CN113151497B

CN113151497B - 一种用于检测奶牛产奶性状的COL6A1基因SNPs标记及其应用

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Publication number: CN113151497B
Application number: CN202110446582.6A
Authority: CN
Inventors: 杨宇泽; 路永强; 唐韶青; 孙东晓; 林珊; 韩博; 刘林; 麻柱; 吕小青; 常卓; 赵春颖; 刘亚楠
Original assignee: Beijing Animal Husbandry Station
Current assignee: Beijing Animal Husbandry Station
Priority date: 2021-04-25
Filing date: 2021-04-25
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2041-04-25
Also published as: CN113151497A

Abstract

本发明公开了一种用于检测奶牛产奶性状的COL6A1基因SNPs标记及其应用。本发明提供了检测如下14个SNP位点基因型的物质在鉴定或辅助鉴定奶牛产奶性状中的应用：1:g.145667090C>T、1:g.145668599C>G、1:g.145669859T>C、1:g.145673966T>C、1:g.145676602G>A、1:g.145676653T>C、1:g.145677680C>T、1:g.145677709A>G、1:g.145677953A>G等；各个位点与305天产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量或乳蛋白率相关，可用于奶牛选育。

Description

一种用于检测奶牛产奶性状的COL6A1基因SNPs标记及其应用

技术领域

本发明涉及一种分子标记及其应用；特别涉及一种用于检测奶牛产奶性状的COL6A1基因SNPs标记及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

VI型胶原α1链(collagen type VI alpha 1chain,COL6A1)是一个蛋白质超家族。VI型胶原蛋白是细胞外基质蛋白，是微纤维的主要结构成分，由α1(VI)、α2(VI)和α3(VI)链的异源三聚体作为其共同的结构元件。VI型胶原蛋白具有相当重要的意义，在维持各种组织的完整性中发挥作用，是连接细胞与其周围环境的锚定网络(Everts等人，1998年；Kuo等人，1997年)。

研究表明，胶原蛋白VI是乳腺细胞外基质的重要组成成分(Siu等人，2008年)。VI型胶原的多域结构不仅使其适合与细胞外环境成分(如II型胶原、核心蛋白聚糖、纤维调节蛋白、透明质酸和纤维连接蛋白)的相互作用，而且可以通过整合素与细胞表面特异性结合(Loeser等人1997)。根据其可能与细胞的相互作用，VI型胶原在各组织中均有表达(Chang和Poole等人，1996；Chang等人，1997；Hagiwara等人，1993；Hambach等人，1998；Poole等人，1992)。COL6A1基因的缺失会影响乳腺癌细胞间充质表型和干性。同时，COL6A1参与Fzd7-Wnt5b信号传导，诱导乳腺瘤的发生和转移(Ping等人，2020)。

牛的COL6A1基因位于第1号染色体上，全长19247bp(ARS-UCD1.2)，包含35个外显子和34个内含子，其mRNA全长3084bp，共编码1027个氨基酸。

聚合酶链式反应(PCR)技术是一种特异性DNA体外扩增技术。以少量的DNA为模板，经过变性-退火-延伸的多次循环，以接近指数扩增的形式产生大量的目标DNA分子，目前，该技术已经成为最常用、也最重要的分子生物学技术之一。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳后测序即可进行基因多态的鉴定工作，检测方法简单易行。

发明内容

本发明一个目的是提供用于检测如下14个SNP位点中至少一种SNP位点的基因型的物质的如下用途。

本发明提供了用于检测如下14个SNP位点中至少一种SNP位点的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定奶牛产奶性状中的应用；

所述14个SNP位点为SNP位点1:g.145667090C>T、SNP位点1:g.145668599C>G、SNP位点1:g.145669859T>C、SNP位点1:g.145673966T>C、SNP位点1:g.145676602G>A、SNP位点1:g.145676653T>C、SNP位点1:g.145677680C>T、SNP位点1:g.145677709A>G、SNP位点1:g.145677953A>G、SNP位点1:g.145682517G>A、SNP位点1:g.145682638A>G、SNP位点1:g.145684727G>A、SNP位点1:g.145686763T>C和SNP位点1:g.145686889C>T。

如下14个SNP位点中至少一种SNP位点作为检测靶标在鉴定或辅助鉴定奶牛产奶性状中的应用也是本发明保护的范围；

上述应用中，所述产奶性状为产奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量。

在本发明的实施例中，上述用于检测如下14个SNP位点中至少一种SNP位点的基因型的物质为分别对应扩增14个SNP位点中任一种SNP位点的引物对(具体为引物对1-9)或分别对应特异结合14个SNP位点中任一种SNP位点的探针(具体为探针1-12)。

本发明另一个目的是提供如下的方法。

本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定奶牛产奶性状的方法，为如下1)-14)中任一种：

1)包括如下步骤：检测供试奶牛COL6A1基因中SNP位点1:g.145667090C>T的基因型；所述SNP位点1:g.145667090C>T的基因型为CC或TT；

所述SNP位点1:g.145667090C>T基因型为TT的供试奶牛的产奶性状(具体为产奶量和/或乳脂量)优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145667090C>T基因型为CC的供试奶牛；

2)包括如下步骤：检测供试奶牛COL6A1基因中SNP位点1:g.145668599C>G的基因型；所述SNP位点1:g.145668599C>G的基因型为GG或CC；

所述SNP位点1:g.145668599C>G基因型为GG的供试奶牛的产奶性状(具体为产奶量和/或乳脂量)优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145668599C>G基因型为CC的供试奶牛；

3)包括如下步骤：检测供试奶牛COL6A1基因中SNP位点1:g.145669859T>C的基因型；所述SNP位点1:g.145669859T>C的基因型为TT或CC；

所述SNP位点1:g.145669859T>C基因型为TT的供试奶牛的产奶性状(具体为产奶量、乳脂量和/或乳蛋白量)优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145669859T>C基因型为CC的供试奶牛；

4)包括如下步骤：检测供试奶牛COL6A1基因中SNP位点1:g.145673966T>C的基因型；所述SNP位点1:g.145673966T>C的基因型为TT或CC；

所述SNP位点1:g.145673966T>C基因型为TT的供试奶牛的产奶性状(具体为产奶量、乳脂量和/或乳蛋白量)优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145673966T>C基因型为CC的供试奶牛；

5)包括如下步骤：检测供试奶牛COL6A1基因中SNP位点1:g.145676602G>A的基因型；所述SNP位点1:g.145676602G>A的基因型为AA或GG；

所述SNP位点1:g.145676602G>A基因型为AA的供试奶牛的产奶性状(具体为乳脂量)优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145676602G>A基因型为GG的供试奶牛；

6)包括如下步骤：检测供试奶牛COL6A1基因中SNP位点1:g.145676653T>C的基因型；所述SNP位点1:g.145676653T>C的基因型为CC或TT；

所述SNP位点1:g.145676653T>C基因型为CC的供试奶牛的产奶性状(具体为乳脂量)优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145676653T>C基因型为TT的供试奶牛；

7)包括如下步骤：检测供试奶牛COL6A1基因中SNP位点1:g.145677680C>T的基因型；所述SNP位点1:g.145677680C>T的基因型为TT或CC；

所述SNP位点1:g.145677680C>T基因型为TT的供试奶牛的产奶性状(具体为乳脂量)优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145677680C>T基因型为CC的供试奶牛；

8)包括如下步骤：检测供试奶牛COL6A1基因中SNP位点1:g.145677709A>G的基因型；所述SNP位点1:g.145677709A>G的基因型为AA或GG；

所述SNP位点1:g.145677709A>G基因型为AA的待测奶牛的产奶性状(具体为乳脂量)优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145677709A>G基因型为GG的待测奶牛；

9)包括如下步骤：检测供试奶牛COL6A1基因中SNP位点1:g.145677953A>G的基因型；所述SNP位点1:g.145677953A>G的基因型为GG或AA；

所述SNP位点1:g.145677953A>G基因型为GG的供试奶牛的产奶性状(具体为乳脂量)优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145677953A>G基因型为AA的供试奶牛；

10)包括如下步骤：检测供试奶牛COL6A1基因中SNP位点1:g.145682517G>A的基因型；所述SNP位点1:g.145682517G>A的基因型为GG或AA；

所述SNP位点1:g.145682517G>A基因型为GG的供试奶牛的产奶性状(具体为乳脂量)优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145682517G>A基因型为AA的供试奶牛；

11)包括如下步骤：检测供试奶牛COL6A1基因中SNP位点1:g.145682638A>G的基因型；所述SNP位点1:g.145682638A>G的基因型为AA或GG；

所述SNP位点1:g.145682638A>G基因型为AA的供试奶牛的产奶性状(具体为乳脂量)优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145682638A>G基因型为GG的供试奶牛；

12)包括如下步骤：检测供试奶牛COL6A1基因中SNP位点1:g.145684727G>A的基因型；所述SNP位点1:g.145684727G>A的基因型为GG或AA；

所述SNP位点1:g.145684727G>A基因型为GG的供试奶牛的产奶性状(具体为乳脂量)优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145684727G>A基因型为AA的供试奶牛；

13)包括如下步骤：检测供试奶牛COL6A1基因中SNP位点1:g.145686763T>C的基因型；所述SNP位点1:g.145686763T>C的基因型为TT或CC；

所述SNP位点1:g.145686763T>C基因型为TT的供试奶牛的产奶性状(具体为乳脂量)优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145686763T>C基因型为CC的供试奶牛；

14)包括如下步骤：检测供试奶牛COL6A1基因中SNP位点1:g.145686889C>T的基因型；所述SNP位点1:g.145686889C>T的基因型为TT或CC；

所述SNP位点1:g.145686889C>T基因型为TT的供试奶牛的产奶性状(具体为乳脂量)优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145686889C>T基因型为CC的供试奶牛。

上述方法在奶牛筛选或奶牛育种中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，选取如下任一种的供试奶牛用于产奶或育种；

所述SNP位点1:g.145667090C>T基因型为TT的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145668599C>G基因型为GG的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145669859T>C基因型为TT的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145673966T>C基因型为TT的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145676602G>A基因型为AA的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145676653T>C基因型为CC的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145677680C>T基因型为TT的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145677709A>G基因型为AA的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145677953A>G基因型为GG的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145682517G>A基因型为GG的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145682638A>G基因型为AA的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145684727G>A基因型为GG的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145686763T>C基因型为TT的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145686889C>T基因型为TT的供试奶牛。

本发明还提供了引物对1-9中任一一种或引物组合；

所述引物组合由所述引物对1至所述引物对9组成；

所述引物对1为引物1F和引物1R组成的引物对；

所述引物对2为引物5F和引物5R组成的引物对；

所述引物对3为引物6F和引物6R组成的引物对；

所述引物对4为引物10F和引物10R组成的引物对；

所述引物对5为引物13F和引物13R组成的引物对；

所述引物对6为引物15F和引物15R组成的引物对；

所述引物对7为引物18F和引物18R组成的引物对；

所述引物对8为引物19F和引物19R组成的引物对；

所述引物对9为引物21F和引物21R组成的引物对；

所述引物1F为序列表中序列1所示的单链DNA分子或将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列1具有相同功能的核苷酸；

所述引物1R为序列表中序列2所示的单链DNA分子或将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的核苷酸；

所述引物5F为序列表中序列3所示的单链DNA分子或将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列3具有相同功能的核苷酸；

所述引物5R为序列表中序列4所示的单链DNA分子或将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列4具有相同功能的核苷酸；

所述引物6F为序列表中序列5所示的单链DNA分子或将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列5具有相同功能的核苷酸；

所述引物6R为序列表中序列6所示的单链DNA分子或将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列6具有相同功能的核苷酸；

所述引物10F为序列表中序列7所示的单链DNA分子或将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列7具有相同功能的核苷酸；

所述引物10R为序列表中序列8所示的单链DNA分子或将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列8具有相同功能的核苷酸；

所述引物13F为序列表中序列9所示的单链DNA分子或将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列9具有相同功能的核苷酸；

所述引物13R为序列表中序列10所示的单链DNA分子或将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列10具有相同功能的核苷酸；

所述引物15F为序列表中序列11所示的单链DNA分子或将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列11具有相同功能的核苷酸；

所述引物15R为序列表中序列12所示的单链DNA分子或将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列12具有相同功能的核苷酸；

所述引物18F为序列表中序列13所示的单链DNA分子或将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列13具有相同功能的核苷酸；

所述引物18R为序列表中序列14所示的单链DNA分子或将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列14具有相同功能的核苷酸；

所述引物19F为序列表中序列15所示的单链DNA分子或将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列15具有相同功能的核苷酸；

所述引物19R为序列表中序列16所示的单链DNA分子或将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列16具有相同功能的核苷酸；

所述引物21F为序列表中序列17所示的单链DNA分子或将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列17具有相同功能的核苷酸；

所述引物21R为序列表中序列18所示的单链DNA分子或将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列18具有相同功能的核苷酸。

本发明还提供了如下探针1-12中任一一种探针或探针任意组合；

所述探针1为序列表中序列28所示的单链DNA分子或将序列28删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列28具有相同功能的核苷酸；

所述探针2为序列表中序列29所示的单链DNA分子或将序列29删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列29具有相同功能的核苷酸；

所述探针3为序列表中序列30所示的单链DNA分子或将序列30删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列30具有相同功能的核苷酸；

所述探针4为序列表中序列31所示的单链DNA分子或将序列31删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列31具有相同功能的核苷酸；

所述探针5为序列表中序列32所示的单链DNA分子或将序列32删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列32具有相同功能的核苷酸；

所述探针6为序列表中序列33所示的单链DNA分子或将序列33删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列33具有相同功能的核苷酸；

所述探针7为序列表中序列34所示的单链DNA分子或将序列34删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列34具有相同功能的核苷酸；

所述探针8为序列表中序列35所示的单链DNA分子或将序列35删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列35具有相同功能的核苷酸；

所述探针9为序列表中序列36所示的单链DNA分子或将序列36删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列36具有相同功能的核苷酸；

所述探针10为序列表中序列37所示的单链DNA分子或将序列37删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列37具有相同功能的核苷酸；

所述探针11为序列表中序列38所示的单链DNA分子或将序列38删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列38具有相同功能的核苷酸；

所述探针12为序列表中序列39所示的单链DNA分子或将序列39删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列39具有相同功能的核苷酸。

上述引物对1-9中任一一种或引物组合或上述探针1-12中任一一种或探针任意组合的应用，为如下(a)-(f)中任一种：

(a)鉴定或辅助鉴定奶牛产奶性状；

(b)奶牛筛选；

(c)奶牛育种；

(d)制备用于鉴定或辅助鉴定奶牛产奶性状的试剂盒；

(e)制备奶牛筛选的试剂盒；

(f)制备奶牛育种的试剂盒。

本发明的实验证明，本发明发现了一种与奶牛产奶性状相关的分子标记及其应用，1:g.145667090C>T和/或1:g.145668599C>G分子标记与305天产奶量和乳脂量达到显著或极显著水平的关联(P＝0.0013-0.0092)；分子标记1:g.145669859T>C与305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率达极显著水平关联(P<0.0001～P＝0.0049)；分子标记1:g.145673966T>C与305天产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率达显著或极显著水平关联(P＝0.0006～P＝0.0409)；分子标记1:g.145676602G>A和/或1:g.145676653T>C和/或1:g.145677680C>T和/或和/或1:g.145677953A>G和/或1:g.145682517G>A和/或1:g.145682638A>G和/或1:g.145684727G>A和/或1:g.145686763T>C和/或1:g.145686889C>T分子标记与乳脂量、乳脂率和乳蛋白率达到显著或极显著水平的关联(P＝0.0009～P＝0.0409)；分子标记1:g.145677709A>G与乳脂量达到显著水平的关联(P＝0.0442)与乳脂率达到极显著水平的关联(P＝0.0021)。

附图说明

图1为1:g.145667090C>T、1:g.145668599C>G、1:g.145669859T>C、1:g.145673966T>C、1:g.145676602G>A、1:g.145676653T>C、1:g.145677680C>T、1:g.145677709A>G、1:g.145677953A>G、1:g.145682517G>A、1:g.145682638A>G、1:g.145684727G>A、1:g.145686763T>C和1:g.145686889C>T的突变位置。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

中国荷斯坦公牛冻精样品来源于北京首农畜牧绿荷牛业。中国荷斯坦母牛：北京首农畜牧绿荷牛业。

下述实施例中的产奶量为个体305天产奶量指自母牛产犊第一天开始到第305天为止的产奶总量。当实际挤奶天数不足305天时，以实际乳脂量作为305天乳脂量；当实际挤奶天数超出305天，306天以后的乳脂量不计在内。

下述实施例中的乳脂量指的是305天乳脂量，305天乳脂量＝乳脂率×305天产奶量，乳脂率由每月DHI(DHI，Dairy Herd Improvement)测定所得，通过同一泌乳期内3次以上DHI数据绘制泌乳曲线计算可得该泌乳期平均乳脂率；

下述实施例中的乳蛋白量指的是305天乳蛋白量，305天乳蛋白量＝乳蛋白率×305天产奶量，乳蛋白率由每月DHI(DHI，Dairy Herd Improvement)测定所得，通过同一泌乳期内3次以上DHI数据绘制泌乳曲线计算可得该泌乳期平均乳蛋白率。

上述产奶量、乳脂量和乳蛋白量均为第一泌乳期(第一次生产后的泌乳期)统计的结果。

实施例1、相关基础研究

发明人所在课题组以3头中国荷斯坦牛三个泌乳阶段(干奶期，泌乳初期，泌乳高峰期)的肝脏组织为试验材料，对其进行RNA-seq和small RNA-seq测序分析，整合RNA-seq和small RNA-seq测序结果，根据ceRNA调控机制，构建三个比较组lncRNA-miRNA-mRNA互作网络图(competing endogenous RNAs,ceRNAs)。其中，COL6A1基因被鉴定为为影响肝脏代谢活动的重要ceRNA对中的功能基因(Ruobing Liang,Bo Han,Dongxiao Sun*et al.UsingRNA sequencing to identify putative competing endogenous RNAs(ceRNAs)potentially regulating fat metabolism in bovine liver.Scientific reports 7,6396,2017.)。

实施例2、基因多态性检测

一、选择北京地区共40头中国荷斯坦公牛作为基因多态性检测的试验群体，将40头中国荷斯坦公牛随机均分为两组，利用核酸分析仪准确测定其冻精基因组DNA的浓度，并将这些DNA均稀释成浓度为50ng/μL，等量混合成两个池DNA，作为模板进行PCR扩增。

二、根据牛COL6A1基因序列(位于GenBank登录号为NC_037328.1的序列中，更新日为2018年4月11日)，设计如表1的22对引物。

表1为COL6A1基因PCR扩增引物序列信息

三、以步骤一得到的池DNA为模板，分别以表1中各组引物作为正向引物和反向引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR反应体系和PCR反应条件见表2和表3。

表2为PCR反应体系

表3为PCR反应条件

表2中的正向引物F和反向引物R分别表示1F和1R、2F和2R等。

四、将PCR扩增产物进行测序。

将PCR扩增产物进行测序，结果发现公牛群体COL6A1基因上游2000bp的侧翼序列中存在2个SNP标记、第35外显子中存在2个SNP标记，内含子区存在10个SNP标记，如表4所示，突变位置如图1所示。

表4为COL6A1基因发现的14个SNPs

基因位置	SNPs	物理位置	突变	突变类型
					upstream	1:g.145667090C>T	chr1:g.145667090	C/T	SNP
upstream	1:g.145668599C>G	chr1:g.145668599	C/G	SNP
					instron	1:g.145669859T>C	chr1:g.145669859	T/C	SNP
instron	1:g.145673966T>C	chr1:g.145673966	T/C	SNP
					instron	1:g.145676602G>A	chr1:g.145676602	G/A	SNP
instron	1:g.145676653T>C	chr1:g.145676653	T/C	SNP
					instron	1:g.145677680C>T	chr1:g.145677680	C/T	SNP
instron	1:g.145677709A>G	chr1:g.145677709	A/G	SNP
					instron	1:g.145677953A>G	chr1:g.145677953	A/G	SNP
instron	1:g.145682517G>A	chr1:g.145682517	G/A	SNP
					instron	1:g.145682638A>G	chr1:g.145682638	A/G	SNP
instron	1:g.145684727G>A	chr1:g.145684727	G/A	SNP
					exon35	1:g.145686763T>C	chr1:g.145686763	T/C	SNP
exon35	1:g.145686889C>T	chr1:g.145686889	C/T	SNP

上述发现的COL6A1基因的14个SNP中，

1:g.145667090C>T是以牛的基因组DNA为模板，1F和1R为引物进行PCR扩增得到的产物进行测序分析，该位点为PCR产物(序列19)的自5’末端起第448位，即为牛基因组ARS-UCD1.2版本参考序列(GenBank登录号为NC_037328.1，提交日为11-MAY-2018)1号染色体上第145667090个核苷酸位点，该位点的碱基可以为C或T；该位点的基因型为CC、TT或CT。

1:g.145668599C>G是以牛的基因组DNA为模板，3F和3R为引物进行PCR扩增得到的产物进行测序分析，该位点为PCR产物(序列20)的自5’末端起第724位，即为牛基因组ARS-UCD1.2版本参考序列1号染色体上第145668599个核苷酸位点，该位点的碱基可以为C或G；该位点的基因型为CC、GG或CG。

1:g.145669859T>C是以牛的基因组DNA为模板，6F和6R为引物进行PCR扩增得到的产物进行测序分析，该位点为PCR产物(序列21)的自5’末端起第590位，即为牛基因组ARS-UCD1.2版本参考序列1号染色体上第145669859个核苷酸位点，该位点的碱基可以为T或C；该位点的基因型为TT、CC或TC。

1:g.145673966T>C是以牛的基因组DNA为模板，10F和10R为引物进行PCR扩增得到的产物进行测序分析，该位点为PCR产物(序列22)的自5’末端起第341位，即为牛基因组ARS-UCD1.2版本参考序列1号染色体上第145673966个核苷酸位点，该位点的碱基可以为T或C；该位点的基因型为TT、CC或TC。

1:g.145676602G>A是以牛的基因组DNA为模板，13F和13R为引物进行PCR扩增得到的产物进行测序分析，该位点为PCR产物(序列23)的自5’末端起第371位，即为牛基因组ARS-UCD1.2版本参考序列17号染色体上第145676602个核苷酸位点，该位点的碱基可以为G或A；该位点的基因型为GG、AA或GA。

1:g.145676653T>C是以牛的基因组DNA为模板，13F和13R为引物进行PCR扩增得到的产物进行测序分析，该位点为PCR产物(序列23)的自5’末端起第422位，即为牛基因组ARS-UCD1.2版本参考序列1号染色体上第145676653个核苷酸位点，该位点的碱基可以为T或C；该位点的基因型为TT、CC或TC。

1:g.145677680C>T是以牛的基因组DNA为模板，15F和15R为引物进行PCR扩增得到的产物进行测序分析，该位点为PCR产物(序列24)的自5’末端起第423位，即为牛基因组ARS-UCD1.2版本参考序列1号染色体上第145677680个核苷酸位点，该位点的碱基可以为C或T；该位点的基因型为CC、TT或CT。

1:g.145677709A>G是以牛的基因组DNA为模板，15F和15R为引物进行PCR扩增得到的产物进行测序分析，该位点为PCR产物(序列24)的自5’末端起第452位，即为牛基因组ARS-UCD1.2版本参考序列1号染色体上第145677709个核苷酸位点，该位点的碱基可以为A或G；该位点的基因型为AA、GG或AG。

1:g.145677953A>G是以牛的基因组DNA为模板，15F和15R为引物进行PCR扩增得到的产物进行测序分析，该位点为PCR产物(序列24)的自5’末端起第696位，即为牛基因组ARS-UCD1.2版本参考序列1号染色体上第145677953个核苷酸位点，该位点的碱基可以为A或G；该位点的基因型为AA、GG或AG。

1:g.145682517G>A是以牛的基因组DNA为模板，18F和18R为引物进行PCR扩增得到的产物进行测序分析，该位点为PCR产物(序列25)的自5’末端起第135位，即为牛基因组ARS-UCD1.2版本参考序列1号染色体上第145682517个核苷酸位点，该位点的碱基可以为G或A；该位点的基因型为GG、AA或GA。

1:g.145682638A>G是以牛的基因组DNA为模板，18F和18R为引物进行PCR扩增得到的产物进行测序分析，该位点为PCR产物(序列25)的自5’末端起第256位，即为牛基因组ARS-UCD1.2版本参考序列1号染色体上第145682638个核苷酸位点，该位点的碱基可以为A或G；该位点的基因型为AA、GG或AG。

1:g.145684727G>A是以牛的基因组DNA为模板，19F和19R为引物进行PCR扩增得到的产物进行测序分析，该位点为PCR产物(序列26)的自5’末端起第181位，即为牛基因组ARS-UCD1.2版本参考序列1号染色体上第145684727个核苷酸位点，该位点的碱基可以为G或A；该位点的基因型为GG、AA或GA。

1:g.145686763T>C是以牛的基因组DNA为模板，21F和21R为引物进行PCR扩增得到的产物进行测序分析，该位点为PCR产物(序列27)的自5’末端起第368位，即为牛基因组ARS-UCD1.2版本参考序列1号染色体上第145686763个核苷酸位点，该位点的碱基可以为T或C；该位点的基因型为TT、CC或TC。

1:g.145686889C>T是以牛的基因组DNA为模板，21F和21R为引物进行PCR扩增得到的产物进行测序分析，该位点为PCR产物(序列27)的自5’末端起第484位，即为牛基因组ARS-UCD1.2版本参考序列1号染色体上第145686889个核苷酸位点，该位点的碱基可以为C或T；该位点的基因型为CC、TT或CT。

实施例3、关联分析

一、获得供试群体

供试群体由947头中国荷斯坦母牛组成。

二、进行基因型分型

用靶向测序基因型(Genotyping By Target Sequencing，GBTS)技术对不同的SNPs位点进行基因型的检测，分型试验由石家庄博瑞迪生物技术有限公司完成，具体如下：

供试群体中的每个个体，分别进行基因型分型。

1、探针设计

每个探针长120bp，可捕获探针上下游50bp，确保覆盖标记区域及来自参考基因组上每个标记区域的所有探针的特异性，最后通过基于半导体的原位合成方法合成探针组。具体探针序列信息如下(下面探针序列中的粗体碱基为对应的SNP位点的碱基)：

SNP位点1:g.145667090C>T检测探针1序列(序列28)为：

，探针1起止位置为1号染色体145667031bp至145667150bp；

SNP位点1:g.145668599C>G检测探针2序列(序列29)为：

，探针2起止位置为1号染色体145668540bp至145668659bp；

SNP位点1:g.145669859T>C检测探针3序列(序列30)为：

，探针3起止位置为1号染色体145669805bp至145669924bp；

SNP位点1:g.145673966T>C检测探针4序列(序列31)为：

，探针4起止位置为1号染色体145673907bp至145674026bp；

SNP位点1:g.145676602G>A检测探针和SNP位点1:g.145676653T>C检测探针均为探针5(序列32)，序列为：

，探针5起止位置为1号染色体145676568bp至145676687bp；

SNP位点1:g.145677680C>T检测探针和SNP位点1:g.145677709A>G检测探针均为探针6(序列33)，序列为：

，探针6起止位置为1号染色体145677648bp至145677767bp；

SNP位点1:g.145677953A>G检测探针7序列(序列34)为：

，探针7起止位置为1号染色体145677894bp至145678013bp；

SNP位点1:g.145682517G>A检测探针8序列(序列35)为：

，探针8起止位置为1号染色体145682458bp至145682577bp；

SNP位点1:g.145682638A>G检测探针9序列(序列36)为：

，探针9起止位置为1号染色体145682579bp至145682698bp；

SNP位点1:g.145684727G>A检测探针10序列(序列37)为：

，探针10起止位置为1号染色体145684668bp至145684787bp；

SNP位点1:g.145686763T>C检测探针11序列(序列38)为：

，探针11起止位置为1号染色体145686704bp至145686823bp；

SNP位点1:g.145686889C>T检测探针12序列(序列39)为：

，探针12起止位置为1号染色体145686830 bp至145686949 bp。

2、DNA文库构建

构建DNA文库主要通过以下四个步骤：

1)取供试个体的血液，采用北京天根生化科技有限公司血液基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取基因组DNA；

2)通过由超声波处理将DNA片段化；

3)使用末端修复试剂修复片段化DNA的末端并添加A尾；

4)通过T4连接酶将Y型衔接子与片段DNA连接；

5)通过条形码引物和高保真DNA聚合酶扩增连接的DNA，对文库进行扩增并通过用不同的条形码引物标记来区分样品。

3、探针杂交

采用石家庄博瑞迪生物技术有限公司产品GenoBaits Bovine 197 Panel(PHD0035_Bov197_V1.0)进行探针杂交，步骤如下：

1)文库混合物：将DNA文库，特殊阻滞剂和通用衔接子阻滞剂在试管中混合，然后抽成干粉；

2)文库杂交：将探针和杂交缓冲液置于试管中，在65°PCR条件下杂交16 h；

3)目标捕获：将

MyOneTM链霉亲和素C1和结合缓冲液放入杂交产物中，以选择性地拾取目标片段，但去除非目标片段；

4)文库扩增：通过文库扩增引物和高保真DNA聚合酶扩增所选片段；

5)产物纯化：使用Beckman AMPure Beads进行两次纯化；

6)文库质量检查：使用qubit和qPCR定量文库浓度，并使用照明HiSeq X进行测序。

4、序列数据的计算机分析

1)对测序数据进行质量控制；

2)使用FLASH将两个末端的读数合并，然后使用BBMap将测序数据与参考B73基因组进行比较。对准结果以SAM/BAM(二进制对准图)格式保存；

3)为了比较PCR产生的重复序列，使用Picard软件处理比对结果，并将最终结果保存为BAM文件以进行进一步分析；

4)利用FreeBayes检测到了每个个体的基因型。

三、检测产奶性状

供试群体中的每头牛，分别进行产奶性状检测。

产奶性状包括如下五个指标：产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率。

每个个体的记录依次包括牛只个体号、父号、母号、祖父号、祖母号、外祖父号、外祖母号、出生日期、泌乳期、产犊日期、产奶量、乳脂率和乳蛋白率13项信息。

乳脂量＝乳脂率×产奶量；

乳蛋白量＝乳蛋白率×产奶量。

四、单个SNP位点与性状的关联分析模型

采用SAS 9.2软件中的MIXED过程对产奶性状的五个指标和基因型进行关联分析。关联分析采用动物模型，具体模型如下：

Y＝μ+hys+b×M+G+a+e

其中，Y：产奶性状(个体产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量或乳蛋白率)观察值，μ：总体均值，hys：场年季效应，b：协变量M的回归系数，M：产犊月龄效应，G：基因型效应，a：个体随机加性遗传效应，e：随机残差效应。

COL6A1基因如下14个SNP位点与产奶性状关联分析结果如表5所示。

表5为COL6A1基因与产奶性状关联分析(最小二乘均值±标准误)

注：^*P<0.05，表示差异显著；^**P<0.01，表示差异极显著。^a,b同一列数据有不同上标表示差异显著；^A,B同一列数据有不同上标表示差异极显著。

关联分析结果表明，分子标记1:g.145667090C>T和1:g.145668599C>G分子标记与产奶量和乳脂量达到显著或极显著水平的关联(P＝0.0013～0.0092)，对产奶量和乳脂量性状优势等位基因型分别为T和G；1:g.145669859T>C分子标记与产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率达极显著水平关联(P<0.0001～P＝0.0049)，对于产奶量、乳脂量对乳蛋白量优势等位基因型分别为T，对于乳脂率和乳蛋白率优势等位基因型均为C；分子标记1:g.145673966T>C与产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率达显著或极显著水平关联(P＝0.0006～P＝0.0409)，对于产奶量、乳脂量对乳蛋白量优势等位基因型分别为T，对于乳脂率和乳蛋白率优势等位基因型均为C；分子标记1:g.145676602G>A、1:g.145676653T>C、1:g.145677680C>T、1:g.145677953A>G、1:g.145682517G>A、1:g.145682638A>G、1:g.145684727G>A、1:g.145686763T>C和1:g.145686889C>T与乳脂量、乳脂率和乳蛋白率达到显著或极显著水平的关联(P＝0.0009～P＝0.0409)，对乳脂量优势等位基因型分别为A、C、T、G、G、A、G、T和T，对于乳脂率和乳蛋白率优势等位基因型分别为A、C、T、G、A、G、A、C和T；分子标记1:g.145677709A>G与乳脂量达到显著水平的关联(P＝0.0442)与乳脂率达到极显著水平的关联(P＝0.0021)，对于乳脂量优势等位基因型为A，对于乳脂率优势等位基因型为G。

因此，可以根据确定如下14种SNP位点的基因型来判断待测奶牛的产奶性状：

SNP位点1:g.145667090C>T基因型为TT的待测奶牛的产奶量和/或乳脂量高于SNP位点1:g.145667090C>T基因型为CC的待测奶牛；

SNP位点1:g.145668599C>G基因型为GG的待测奶牛的产奶量和/或乳脂量高于SNP位点1:g.145668599C>G基因型为CC的待测奶牛；

SNP位点1:g.145669859T>C基因型为TT的待测奶牛的产奶量、乳脂量和/或乳蛋白量高于SNP位点1:g.145669859T>C基因型为CC的待测奶牛；

SNP位点1:g.145673966T>C基因型为TT的待测奶牛的产奶量、乳脂量和/或乳蛋白量高于SNP位点1:g.145673966T>C基因型为CC的待测奶牛；

SNP位点1:g.145676602G>A基因型为AA的待测奶牛的乳脂量高于SNP位点1:g.145676602G>A基因型为GG的待测奶牛；

SNP位点1:g.145676653T>C基因型为CC的待测奶牛的乳脂量高于SNP位点1:g.145676653T>C基因型为TT的待测奶牛；

SNP位点1:g.145677680C>T基因型为TT的待测奶牛的乳脂量高于SNP位点1:g.145677680C>T基因型为CC的待测奶牛；

SNP位点1:g.145677709A>G基因型为AA的待测奶牛的乳脂量高于SNP位点1:g.145677709A>G基因型为GG的待测奶牛；

SNP位点1:g.145677953A>G基因型为GG的待测奶牛的乳脂量高于SNP位点1:g.145677953A>G基因型为AA的待测奶牛；

SNP位点1:g.145682517G>A基因型为GG的待测奶牛的乳脂量高于SNP位点1:g.145682517G>A基因型为AA的待测奶牛；

SNP位点1:g.145682638A>G基因型为AA的待测奶牛的乳脂量高于SNP位点1:g.145682638A>G基因型为GG的待测奶牛；

SNP位点1:g.145684727G>A基因型为GG的待测奶牛的乳脂量高于SNP位点1:g.145684727G>A基因型为AA的待测奶牛；

SNP位点1:g.145686763T>C基因型为TT的待测奶牛的乳脂量高于SNP位点1:g.145686763T>C基因型为CC的待测奶牛；

SNP位点1:g.145686889C>T基因型为TT的待测奶牛的乳脂量高于SNP位点1:g.145686889C>T基因型为CC的待测奶牛。

上述确定各个SNP位点的基因型可以通过靶向测序基因型(Genotyping ByTarget Sequencing，GBTS)技术对不同的SNPs位点进行基因型的检测：

各个SNP位点基因型通过对应引物扩增后测序确定基因型；也可以通过上述对应的探针杂交后，测序检测基因型。

五、遗传效应分析

利用SAS 9.2软件进行SNP加性效应、显性效应及替代效应显著性检验。

基本计算公式如下：

a＝(AA-BB)/2，d＝AB-(AA+BB)/2，α＝A+d(q-p),a为加性效应，d为显性效应，α为等位基因替代效应；AA、AB、BB为相应基因型产奶性状最小二乘均值。

各位点的等位基因频率如下：

位点1:g.145667090C>T：p(C)＝0.801，q(T)＝0.199；

位点1:g.145668599C>G：p(C)＝0.801，q(G)＝0.199；

位点1:g.145669859T>C：p(C)＝0.210，q(T)＝0.790；

位点1:g.145673966T>C：p(C)＝0.306，q(T)＝0.694；

位点1:g.145676602G>A：p(A)＝0.306，q(G)＝0.694；

位点1:g.145676653T>C：p(C)＝0.306，q(T)＝0.694；

位点1:g.145677680C>T：p(C)＝0.694，q(T)＝0.306；

位点1:g.145677709A>G：p(A)＝0.598，q(G)＝0.402；

位点1:g.145677953A>G：p(A)＝0.694，q(G)＝0.306；

位点1:g.145682517G>A：p(A)＝0.410，q(G)＝0.590；

位点1:g.145682638A>G：p(A)＝0.589，q(G)＝0.411；

位点1:g.145684727G>A：p(A)＝0.412，q(G)＝0.588；

位点1:g.145686763T>C：p(C)＝0.411，q(T)＝0.589；

位点1:g.145686889C>T：p(C)＝0.694，q(T)＝0.306。

COL6A1基因加性效应、显性效应和等位基因替代效应检验结果如表6所示。

表6为COL6A1基因等位基因加性效应、显性效应和替代效应检验结果

注：^*P<0.05，表示差异显著；^**P<0.01，表示差异极显著。

表6表明，分子标记1:g.145667090C>T对产奶量和乳脂量加性效应极显著(P＜0.01)，等位基因替代效应显著或极显著(P＜0.05，P＜0.01)，即每个T等位基因替代C等位基因会导致305产奶量增加188.47kg(P＜0.05)，乳脂量提高13.38kg(P＜0.01)；1:g.145668599C>G分子标记对产奶量和乳脂量加性效应极显著(P＜0.01)，等位基因替代效应达显著显著或极显著(P＜0.05，P＜0.01)，即每个G等位基因替代C等位基因会导致产奶量增加183.48kg(P＜0.05)，乳脂率提高13.24kg(P＜0.01)；1:g.145669859T>C分子标记对乳蛋白量和乳蛋白率加性效应极显著(P＜0.01)，对乳蛋白率等位基因替代效应极显著，即每个C等位基因替代T等位基因会导致乳蛋白率提高0.042％(P＜0.01)；分子标记1:g.145673966T>C对产奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率加性效应达显著或极显著水平(P＜0.05，P＜0.01)，对产奶量、乳蛋白量和乳蛋白率等位基因替代效应显著，即每个C等位基因替代T等位基因会导致产奶量增加434.36kg(P＜0.01)，乳蛋白量增加8.57kg(P＜0.05)，乳蛋白率降低0.051％(P＜0.01)。1:g.145676602G>A和1:g.145676653T>C标记对乳脂量、乳脂率和乳蛋白率等位基因替代效应显著(P＜0.05)，即每个A等位基因替代G或每个C等位基因替代T等位基因会导致乳脂量增加4.9kg、乳脂率增加0.048％和乳蛋白率增加0.019％(P＜0.05)。1:g.145677680C>T标记对乳脂量、乳脂率和乳蛋白率等位基因替代效应显著(P＜0.05)，即每个T等位基因替代C等位基因会导致乳脂量增加4.894kg、乳脂率增加0.048％和乳蛋白率增加0.019％(P＜0.05)。1:g.145677953A>G标记对乳脂量、乳脂率和乳蛋白率等位基因替代效应显著(P＜0.05)，即每个G等位基因替代A等位基因会导致乳脂量增加4.894kg、乳脂率增加0.048％和乳蛋白率增加0.019％(P＜0.05)。1:g.145682517G>A标记对乳蛋白率加性效应显著和等位基因替代效应显著(P＜0.05)，即每个A等位基因替代G等位基因会导致乳蛋白率增加0.015％(P＜0.01)。1:g.145682638A>G标记对乳蛋白率加性效应显著和等位基因替代效应显著(P＜0.05)，即每个G等位基因替代A等位基因会导致乳蛋白率增加0.011％(P＜0.01)。1:g.145684727G>A标记对乳蛋白率加性效应显著和等位基因替代效应显著(P＜0.05)，即每个A等位基因替代G等位基因会导致乳蛋白率增加0.015％(P＜0.01)。1:g.145686763T>C标记对乳蛋白率加性效应显著和等位基因替代效应显著(P＜0.05)，即每个A等位基因替代G等位基因会导致乳蛋白率增加0.014％(P＜0.01)。1:g.145686889C>T标记对乳脂量、乳脂率和乳蛋白率等位基因替代效应显著(P＜0.05)，即每个T等位基因替代C等位基因会导致乳脂量增加4.9kg、乳脂率增加0.048％和乳蛋白率增加0.015％(P＜0.05)。

本发明公开的分子标记可以应用于辅助鉴定具有优良产奶性状的牛群体，具有如下优点：简便、快速、灵敏，结果可靠、稳定、准确，适合实验室大群体规模检测的需要。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110>北京市畜牧总站

<120>一种用于检测奶牛产奶性状的COL6A1基因SNPs标记及其应用

<160> 39

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

ggtggacttc ctcttgcctc a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

ggtgctacac ggacatactc g 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

taggtacggg gagacactgg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

ctcgctgcag gatttacctc 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

agctccttct gattccttcc ttg 23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

gggctgtgac cgtctacttg g 21

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

gcacggcacc aagaaca 17

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

agaccaccac ggctgaa 17

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

ctgggaagag ggtttggtg 19

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

ccgtctggtc ctgcattt 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

gcatcgcctt gcttgttc 18

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

tctccggtat ggtgcctgt 19

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 13

agtacgcacc atctgctctg t 21

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 14

ggacctcggt agcccttt 18

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 15

gggctccgag gcttact 17

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 16

gctcctgcat ctggttgtg 19

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 17

gtcatgctgt ggggttttct 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 18

gccgaagacc acgtcatact 20

<210> 19

<211> 552

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 19

ggtggacttc ctcttgcctc acaactactt ttgaaggctt ctggtgactc aggggtcggg 60

gaggcgcagg agtccatttg gaggctctcc cggagggctc ctgtcagggt ccggagccca 120

gtgctccagc ccctcggagg cccgagacca gggagtgagt cgtgcggcct ccaggcacca 180

aggggcacag gacactgcag gccacaccct gtgtgacctg tgcttccctg aagcaaccac 240

ccagcatggg tgcggggctc ctatcaccac cctgccgctc ctggggacag ccctgtcccc 300

aagcctccta gcccctctcc agggccttga ctcccgcctt ggagacctcg gccgcccgaa 360

cggggtcacg gggtggtggg gtggatccct tcaaacctgc aggagccctg ctacctgccc 420

caccctgacc ccggtcctag tggatctcga cctgtctgtc gctcacctct cacggatgct 480

ggatgccagg cacagttcgg ggtgggaggg gggtgcttgc atccttgggg ccgagtatgt 540

ccgtgtagca cc 552

<210> 20

<211> 851

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 20

taggtacggg gagacactgg aagagacgct acagcagtca ctgagacgca cggtttccaa 60

agttctccaa acttcttacg gttacacgat ttctgcatgt cttaaactaa aaaacatttc 120

ggctgatatc agaccagtgt taacagcgcc agctctggga aagatctaga atgttctctg 180

gggctggggt gggtgtggcc tcacccagag ctcaacccca gcaggcccca gagtggggcc 240

ttcacacctg tcctcagaag cagggcctcg gctcctcact gtgtctctgt ctacacacgc 300

actccagctt ccccagtggc tcagctggta aagaacctgt ctgccagtgc aggagactca 360

ggagacgtgg gttggatccc tgggtcagga agatcctctg gagaaggaag tggcaactcg 420

ctccagtatc cttgcctgga aaatccctcg gacagagggc ctggatctat ggtgtcacaa 480

agagtcggac gcaactgagt acacgcacac actaatgtat gtgtcgttat tgttctgtgc 540

ttccccagag taaaaatgaa agatcttttg tcaatatgta aaccctgaag aggtatttat 600

atgacagctc gaaagtcaga cagatccaca gagttgaaac atttaaacaa acagcaccac 660

tttgtagaaa ttggttagtg agggggagga agaggcgggt ggatcccagg ccaagactgg 720

aaacgcccaa aacatgtttc agggaaattc gtcttgggtt atgcactctt tttcagactt 780

ctgaaactca acatgagaac cgtaagcaaa taaaagtcct cataaaccag ggaggtaaat 840

cctgcagcga g 851

<210> 21

<211> 806

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 21

agctccttct gattccttcc ttgtggtcag tcaggaaacg gtcacctggt cctacccacc 60

ctctcctgaa ggtcaagccc ctccctggta gttttaaatt caacttggaa acacaatgag 120

aaacgtctcc tgctctttca ggagtgttgg ggcctgactg ggtataaggg ggtgactggc 180

tggggaagtg gccagtgggg ctgggcgggg gggctcccct ggggaagggg gagcgcaggg 240

ctgagcctct cttcctgtcc ctggcccaga ctgccctgtg gacctgttct ttgtgctgga 300

cacctccgag agcgtggcct tgaggctgaa gccctatggg gccctggtgg acaaggtcaa 360

gtccttcacc aagcgcttca ttgacaacct gaacgacagg taggacctcg tcctcctcct 420

cccgtccacc accctctcag agggcggggg agacaggctg gtgtctcccc tgccacagcc 480

agcaggcaga gctggccctc agtgtcccca tctgagaagg gcagtgctgg ccaggccact 540

cgagtccctt cccctggggc tgtgtggttc agatgggcta gaaaaagact gagttgagat 600

ggagccggct gtttagccag gagagccaag ggggcagtgc tacagcctgg actccccaaa 660

cgcagggttg aacagctccc ctccccaacc ctgagccggc ttgggaagct ggcctgaggc 720

cgtgtgggtc tgcctggtac ctagaggggg cgcccctcac cagccacctg gactctgacg 780

gttgcccaag tagacggtca cagccc 806

<210> 22

<211> 629

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 22

gcacggcacc aagaacaggc agacagaaaa gagtcagggt tatttttgct ggccccgggc 60

agccccaggg cttggcagag tgtgtggcag agaccctggg cctggcctca caccctggac 120

cacgggaaag gtgcctggaa accacgtaga tgctggagat gggatggaat agcttcatag 180

actttttttt gttagcaagt agggtcttcc tttcgccagc tttttagaaa taaatggaat 240

ctatcctctg accatgatct gctctctgtt ctagggagaa agagggaagc cggggctccc 300

gggagagaaa ggagaagctg gagaccctgt gagtgccggg tacctgactg aggggttggg 360

acgctgagca gccagaggcc agggagccag actgtggaaa cttccagaag gatgactggt 420

ttcatgagca ccatgtggcc tgatcctcag aggacacggc tcctgtgggt gatgaggact 480

tgggggcaca cagcacagct ggccctccag caccccgacc cgggcagacc cccacgcccc 540

tcagccgccc cccacaggcc cacctgctca cagaggacag gtgtcagggg tcggccagca 600

ggtggcctct gcttcagccg tggtggtct 629

<210> 23

<211> 459

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 23

ctgggaagag ggtttggtgc agagatgtgg gtggctaggg tcgtcaggga ccgcagcctg 60

aagcctgggt gaggggggcc agcgtgggcc catgggcccc caggacagcc aggcacggcc 120

tcctgaaggc tgaccctcag gtctttccag ggtgagcccg gagcagacgg ggagcctggg 180

aggcccggga gcacggggcc gcctggagat gaggtgagcg tgcacatttc cctgatgagt 240

gggggtgccc gtgcctggga ggctgcaggg tcggaggaga cagtctgtgc tgtcgttctc 300

agggtgagcc tggagagccc ggtcccccgg gagagaaggg agaagccggc gatgaggtag 360

gagccctccc gcccgtgaca ccccagactc agcagagatc ctgctgctga cgaactcatg 420

ttgattcctc ttactccagg gaaatgcagg accagacgg 459

<210> 24

<211> 863

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 24

gcatcgcctt gcttgttctt gagtttacat ttcacagaaa ggagtgtagc cagcgccacc 60

cccaacccct ccctgggggg gtaggggtgg aaatgagctg cctccaggcc ttggcagggg 120

tatcggcccc tcatcatggc cccttgaaaa cacgagtccc ctgatggcca agcacgtgcc 180

acgttggagg acaggggtga gaaggaagcg aggccacgcg cagcggatga cagaagctgc 240

cgggcctcag ccggtggccc ccagggcagc catcctcctc cgtctcctcc tcagtggctt 300

ttcctcccca gggtgaagct ggaccccaag gtgaccaggg acgagaaggc cccgtcggtg 360

tccccggtga cccggtagga agcctggctg gcggtggtgg cgggggcagg gcgtggtgct 420

gccagatggg agcagctcac agatgcaggg gaaggtctct tcactgcaca cccagctgct 480

tccttgtggg ggtgtggcct ggagacctgg ggtgtctggg gttgggggga cggcggccag 540

ggggctggta cggattggca aggtggacca gtgctcacag ggggagccct gtccctgggt 600

gggcactgcc aggacacagc cctgagcaaa gaccccccat gctgcccccc acactgccct 660

cagagtgggg agggtgccct ggtgtggcta gtgctagaag agatcagtga gggtggaagc 720

cgggcagtga gccatcaaga ccagtggggg cggggctggc agcagcagag gcgtgctgga 780

gcctgggccc tggggacccc tccagcctgg ggagacgggc gaggtctcgg aggactgagc 840

cgagacaggc accataccgg aga 863

<210> 25

<211> 614

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 25

agtacgcacc atctgctctg ttggccgtgg gaggtgcaca caggcacaca tgcacgtgca 60

agcacattgc tcctacacct gagcaaacgc gtgaagacgc acacagccct gctcatcgcc 120

aaggccccgc ccgcgtcgtg tctccttagg ccctgctcag ccccgggtcc cctgctgcct 180

gacactcccc tcgggatctg ttctctccat ggcccgcccc agaggcctgc ccccagagcc 240

gcagcaccca ccccaaccct gggccggctc cccctaacta tgtgctctcc gtcacctgca 300

gggcaccaaa ggctaccctg gcctcaaggg ggacgaggga gaagccgggg accccggaga 360

ggacgtgagt gcaaagccca ccgcgtttgg cgacatcctc agtcaacctc ggcctcgagg 420

gcccagagcc cacagaccat aggggaacgt ggctccgagg gtggctgagc cttctggggg 480

tcaagggggt ggtggccagg ctcatagcag ttggtctggc catgcgtggc aagcctacaa 540

cactgcactg tgtctttcca gaataatgac attgctgcac gaggcgccaa aggagcaaag 600

ggctaccgag gtcc 614

<210> 26

<211> 518

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 26

gggctccgag gcttactgca ccctgctgcc tgcagagtgc aagtgcgggc ccatcgacat 60

cctcttcgtg ctggacagct ctgagagcat cggcctacag aacttcgaga tcgccaagga 120

cttcatcgtc aaggtcattg accggctgag caaggatgag ctggtcaagg tgaggcggac 180

gccctggcct cgtttgggga tgaagtttcc cagggaggca ggggtctgtc ctgacaccag 240

agtggaaggg ccgggtgctg ggggccgcaa gagagatgcc ttgtttctca aaagccaaag 300

cctccagccc agcagtgcac aagagcaagc tgggggcctg ggggccagtc caacccggga 360

tgggagtggg tggaggctca acctgagcag ggagaagcac cagcaccccg tggatccctg 420

gaggtgctcc tcatggtggc ggctctctct cgagcagttt gagcctgggc agtcgcatgc 480

aggcgtggtg cagtacagcc acaaccagat gcaggagc 518

<210> 27

<211> 715

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 27

gtcatgctgt ggggttttct cttttacaga caagaaatgt ccagattaca gctgcccaag 60

tgagtactgg ggggtggatg gggtgctcgc ggggggcgct gggtaagaag ggtctggagg 120

ccatagggag cggggcaggc cccagggcct gcggtgcacg ctcacagctg ctccgcccgc 180

agtcaccttc tcctccccgg ccgacatcac catcctcctg gacggctccg ccagcgtggg 240

cagccacaac tttgacatca ccaaacgctt tgccaagcgg ctggcagagc gcttcctgac 300

agcgagccgg acagacccgg gccaggacgt gcgtgtggca gtggtgcagt acagcggtac 360

ggggcagcag cggccggagc gcgcggccct gcagttcctg cagaactaca ccgtgctggc 420

caacaccgtg gactccatgg acttcttcaa tgacgccacc gacgtcatgg acgccctggg 480

ctacgtgacc cgcttctacc gcgaggcctc gtccaacgcc gccaagaaga ggctgctgct 540

cttctcggat ggcaactcgc aaggtgccac gccggccgcc atcgagaagg cggtgcagga 600

ggcccagcgg gcgggcgtgg agatcttcgc ggtggtggtg ggccgccagg tgaacgagcc 660

ccacgtgcgt gtcctggtca ctggcaaggc ggctgagtat gacgtggtct tcggc 715

<210> 28

<211> 120

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 28

cttcaaacct gcaggagccc tgctacctgc cccaccctga ccccggtcct agtggatctc 60

gacctgtctg tcgctcacct ctcacggatg ctggatgcca ggcacagttc ggggtgggag 120

<210> 29

<211> 120

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 29

gaaattggtt agtgaggggg aggtgaagag gcgggtggat cccaggccaa gactggaaac 60

gcccaaaaca tgtttcaggg aaattcgtct tgggttatgc actctttttc agacttctga 120

<210> 30

<211> 120

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 30

ccactcgagt cccttcccct ggggctgtgt ggttcagatg ggctagaaaa agactgagtt 60

gagatggagc cggctgttta gccaggagag ccaagggggc agtgctacag cctggactcc 120

<210> 31

<211> 120

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 31

gagggaagcc ggggctcccg ggagagaaag gagaagctgg agaccctgtg agtgccgggt 60

acctgactga ggggttggga cgctgagcag ccagaggcca gggagccaga ctgtggaaac 120

<210> 32

<211> 120

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 32

agggagaagc cggcgatgag gtaggagccc tcccgcccgt gacaccccag actcagcaga 60

gatcctgctg ctgacgaact catgttgatt cctcttactc cagggaaatg caggaccaga 120

<210> 33

<211> 120

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 33

gcggtggtgg cgggggcagg gcgtggtgct gccagatggg agcagctcac agatgcaggg 60

gaaggtctct tcactgcaca cccagctgct tccttgtggg ggtgtggcct ggagacctgg 120

<210> 34

<211> 120

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 34

ccatgctgcc ccccacactg ccctcagagt ggggagggtg ccctggtgtg gctagtgcta 60

gaagagatca gtgagggtgg aagccgggca gtgagccatc aagaccagtg ggggcggggc 120

<210> 35

<211> 120

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 35

cacctgagca aacgcgtgaa gacgcacaca gccctgctca tcgccaaggc cccgcccgcg 60

tcgtgtctcc ttaggccctg ctcagccccg ggtcccctgc tgcctgacac tcccctcggg 120

<210> 36

<211> 120

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 36

tctgttctct ccatggcccg ccccagaggc ctgcccccag agccgcagca cccaccccaa 60

ccctgggccg gctcccccta actatgtgct ctccgtcacc tgcagggcac caaaggctac 120

<210> 37

<211> 120

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 37

ttcatcgtca aggtcattga ccggctgagc aaggatgagc tggtcaaggt gaggcggacg 60

ccctggcctc gtttggggat gaagtttccc agggaggcag gggtctgtcc tgacaccaga 120

<210> 38

<211> 120

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 38

acagcgagcc ggacagaccc gggccaggac gtgcgtgtgg cagtggtgca gtacagcggt 60

acggggcagc agcggccgga gcgcgcggcc ctgcagttcc tgcagaacta caccgtgctg 120

<210> 39

<211> 120

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 39

accgtggact ccatggactt cttcaatgac gccaccgacg tcatggacgc cctgggctac 60

gtgacccgct tctaccgcga ggcctcgtcc aacgccgcca agaagaggct gctgctcttc 120

Claims

1.用于检测如下14个SNP位点中至少一种SNP位点的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定奶牛产奶性状中的应用；

2.如下14个SNP位点中至少一种SNP位点作为检测靶标在鉴定或辅助鉴定奶牛产奶性状中的应用；

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述产奶性状为产奶量和/或乳脂量和/或乳蛋白量。

4.一种鉴定或辅助鉴定奶牛产奶性状的方法，为如下1)-14)中任一种：

所述SNP位点1:g.145667090C>T基因型为TT的供试奶牛的产奶性状优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145667090C>T基因型为CC的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145668599C>G基因型为GG的供试奶牛的产奶性状优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145668599C>G基因型为CC的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145669859T>C基因型为TT的供试奶牛的产奶性状优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145669859T>C基因型为CC的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145673966T>C基因型为TT的供试奶牛的产奶性状优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145673966T>C基因型为CC的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145676602G>A基因型为AA的供试奶牛的产奶性状优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145676602G>A基因型为GG的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145676653T>C基因型为CC的供试奶牛的产奶性状优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145676653T>C基因型为TT的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145677680C>T基因型为TT的供试奶牛的产奶性状优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145677680C>T基因型为CC的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145677709A>G基因型为AA的待测奶牛的产奶性状优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145677709A>G基因型为GG的待测奶牛；

所述SNP位点1:g.145677953A>G基因型为GG的供试奶牛的产奶性状优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145677953A>G基因型为AA的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145682517G>A基因型为GG的供试奶牛的产奶性状优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145682517G>A基因型为AA的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145682638A>G基因型为AA的供试奶牛的产奶性状优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145682638A>G基因型为GG的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145684727G>A基因型为GG的供试奶牛的产奶性状优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145684727G>A基因型为AA的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145686763T>C基因型为TT的供试奶牛的产奶性状优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145686763T>C基因型为CC的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145686889C>T基因型为TT的供试奶牛的产奶性状优于或辅助优于所述SNP位点1:g.145686889C>T基因型为CC的供试奶牛。

5.权利要求4所述方法在奶牛筛选或奶牛育种中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

所述应用中，选取权利要求4中如下任一种的供试奶牛用于产奶或育种；

所述SNP位点1:g.145667090C>T基因型为TT的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145668599C>G基因型为GG的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145669859T>C基因型为TT的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145673966T>C基因型为TT的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145676602G>A基因型为AA的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145676653T>C基因型为CC的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145677680C>T基因型为TT的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145677709A>G基因型为AA的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145677953A>G基因型为GG的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145682517G>A基因型为GG的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145682638A>G基因型为AA的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145684727G>A基因型为GG的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145686763T>C基因型为TT的供试奶牛；

所述SNP位点1:g.145686889C>T基因型为TT的供试奶牛。

7.一种组合物，其特征在于，其组合物由如下引物对和探针组成的组或其组的组合组成；

组1，由引物对1和探针1组成；

组2，由引物对2和探针2组成；

组3，由引物对3和探针3组成；

组4，由引物对4和探针4组成；

组5，由引物对5和探针5组成；

组6，由引物对6和探针6组成；

组7，由引物对7和探针7组成；

组8，由引物对8和探针8组成；

组9，由引物对9和探针9组成；

组10，由引物对10和探针10组成；

组11，由引物对11和探针11组成；

组12，由引物对12和探针12组成；

所述引物对1为引物1F和引物1R组成的引物对；

所述引物对2为引物5F和引物5R组成的引物对；

所述引物对3为引物6F和引物6R组成的引物对；

所述引物对4为引物10F和引物10R组成的引物对；

所述引物对5为引物13F和引物13R组成的引物对；

所述引物对6为引物15F和引物15R组成的引物对；

所述引物对7为引物18F和引物18R组成的引物对；

所述引物对8为引物19F和引物19R组成的引物对；

所述引物对9为引物21F和引物21R组成的引物对；

所述引物1F为序列表中序列1所示的单链DNA分子；

所述引物1R为序列表中序列2所示的单链DNA分子；

所述引物5F为序列表中序列3所示的单链DNA分子；

所述引物5R为序列表中序列4所示的单链DNA分子；

所述引物6F为序列表中序列5所示的单链DNA分子；

所述引物6R为序列表中序列6所示的单链DNA分子；

所述引物10F为序列表中序列7所示的单链DNA分子；

所述引物10R为序列表中序列8所示的单链DNA分子；

所述引物13F为序列表中序列9所示的单链DNA分子；

所述引物13R为序列表中序列10所示的单链DNA分子；

所述引物15F为序列表中序列11所示的单链DNA分子；

所述引物15R为序列表中序列12所示的单链DNA分子；

所述引物18F为序列表中序列13所示的单链DNA分子；

所述引物18R为序列表中序列14所示的单链DNA分子；

所述引物19F为序列表中序列15所示的单链DNA分子；

所述引物19R为序列表中序列16所示的单链DNA分子；

所述引物21F为序列表中序列17所示的单链DNA分子；

所述引物21R为序列表中序列18所示的单链DNA分子；

所述探针1为序列表中序列28所示的单链DNA分子；

所述探针2为序列表中序列29所示的单链DNA分子；

所述探针3为序列表中序列30所示的单链DNA分子；

所述探针4为序列表中序列31所示的单链DNA分子；

所述探针5为序列表中序列32所示的单链DNA分子；

所述探针6为序列表中序列33所示的单链DNA分子；

所述探针7为序列表中序列34所示的单链DNA分子；

所述探针8为序列表中序列35所示的单链DNA分子；

所述探针9为序列表中序列36所示的单链DNA分子；

所述探针10为序列表中序列37所示的单链DNA分子；

所述探针11为序列表中序列38所示的单链DNA分子；

所述探针12为序列表中序列39所示的单链DNA分子。

8.权利要求7所述组合物的应用，为如下(a)-(f)中任一种：

(a)鉴定或辅助鉴定奶牛产奶性状；

(b)奶牛筛选；

(c)奶牛育种；

(d)制备用于鉴定或辅助鉴定奶牛产奶性状的试剂盒；

(e)制备奶牛筛选的试剂盒；

(f)制备奶牛育种的试剂盒。