CN116694784B - 猪胴体性状关联的分子标记、引物、试剂盒、方法及应用 - Google Patents
猪胴体性状关联的分子标记、引物、试剂盒、方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及猪胴体性技术领域，具体涉及猪胴体性状关联的分子标记、引物、试剂盒、方法及应用。该猪胴体性状关联的分子标记，包括猪COL6A2基因第18外显子第148碱基处发生单核苷酸突变T>C形成的核苷酸序列。该分子标记的CC基因型个体眼肌高、眼肌面积和瘦肉率高于其他基因型，平均背膘厚、肩部最厚处膘厚、6‑7肋间膘厚、胸腰椎间膘厚、臀部膘厚显著低于其他基因型，选育CC基因型个体，有利于提高瘦肉率，降低背膘厚。
Description
技术领域
本申请涉及猪胴体性技术领域，具体涉及猪胴体性状关联的分子标记、引物、试剂盒、方法及应用。
背景技术
猪胴体性状是影响猪肉品质的重要的经济性状，是遗传改良的目标性状之一。胴体性状主要有屠宰率、眼肌面积、背膘厚、瘦肉率、肥肉率等。由于胴体性状无法进行活体测定，制约了其遗传改良的效率。分子标记辅助选择的出现大大加速了猪育种的进程，它是利用与特定性状相关联的分子标记作为辅助手段进行选择育种，具有快速、准确、不受环境影响等优点，不仅能大大减少育种的人力物力消耗，而且能缩短育种时限，因此挖掘与猪胴体性状相关的分子标记，对于猪肉品质遗传改良具有重要意义。
发明内容
Ⅵ型胶原蛋白α2链(collagen typeⅥα2chain，COL6A2)是胶原蛋白家族中的一员，具有Gly-X-Y三联体重复序列构成的三螺旋结构域(Oh et al 2021)，VI型胶原蛋白(COL6)广泛存在于细胞外基质中，包括骨骼肌细胞和构成结缔组织的周围细胞，在细胞外基质的合成过程中起到了重要的作用(郑多安等2020)。分化的脂肪细胞大量地分泌COL6，包括三个α链：COL6A1、COL6A2和COL6A3(Engvall et al 1986)，在脂肪细胞分化中发挥作用，并且其中一个链的缺失会导致其他两个在细胞内的水平降低(Liu et al 2017,Zhaoet al.2016)，研究发现，COL6A3基因敲除的小鼠出现了脂肪生成和脂肪分解能力的缺陷，同时附睾脂肪组织中脂肪细胞大小和质量均下降(Aymerich et al 2019)。敲除COL6A2基因的肥胖小鼠代谢状况有所改善(Khan et al2009)。而关于COL6A2基因对猪肉质性状的影响还未见报道。
本申请发明人对肌内脂肪含量高、低组猪背最长肌进行转录组测序，发现COL6A2差异表达，通过扩增猪COL6A2基因的部分核苷酸序列，利用该序列进行了多态性变异位点的筛选鉴定及与猪胴体性状的关联分析，发现COL6A2基因第18外显子第148碱基处存在单核苷酸突变T>C，通过对该单核苷酸多态性位点不同基因型与胴体性状进行关联分析，发现其与猪胴体性状相关联。为此，本申请实施例至少公开了以下技术方案：
(1)：猪胴体性状关联的分子标记，包括猪COL6A2基因第18外显子第148碱基处发生单核苷酸突变T>C形成的核苷酸序列。
(2)：一种核酸分子，所述核酸分子包括如猪COL6A2基因第18外显子第148碱基处发生单核苷酸突变形成的核酸分子。
(3)：猪胴体性状关联的分子标记引物，包括如SEQ ID NO.3所示的DNA分子和如SEQ ID NO.4所示的DNA分子。
(4)：一种核酸分子，由(3)所述的分子标记引物经PCR扩增而成，所述核酸分子的基因型与猪胴体性状关联。
(5)：一种试剂盒，包括(3)所述的分子标记引物以及其他PCR扩增所需试剂。
(6)：猪胴体性状的检测方法，包括：
获取待测猪基因组DNA；
通过(2)所述的分子标记引物进行PCR扩增；
根据扩增产物的核苷酸序列检测猪COL6A2基因第18外显子第148碱基处的基因型；
根据所述基因型确定所述猪胴体性状。
(7)：猪的筛选方法，包括(6)所述的检测方法。
(8)：(1)所述的分子标记、(2)所述的分子标记引物、(2)或(4)所述的核酸分子或(5)所述的试剂盒的应用，所述应用选自如下任一：
1)猪胴体性状检测与分析；
2)猪的筛选与育种。
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果之一：
本申请实施例以硒都黑猪基因组DNA混合池为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行胶回收并且进行测序分析，并与大白母猪繁殖性能进行关联分析，发现COL6A2基因第18外显子第148碱基处存在单核苷酸突变T>C，通过对该单核苷酸多态性位点的不同基因型与胴体性状进行关联分析，发现其与猪胴体性状相关联，可为硒都黑猪的分子标记辅助选育提供参考数据。
本申请实施例在COL6A2基因第18外显子第148碱基的T>C多态位点，CC基因型个体眼肌高和眼肌面积显著高于CT和TT基因型个体(P<0.05)，且瘦肉率高于其他两个基因型个体。CC基因型个体平均背膘厚、肩部最厚处膘厚、6-7肋间膘厚、胸腰椎间膘厚、臀部膘厚显著低于CT和TT基因型个体(P<0.05)。因此，选育CC基因型个体，有利于提高瘦肉率，降低背膘厚。
附图说明
图1为本申请实施例提供的猪COL6A2基因第18外显子的PCR扩增结果，M为DL2000Maker，泳道1-6为PCR产物。
图2为本申请实施例提供的猪COL6A2基因第18外显子第148碱基处的测序结果。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
为了更好地理解本申请而不是限制本申请的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
为研究猪胴体性状的关联的分子标记，本申请实施例对肌内脂肪含量高、低组猪背最长肌进行转录组测序，发现COL6A2差异表达，通过扩增猪COL6A2基因的部分核苷酸序列，利用该序列进行了多态性变异位点的筛选鉴定及与猪胴体性状的关联分析，发现COL6A2基因第18外显子第148碱基处存在单核苷酸突变T>C，通过对该单核苷酸多态性位点的不同基因型与胴体性状进行关联分析，发现其与猪胴体性状相关联。
为此，本申请实施例提供了猪胴体性状关联的分子标记，包括猪COL6A2基因第18外显子第148碱基处发生单核苷酸突变T>C形成的核苷酸序列。其中，猪COL6A2基因参考GenBank数据库中猪COL6A2基因(登录号：NW_018085356.1)。
在一些实施例中，所述猪胴体性状选自眼肌高、眼肌宽、眼肌面积、平均背膘厚、肩部最厚处膘厚、6-7肋间膘厚、胸腰椎间膘厚、臀部膘厚、皮率、骨率、屠宰率、瘦肉率、肥肉率、瘦肥肉比例、花油重和板油重中的至少一种。在一些实施例中，所述猪胴体性状选自眼肌高、眼肌面积、平均背膘厚、肩部最厚处膘厚、6-7肋间膘厚、胸腰椎间膘厚、臀部膘厚、瘦肥肉比例、花油重和板油重中的至少一种。
在一些实施例中，猪COL6A2基因第18外显子第148碱基处，CC基因型个体眼肌高显著高于CT基因型个体和TT基因型个体。
在一些实施例中，猪COL6A2基因第18外显子第148碱基处，CC基因型个体眼肌面积显著高于CT基因型个体和TT基因型个体。
在一些实施例中，猪COL6A2基因第18外显子第148碱基处，CC基因型个体瘦肉率高于CT基因型个体和TT基因型个体。
在一些实施例中，猪COL6A2基因第18外显子第148碱基处，CC基因型个体平均背膘厚显著低于CT基因型个体和TT基因型个体。
在一些实施例中，猪COL6A2基因第18外显子第148碱基处，CC基因型个体肩部最厚处膘厚显著低于CT基因型个体和TT基因型个体。
在一些实施例中，猪COL6A2基因第18外显子第148碱基处，CC基因型个体6-7肋间膘厚显著低于CT基因型个体和TT基因型个体。
在一些实施例中，猪COL6A2基因第18外显子第148碱基处，CC基因型个体胸腰椎间膘厚显著低于CT基因型个体和TT基因型个体。
在一些实施例中，猪COL6A2基因第18外显子第148碱基处，CC基因型个体臀部膘厚显著低于CT基因型个体和TT基因型个体。
基于此，根据猪COL6A2基因第18外显子第148碱基处的基因型，可以对猪个体的猪胴体性状进行遗传标记，以利于选育低脂肪、高瘦肉率、低背膘厚等性状的品种。
基于此，本申请实施例还提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括如猪COL6A2基因第18外显子第148碱基处发生单核苷酸突变形成的核酸分子。
在一些实施例中，所述核酸分子具有如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。通过确定如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，即可确定猪COL6A2基因第18外显子第148碱基处的基因型，对应于如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的407碱基处的基因型。
由此，参考GenBank数据库中猪COL6A2基因(登录号：NW_018085356.1)的DNA序列第18外显子设计特异引物(该引物的序列如序列表SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示)，以硒都黑猪基因组DNA混合池为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行胶回收并且进行测序分析，得到如序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的基因片段。由此，本申请实施例还公开了一种猪胴体性状关联的分子标记引物，包括如SEQ ID NO.3所示的DNA分子和如SEQ ID NO.4所示的DNA分子。其中，“分子标记引物”是用来扩增包含猪胴体性状联锁的分子标记，例如SNPs的核苷酸序列，以分析该分子标记的基因型，从而得知猪的胴体性状。
基于此，本申请实施例还公开了一种核酸分子，由所述的分子标记引物经PCR扩增而成，所述核酸分子的基因型与猪胴体性状关联。
基于此，本申请实施例还公开了一种试剂盒，包括所述的分子标记引物以及其他PCR扩增所需试剂。
基于此，本申请实施例还公开了一种猪胴体性状的检测方法，包括：获取待测猪基因组DNA；通过所述的分子标记引物进行PCR扩增；根据扩增产物的核苷酸序列检测猪COL6A2基因第18外显子第148碱基处的基因型；根据所述基因型确定所述猪胴体性状。
基于此，本申请实施例还公开了一种猪的筛选方法，包括所述的检测方法。
基于此，本申请实施例还公开了所述的分子标记、所述的分子标记引物、所述的核酸分子或所述的试剂盒的应用，所述应用选自如下任一：
1)猪胴体性状检测与分析；
2)猪的筛选与育种。
现结合具体实例对本申请做进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本申请，但不构成对本申请的限制。在以下实施例中所用到的试验样本及试验过程包括以下内容(如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到)。
一、猪基因组DNA的提取
本发明的试验猪品种为硒都黑猪，猪基因组DNA的提取采用北京擎科生物科技有限公司生产的基因组DNA试剂盒(按照试剂盒说明书进行操作)提取，具体步骤如下所述：
(1)将动物组织先研磨充分，取样于1.5mL离心管中，然后加入200μL Buffer GA，涡旋混匀。
(2)加入20μL Proteinase K，混匀后，56℃水浴至组织酶解到无颗粒感。
(3)加入200μL Buffer GB于消化液中，涡旋混匀，然后56℃水浴10min。
(4)加入200μL无水乙醇至消化液中，涡旋混匀。
(5)吸附柱置于收集管中，然后将上一步所得混合液转移至吸附柱中12000r/min离心1min。
(6)弃掉废液，将吸附柱放回收集管中，加入500μL Buffer WB1于吸附柱中，12000r/min离心30sec。
(7)弃掉废液，将吸附柱放回收集管中，加入500μL Buffer WB2于吸附柱中，12000r/min离心30sec。
(8)重复步骤(7)。
(9)弃掉废液，将吸附柱放回收集管中，12000r/min空管离心2min，将吸附柱置于室温放置几分钟，彻底晾干残留的漂洗液。
(10)将吸附柱置于一个新的1.5mL离心管中，向吸附膜中间加入50-100μLTEBuffer(提前在65℃中水浴加热)，室温放置5min，12000r/min离心2min，收集DNA溶液(洗脱体积应不少于50μL，体积过少会影响洗脱效率，为得到更多的DNA，可将得到的DNA溶液重新加入吸附柱中进行二次洗脱)。
(11)测DNA浓度后保存于4℃，长期保存须放置于-20℃。
二、猪COL6A2目的片段序列的获取
1、PCR扩增
根据COL6A2基因的基因组序列(GenBank登录号：NW_018085356.1)设计以下引物对：
正向引物：5’GAGTTGTACGTGGCCCAGT 3’，SEQ ID NO.3
反向引物：5’GGGTCCCAAGAGGGCATAG 3’，SEQ ID NO.4
利用上述引物在硒都黑猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR反应体系为30μL，体系中各组分的浓度为100ng模板DNA，2×PCR Mix 15μL、上述正反向引物各0.5μM，PCR的运行程序如下：预变性98℃，45sec，然后变性95℃，15sec，退火55℃，30sec，延伸72℃，20sec，35个循环；终延伸72℃，60sec。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。
2、PCR产物纯化
上述PCR产物用Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化(按照该试剂盒的说明书操作)，具体步骤如下：
(1)在紫外灯下尽可能快速切下目的片段，并将含目的片段的凝胶转移至1.5mL离心管中。
(2)加入等体积的Binding Buffer(XP2)，在65℃水浴至凝胶完全融化，并振荡混匀。
(3)取干净2mL收集管并放置HiBind DNA Mini柱子，将上一步获得的混合液转移至柱子中，室温下10000r/min离心1min，弃收集管中滤液，(如果混合液的体积超过700μL，一次只能转移700μL至柱子中，余下的继续重复该步骤)
将柱子套回2ml收集管内。
(4)转移700μL SPW Wash Buffer至柱子中，室温下10000r/min离心1min(浓缩的SPW Wash Buffer在使用之前必须按照标签提示用无水乙醇稀释，如果DNA洗涤缓冲液在使用之前是置于冰箱中，须将其拿出置于室温下)。
(5)重复步骤(4)。
(6)弃收集管中的滤液，将柱子套回2mL收集管内收集，室温下13000r/min离心2min甩干柱子基质中剩下的液体。
(7)重新取一个干净的1.5mL离心管，将柱子放在离心管上，加入15-30μL(具体取决于预期的终产物浓度)的Elution Buffer(提前在65℃水浴锅中预热)
到柱子上。
(8)室温下静置2min。
(9)12000r/min离心1min以洗脱DNA。
(10)测定DNA浓度后，于-20℃中保存。
3、基因型分析
将上述获得的PCR产物直接送到奥科鼎盛公司进行测序，所得产物序列如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示，直接从测序图谱上进行基因型分析，结果如图2和表1所示。
表1硒都黑猪COL6A2基因rs81213581位点基因型频率和等位基因频率统计结果
三、本发明分子标记与猪胴体性状的关联分析及应用
用于关联分析的实验猪群为274头硒都黑猪，采用上述实验例所建立的PCR产物直接测序法进行多态性检测，用SAS统计软件中的GLM程序进行方差分析，分析猪COL6A2基因三种不同基因型与猪胴体性状的相关性，利用REG程序计算基因的加性效应和显性效应，并且进行差异性检验。所采用的模型为：Yijklmn＝μ+Ai+Bj+Ck+Dl+Xm+eijklmn，其中Y为性状表型值，μ为群体均值，Ai为基因型效应，Bj为年效应，Ck为年度效应，Dl为家系效应，Xm为协变量，eijklmn为残差。
关联分析结果如表2所示，CC基因型个体眼肌高和眼肌面积显著高于CT和TT基因型个体(P<0.05)，且瘦肉率高于其他两个基因型个体。CC基因型个体平均背膘厚、肩部最厚处膘厚、6-7肋间膘厚、胸腰椎间膘厚、臀部膘厚显著低于CT和TT基因型个体(P<0.05)。因此，选育CC基因型个体，有利于提高瘦肉率，降低背膘厚。
表2硒都黑猪COL6A2基因rs81213581C>T多态性与胴体性状关联分析
注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或者无字母表示差异不显著。μ：均值。SE：标准误差。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。
Claims (3)
1.检测猪胴体性状关联分子标记的引物在硒都黑猪胴体性状的筛选与育种中的应用，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示且第407碱基为T或C；
所述硒都黑猪胴体性状选自眼肌高、眼肌面积、平均背膘厚、肩部最厚处膘厚、6~7肋间膘厚、胸腰椎间膘厚、臀部膘厚、瘦肥肉比例、花油重和板油重中的至少一种；
CC基因型个体眼肌高、眼肌面积、瘦肥肉比例显著高于CT基因型个体和TT基因型个体；
CC基因型个体平均背膘厚、肩部最厚处膘厚、6~7肋间膘厚、胸腰椎间膘厚、臀部膘厚、花油重显著低于CT基因型个体和TT基因型个体；
CT基因型个体板油重显著高于CC基因型个体和TT基因型个体；
所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3~4所示。
2.检测猪胴体性状关联分子标记的试剂盒在硒都黑猪胴体性状的筛选与育种中的应用，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示且第407碱基为T或C；
所述硒都黑猪胴体性状选自眼肌高、眼肌面积、平均背膘厚、肩部最厚处膘厚、6~7肋间膘厚、胸腰椎间膘厚、臀部膘厚、瘦肥肉比例、花油重和板油重中的至少一种；
CC基因型个体眼肌高、眼肌面积、瘦肥肉比例显著高于CT基因型个体和TT基因型个体；
CC基因型个体平均背膘厚、肩部最厚处膘厚、6~7肋间膘厚、胸腰椎间膘厚、臀部膘厚、花油重显著低于CT基因型个体和TT基因型个体；
CT基因型个体板油重显著高于CC基因型个体和TT基因型个体；
所述试剂盒包括分子标记引物以及其他PCR扩增所需试剂，所述分子标记引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3~4所示。
3.硒都黑猪胴体性状的检测方法，包括：
获取待测硒都黑猪基因组DNA；
通过如权利要求1中所述的引物进行PCR扩增；
根据扩增产物的核苷酸序列检测如SEQ ID NO.2所示的第407碱基处的基因型；
根据所述基因型确定所述硒都黑猪胴体性状；
所述硒都黑猪胴体性状选自眼肌高、眼肌面积、平均背膘厚、肩部最厚处膘厚、6~7肋间膘厚、胸腰椎间膘厚、臀部膘厚、瘦肥肉比例、花油重和板油重中的至少一种；
CC基因型个体眼肌高、眼肌面积、瘦肥肉比例显著高于CT基因型个体和TT基因型个体；
CC基因型个体平均背膘厚、肩部最厚处膘厚、6~7肋间膘厚、胸腰椎间膘厚、臀部膘厚、花油重显著低于CT基因型个体和TT基因型个体；
CT基因型个体板油重显著高于CC基因型个体和TT基因型个体。
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