。

依据实施例3和实施例4中表2、3的分析结果，加强对C³C⁴、C³C³和C⁴C⁴基因型个体的选育，来提高鸡的经济性能。淘汰C³C⁵、C⁵C⁵、C⁴C⁵基因型个体。培育纯合中国地方鸡种，选留C³C³和C⁴C⁴基因型个体，培育杂合中国地方鸡种，选留C³C⁴基因型个体。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 检测鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记的引物、试剂盒及其应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<211> 219

<212> DNA

<213> 鸡

<221> CDKN3基因启动子C³C³基因型

<400> 1

tgacagtaag ctagtgtaac cattatagtg tccaatggaa gactatgaag atggggaagg 60

gtttgagggg aaggaatgtg aggcgtggct gagggacctg ggtttgttgg gcccagagca 120

gaggaggttg aggggaggca tcatggcggc tgcagctcct catggcggcc tgcagctcct 180

catggcggcc tgcagctcct tgtcacagaa tcacagaaa 219

<211> 238

<212> DNA

<213> 鸡

<221> CDKN3基因启动子C⁴C⁴基因型

<400> 2

tgacagtaag ctagtgtaac cattatagtg tccaacggaa gactatgaag ctggggaagg 60

gtttgagggc aaggaatgtg aggcgtggct gagggacccg ggtttgttgg gcccagagca 120

gaggaggctg aggggaggca tcatggcggc cgcagctcct catggcggcc gcagctcctc 180

atggcggcct gcagctcctc atggcggcct gcagctcctt gtcacagaat cacagaaa 238

<211> 257

<212> DNA

<213> 鸡

<221> CDKN3基因启动子C⁵C⁵基因型

<400> 3

tgacagtaag ctagtgtaac cattatagtg tccaatggaa gactatgaag atggggaagg 60

gtttgagggg aaggaatgtg aggcgtggct gagggacctg ggtttgttgg gcccagagca 120

gaggaggctg aggggaggca tcatggcggc cgcagctcct catggcggcc gcagctcctc 180

atggcggccg cagctcctca tggcggcctg cagctcctca tggcggcctg cagctccttg 240

tcacagaatc acagaaa 257

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 上游引物序列P-F

<400> 4

gacagtaagct agtgtaacca 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 下游引物引物P-R

<400> 5

ttctgtgattc tgtgacaagg 20

Claims

1.一种检测鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记的引物，其特征在于：所述引物的序列为：

P-F:5′-GACAGTAAGCTAGTGTAACCA-3′；

P-R:5′-TTCTGTGATTCTGTGACAAGG-3′。

2.一种试剂盒，其特征在于：包含如权利要求1所述的检测鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记的引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括dNTPs、灭菌超纯水、DNA聚合酶和DNA Marker。

4.一种检测鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)提取待测鸡的基因组DNA，利用如权利要求2所述的试剂盒进行PCR扩增；

(2)对PCR扩增产物进行测序；

(3)根据测序结果判定待测鸡的基因型。

5.根据权利要求4所述的检测鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记的方法，其特征在于：步骤(3)所述的根据测序结果判定待测鸡的基因型，具体方法如下：

1)若电泳图谱条带大小为219bp，则待测鸡的基因组序列的两个等位基因5‘端无indel复等位基因标记插入，对应个体为纯合体；

2)若电泳图谱条带大小为238bp，则待测鸡的基因组序列的两个等位基因5‘端第140-141位均有一段19bp的indel复等位基因标记插入，对应个体为纯合体；

3)若电泳图谱条带大小为257bp，则待测鸡的基因组序列的两个等位基因5‘端第159-160位均有两段19bp的indel复等位基因标记插入，对应个体为纯合体；

6.一种利用鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记预测鸡群生长状况方面的应用。

7.根据权利要求6所述的利用鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记预测鸡群生长状况方面的应用，其特征在于：包括如下步骤：

(1)利用权利要求4所述的检测鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记的方法判定待测鸡的基因型；

(2)根据判定鸡基因型的结果预测鸡群生长状况。

8.根据权利要求7所述的利用鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记预测鸡群生长状况方面的应用，其特征在于：步骤(2)所述的鸡群生长状况指鸡体重、胫长、胸骨长、半净膛重、净膛重、头重、爪重、翅重、肝脏重、心脏重、脾脏重、腿重、屠体重中的至少一种。

9.鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记在鸡育种方面的应用。

10.根据权利要求9所述的鸡CDKN3基因启动子区indel复等位基因标记在鸡育种方面的应用，其特征在于：包括如下步骤：

(2)根据判定鸡基因型的结果预测鸡群生长状况；

(3)根据步骤(2)鸡群生长状况的预测结果筛选出生长状况良好的基因型的纯合个体，进行育种。