CN114350821B

CN114350821B - 一种与猪肌肉pH值和瘦肉率相关的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN114350821B
Application number: CN202210066762.6A
Authority: CN
Inventors: 彭先文; 乔木; 武华玉; 吴俊静; 梅书棋; 周佳伟; 张宇; 徐忠; 李梓芃; 宋忠旭; 孙华; 李良华; 赵海忠; 董斌科
Original assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-01-20
Filing date: 2022-01-20
Publication date: 2023-10-03
Anticipated expiration: 2042-01-20
Also published as: CN114350821A

Abstract

本发明公开了一种与猪肌肉pH值和瘦肉率性状相关的分子标记及其应用，属于猪遗传标记制备技术领域。SNP分子标记的核苷酸如SEQ ID NO:1所示，是从猪NT5C1A基因3′UTR克隆得到的一段特异的核苷酸片段，在SEQ ID NO:1的479bp处存在一个T/C碱基突变。本发明提供了用于检测该位点的引物对，并建立了相应的检测方法，为猪肉质性状标记辅助选择提供了新的分子标记。本发明可实现对猪肌肉pH值和瘦肉率相关性状进行早期选择，且检测方法高效、准确，从而能加速猪肉质改良的进程，提高猪育种的经济效益。

Description

一种与猪肌肉pH值和瘦肉率相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记领域，特别是涉及一种与猪肌肉pH值和瘦肉率相关的分子标记及其应用。

背景技术

猪肉品质是猪的重要经济性状，提高猪肉品质是现代种猪选育工作的重要目标之一，同时也是满足消费者对猪肉风味、食品健康和营养需求的重要保障。

肌肉pH值是肉质性状的重要评价指标之一，屠宰后肌肉最终的pH值是衡量猪肌肉品质的重要指标，肌肉的pH值过高则容易形成DFD肉(黑干肉)，如果肌肉的pH值过低则容易形成PSE肉(白肌肉)，这两种情况都对猪肉的品质造成了巨大的影响，并且对猪肉的深加工带来了较大影响。瘦肉率是影响猪肉品质和经济效益的重要性状。然而pH值和瘦肉率的测定只能在屠宰之后，极大的限制了选育工作的发展。分子标记辅助选择(Marker-assistedselection,MAS)的出现大大加速了猪育种的进程，它是利用与特定性状相关联的分子标记作为辅助手段进行选择育种，具有快速、准确、不受环境影响等优点，不仅能大大减少育种的人力物力消耗，而且能缩短育种时限。

用于MAS的分子标记包括蛋白质标记，微卫星标记，单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，简称SNP)标记等。SNP标记指由基因组单核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括碱基转换、颠换、缺失或插入等。挖掘猪肉质性状相关的SNP，能有效加快猪肉质性状的改良进展，为养猪业的可持续发展将带来巨大的经济效益。

胞质5′核苷酸酶1A(cytosolic 5'-nucleotidase 1A,NT5C1A)基因，在人的骨骼肌和小鼠的胫骨前肌表达量较高(Hunsucker et al.,2001；Sala-Newby et al,1999)；抗NT5C1A自身抗体可以作为包涵体肌炎(一种肌肉疾病)的标记物(Amlani et al,2019)。迄今为止，尚无有关NT5C1A基因作为猪肌肉pH值和瘦肉率分子标记的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种与猪肌肉pH值和瘦肉率相关的分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，为猪肌肉pH值和瘦肉率性状相关的的分子标记辅助育种提供一种新的分子标记。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

技术方案一：一种与猪肌肉pH值和瘦肉率相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1所示序列的第479bp处存在一处T/C突变。

优选地，所述突变包括CC、CT和TT三种突变类型，其中，当猪个体基因型为TT型时，所述猪个体的瘦肉率和肌肉pH值均高于CC型和TC型的猪个体。

优选地，所述引物对为如SEQ ID NO：2所示的上游引物和如SEQ ID NO：3所示的下游引物。

技术方案二：一种鉴别猪肌肉pH值和瘦肉率性状的试剂盒，包括权利要求3所述的引物对。

技术方案三：一种鉴别猪肌肉pH值和瘦肉率性状的方法，包括如下步骤：

以待测猪个体的DNA为模板，利用所述的引物对进行扩增，获取扩增产物；对所述扩增产物进行测序，分析基因型以及所述基因型与瘦肉率和肌肉pH值性状的相关性，进而鉴别猪肌肉的pH值和瘦肉率。

优选地，扩增体系包括如下组分：DNA 100ng、PCR mix 25μL、上游引物和下游引物各1μL、加ddH₂O补至总体积50μL。

优选地，扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火35s，72℃延伸35s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

技术方案四：所述的分子标记或所述的引物对或所述的试剂盒或所述的方法在辅助对猪育种中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明发掘了与猪肌肉pH值和瘦肉率性状关联的分子标记，位于猪NT5C1A基因3′UTR，所述分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，该序列长度为535bp，在该序列中第479bp处存在一处T/C碱基突变；本发明首次发掘了该分子标记，并与猪肌肉pH值和瘦肉率相关联，检测方法高效、准确，为优质猪肉的选育提供了一种新的分子标记，从而加速了猪肉质改良的进程，提高了猪育种的经济效益。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明猪NT5C1A基因SEQ ID NO.1序列片段琼脂糖凝胶电泳图，其中M为100bp DNA Ladder(分子量标准，从下至上依次为100bp,200bp,300bp,400bp,500bp,600bp,700bp,800bp,900bp,1000bp和1500bp)，1、2表示扩增的DNA片段，片段大小为535bp；

图2为本发明中筛选的SNP位点的测序图谱，其中箭头表示突变位点。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

猪NT5C1A基因SNP检测片段的获得及检测方法的建立

1、猪基因组DNA的提取

本发明的试验猪品种为硒都黑猪和法系大白猪，样品均由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所种猪场提供。猪基因组DNA采用北京天根生化科技有限公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒(货号：DP348)进行提取，具体步骤参照试剂盒说明书。对提取出的DNA进行浓度和质量检测，置于-20℃下保存备用。

2、猪NT5C1A基因SNP遗传标记检测片段的获得

(1)PCR扩增

根据猪NT5C1A基因(GenBank ID:NC_010448)的基因组序列，设计扩增上述SEQ IDNO:1序列(保护本发明SNP位点)的引物对：

正向引物：5′CATCTTCTTTGACGACCA 3′

反向引物：5′CATGCACTGAATGCCAAG 3’

以硒都黑猪和法系大白猪基因组DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，PCR反应体系50μL，体系中各组分为：基因组DNA 100ng、PCR mix25μL、上述上下游引物各1μL、加ddH₂O补至总体积50μL。

PCR的运行程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火35s，72℃延伸35s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如附图1所示，其中泳道M为100bp DNA Ladder，泳道1、2表示扩增的DNA片段，片段大小为535bp。

SEQ ID NO.1

序列中标注的Y为突变位点，标有下划线显示(括号中为突变碱基)，在该序列的首尾加粗显示为引物序列位置。

SEQ ID NO.2

CATCTTCTTTGACGACCA

SEQ ID NO.3

CATGCACTGAATGCCAAG

(2)PCR产物纯化

用上海生工生物工程有限公司的Gel Extraction Kit试剂盒(货号：B610353)对上述PCR扩增产物进行纯化，具体步骤见试剂盒说明书。

3、利用PCR产物直接测序法检测分子标记

将上述获得的PCR纯化产物直接送到北京奥科公司进行测序，根据测序结果判定该位点在检测群体中的基因型。利用Chromas软件进行分析，结果如附图2所示，发现在该序列中的第479bp存在一处T/C等位基因突变，引起NT5C1A基因的多态性。

实施例2

本发明的分子标记在不同猪群中的多态性分布检测

本实施例分别在硒都黑猪和法系大白猪群体中检测猪NT5C1A基因SEQ ID NO:1的479bp处的T/C位点的多态性，检测结果如表1所示。

表1 NT5C1A基因3′UTR的479T/C多态性在不同猪群中的分布

由表1结果可知，NT5C1A基因3′UTR的479T/C位点在不同猪群中均表现为三种基因型，其中TT基因型占优势，T等位基因为优势等位基因，T等位基因在地方猪种硒都黑猪所占比例高于国外猪种法系大白猪。

实施例3

本发明克隆的分子标记与猪肌肉pH值和瘦肉率的关联分析及应用

为了确定猪NT5C1A基因3′UTR的479T/C多态性与猪肌肉pH值和瘦肉率是否相关，选择400头法系大白猪×硒都黑猪F₂代资源群体为试验材料，采用实施例1建立的方法进行多态性检测，采用SAS统计软件(SAS Institute Inc,Version 9.1)GLM程序进行单标记方差分析，分析猪NT5C1A基因3′UTR的479T/C位点三种基因型与猪肉质和胴体性状的相关性，所采用模型为：

Y_ijkl＝μ+G_i+S_j+N_k(+b_ijkX_ijk)+e_ijkl

Y_ijkl为性状表型值，μ为平均值，G_i为基因型效应，S_j为性别效应、N_k为年度效应，b_ijk为屠宰日龄或者屠宰体重的回归系数，肉质性状以屠宰日龄为协变量，胴体性状以屠宰体重为协变量，e_ijkl为残差效应。关联分析结果如表2所示。

表2猪NT5C1A基因3′UTR的479T/C多态性与肌肉pH值和瘦肉率关联分析

注：以上数值为最小二乘均值±标准误；同行含有相同字母表示差异不显著，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；基因型效应*表示P＜0.05。

由表2可知，所述NT5C1A基因3′UTR的479T/C位点的TT基因型个体的瘦肉率和背最长肌pH值均显著高于TC型和CC基因型个体(P<0.05)，并且加性效应达到了显著水平(P<0.05)。由此可见，在猪群体中，继代选育TT基因型个体，可以提高瘦肉率，获得优良的肌肉pH值，为养猪行业的可持续发展将带来巨大的经济效益。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。

序列表

<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种与猪肌肉pH值和瘦肉率相关的分子标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 535

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (479)

<223> n=c或t

<400> 1

catcttcttt gacgaccaga tgttccacgt ggctggggct caggagatgg gcaccgtggc 60

ggcccacgtg ccttacggtg tggcgcagac cccccggcgg accacaccta cgaagcaggc 120

cccctctgcc cagtagctga gccaccagct tcactgacca catggctcca ggcatggctc 180

cctgtcacat gtgtcatcca gtggcccctt ccagttcccc accaccctgc ctatttgcat 240

gtccgcctgc atcgctgaga gtgaggtact tgtaggaaat tatgcagact gagccggcat 300

tgtcaccagc cctccttttg ggcaaacgct gtgccatgat cctggctagg aaagtaagac 360

tgtgcagagt agctgggttt cagggggaag ttgatgggcc tgagagtggg agggtcagag 420

cagccaggat gcctcaaaag gggggttatg agactagctc agtgtagtat aaagaacgnt 480

gcttggagaa agaagggatc tggcttctaa gctctgtctt ggcattcagt gcatg 535

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

catcttcttt gacgacca 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

catgcactga atgccaag 18

Claims

1.一种分子标记在筛选猪肌肉pH值和瘦肉率性状中的应用，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1所示序列的第479 bp处存在一处T/C突变。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述突变包括CC、CT和TT三种突变类型，其中，当猪个体基因型为TT型时，所述猪个体的瘦肉率和肌肉pH值均高于CC型和TC型的猪个体。

3.一种鉴别猪肌肉pH值和瘦肉率性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：

以待测猪个体的DNA为模板，利用引物对进行扩增，获取扩增产物；对所述扩增产物进行测序，分析基因型以及所述基因型与瘦肉率和肌肉pH值性状的相关性，进而判断待测猪个体的pH值和瘦肉率；所述引物对为如SEQ ID NO：2所示的上游引物和如SEQ ID NO：3所示的下游引物。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，扩增体系包括如下组分：DNA 100ng、PCR mix25μL、上游引物和下游引物各1μL、加ddH₂O补至总体积50μL。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火35s，72℃延伸35s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

6.一种分子标记在辅助对猪育种中的应用，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1所示序列的第479 bp处存在一处T/C突变。

7.如权利要求3所述的方法在辅助对猪育种中的应用。