CN115927667A - 一种与猪肌内脂肪性状相关的分子标记、引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与猪肌内脂肪性状相关的分子标记、引物及其应用，所述分子标记为对应于猪AOPEP基因第二外显子中序列如SEQ ID NO.1所示DNA分子第349bp处的核苷酸，为T/C多态，所述引物序列如SEQ ID NO.2～3所示；该分子标记和引物用于猪选育时，能够显著提高育种效率，有效缩短育种周期，且育种准确性高，成本低廉。
Description
技术领域
本发明属于分子标记辅助选择育种技术领域，具体涉及一种与猪肌内脂肪性状相关的分子标记、引物及其应用。
背景技术
肌内脂肪含量是猪肉品质的重要评定指标，肌内脂肪含量直接影响了猪肉口感和风味。肌内脂肪性状属于中等遗传力性状，遗传力在0.2-0.4之间，但由于肉质性状的活体测定较为困难，通过常规育种改良较为困难。因此寻找影响肉质性状的分子标记，通过常规育种与标记辅助选择(MAS)相结合的方法，可以加快猪肌内脂肪性状的遗传改良。
MAS利用与特定性状相关联的分子标记作为辅助手段进行选择育种，具有快速、准确、不受环境影响等优点，能够减少现场测定人员的工作量，且能缩短育种时限。单核苷酸多态性(SNP)指基因组DNA序列中单个核苷酸的突变而引起的基因多态性，在基因组中广泛存在，常被通过MAS的方法应用于育种实践中，对重要性状的遗传改良具有关键作用。
AOPEP基因是编码M1氨基氧化锌肽酶家族的一个成员。编码的蛋白质是一种锌依赖的金属肽酶，参与肽类激素代谢和蛋白质代谢等相关途径，可能在血管紧张素IV的生成和肌张力障碍中发挥作用。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一个位于猪AOPEP基因第二外显子内与猪肌内脂肪性状相关的分子标记，该分子标记可为猪肉质性状标记辅助选择提供参考依据。
本发明的技术方案具体如下：
一种猪AOPEP基因内与猪肌内脂肪性状相关的分子标记，该SNP分子标记为对应于猪AOPEP基因第二外显子中序列如SEQ ID NO.1所示DNA分子第349bp处的核苷酸，为T/C多态。
进一步地，在上述分子标记中，第349bp处的优势等位基因型为TT。
用于检测所述与猪肌内脂肪性状相关的试剂盒也属于本发明的保护范围。
所述试剂盒包括用于PCR扩增得到上述分子标记的引物，优选地，所述引物的序列如SEQ ID NO.2～3所示。该试剂盒中还可以包括PCR扩增的常规试剂，还可以包括测序用常规试剂。
所述与猪肌内脂肪性状相关的分子标记或所述引物的应用也属于本发明的保护范围，其中所述应用具体为下述A1)至A3)中的任一种：
A1)鉴定或辅助鉴定猪肌内脂肪性状中的应用；
A2)猪育种；
A3)筛选高肌内脂肪含量猪品种。
本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定猪肌内脂肪性状的方法，包括以下步骤：
1)提取猪基因组DNA作为模板；
2)针对SEQ ID NO.1所示DNA分子的第349位点设计引物，进行PCR扩增；
3)检测待测猪SEQ ID NO.1所示序列的第349位点的基因型。
优选地，在上述鉴定方法中，引物的序列如SEQ ID NO.2～3所示。
更加优选地，在上述鉴定方法中，PCR扩增的条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
更加优选地，在上述鉴定方法中，PCR扩增的体系为：共50μL，100ng模板DNA、10×buffer4μL、上下游引物各0.5μM、2.5μM dNTPs、1U TaqDNA聚合酶，ddH2O余量。
优选地，在上述鉴定方法中，步骤3)中当待测猪为CC基因型时，其肌内脂肪高于CT基因型和TT基因型。
本发明还提供了一种猪育种方法，检测待测猪在SEQ ID NO.1所示序列的第349位点的基因型，选择CC基因型猪进行育种。
本发明的有益效果：本发明发掘了位于猪AOPEP基因第二外显子内与猪肌内脂肪性状相关的分子标记(rs3472476200)，该单核苷酸多态性(SNP)可以作为猪肌内脂肪性状的分子标记，为猪肌内脂肪性状的标记辅助育种提供了一个新的分子育种标记，有利于提高育种效率，有效缩短育种周期。
附图说明
图1是猪AOPEP基因中如SEQ ID NO.1所述的序列片段的琼脂糖凝胶电泳图谱；
图2是本发明中猪AOPEP基因rs3472476200位点的SANGER测序读取结果图；其中，A图为CC基因型，B图为CT基因型，C图为TT基因型。
具体实施方式
下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1猪AOPEP基因片段的获得及多态性检测方法的建立
1、猪基因组DNA的提取。
本发明的试验猪品种为湖北省农业科学院畜牧兽医研究所和湖北天之力优质猪育种有限公司联合培育的硒都黑猪新品种。
采用北京擎科新业生物技术有限公司生产的动物组织基因组DNA试剂盒(按该试剂盒说明书进行操作)从猪耳缘组织中提取猪基因组DNA。
2、猪AOPEP基因片段的获得。
(1)PCR扩增：
根据猪AOPEP基因的基因组序列(GenBank登陆号：NC_010452.4)设计以下引物对：
扩增SEQ ID NO.1序列上游引物：5’-GGCGTGAGGAAAGTCAGTAG-3’(SEQ ID NO.2所示)，
扩增SEQ ID NO.1序列下游引物：5’-CAGATTCAAGAAACAGCGTAG-3’(SEQ ID NO.3所示)。
利用上述引物在硒都黑猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR反应体系50μL，体系中各组分的浓度为100ng模板DNA、10×buffer(含Mg2+)4μL、上述上下游引物各0.5μM、2.5μMdNTPs、1U TaqDNA聚合酶。
PCR的运行程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
(2)PCR产物纯化：采用上海生工生物工程有限公司的Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化，具体步骤见试剂盒说明书。
3、将纯化回收后的PCR产物交由北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行SANGER测序，以检测分子标记。
经检测，PCR产物的长度为556bp，其序列如SEQ ID NO.1所示，且其琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。
实施例2分子标记在硒都黑猪中的多态性分布检测
本实施例按照实施例1建立的方法在硒都黑猪中检测猪AOPEP基因第二外显子rs3472476200位点(即SEQ ID NO.1所示序列的349bp处)的多态性，检测结果如表1和图2所示。
表1AOPEP基因rs3472476200位点在硒都黑猪中的基因型频率和等位基因频率
表1结果表明：在硒都黑猪中，AOPEP基因rsrs3472476200位点表现为CC、CT或TT三种基因型；其中T等位基因频率为0.59，是优势等位基因。
实施例3分子标记与猪肌内脂肪性状的关联分析及应用
为了确定猪AOPEP基因rsrs3472476200位点与猪肌内脂肪差异是否相关，采用实施例1建立的方法进行多态性检测，并分析猪AOPEP基因rsrs3472476200位点的不同基因型与猪肌内脂肪性状的相关性。
采用SAS统计软件(SAS Institute Inc,Version 9.1)GLM程序进行不同SNP基因型组合的方差分析，并进行显著性检验，所采用模型为：
Yij＝μ+Gi+Fj+eij；
式中，Yij为性状表型值，μ为平均值，Gi为基因型效应(包括基因加性效应和显性效应；加性效应用1，0和-1分别代表CC、CT和TT基因型，显性效应用1，-1和1分别代表CC、CT和TT基因型)；Fj为猪场综合效应；eij为残差效应。
在硒都黑猪中进行不同基因型与肌内脂肪性状间的关联分析，统计分析结果如表2所示：
表2-AOPEP基因rsrs3472476200位点与猪肌内脂肪性状的关联分析
注：A和B表示差异极显著(P<0.01)，**表示差异显著(P<0.01)，*表示差异显著(P<0.05)。
由表2可以看出：在硒都黑猪中，rsrs3472476200位点的CC基因型的肌内脂肪极显著高于CT基因型和TT基因型(P<0.01)。但在该群体中T等位基因是优势等位基因，因此，在育种中应予以保留携带C等位基因的个体，从而有利于提高群体的肌内脂肪含量。
综上所述，本发明发掘的与猪肌内脂肪性状相关的分子标记(rsrs3472476200)位于猪AOPEP基因第二外显子的部分DNA序列(SEQ ID NO.1)中，在硒都黑猪中该分子标记的CC基因型的肌内脂肪极显著高于CT基因型和TT基因型，可用于筛选或预测具备优良肌内脂肪性状的猪品种。
以上所述是本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种与猪肌内脂肪性状相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记为对应于猪AOPEP基因第二外显子中序列如SEQ ID NO.1所示DNA分子第349bp处的核苷酸，为T/C多态。
2.根据权利要求1所述与猪肌内脂肪性状相关的分子标记，其特征在于，所述第349bp处的优势等位基因型为TT。
3.一种用于扩增权利要求1所述与猪肌内脂肪性状相关的的引物，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID NO.2～3所示。
4.如权利要求1所述与猪肌内脂肪性状相关的分子标记或如权利要求3所述引物的应用，为下述A1)至A3)中的任一种：
A1)鉴定或辅助鉴定猪肌内脂肪性状中的应用；
A2)猪育种；
A3)筛选高肌内脂肪含量猪品种。
5.一种鉴定或辅助鉴定猪肌内脂肪性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取猪基因组DNA作为模板；
2)针对SEQ ID NO.1所示DNA分子的第349位点设计引物，进行PCR扩增；
3)检测待测猪SEQ ID NO.1所示序列的第349位点的基因型。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)所述引物的序列如SEQ ID NO.2～3所示。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系为：共50μL，100ng模板DNA、10×buffer 4μL、上下游引物各0.5μM、2.5μM dNTPs、1U TaqDNA聚合酶，ddH2O余量。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，CC基因型的肌内脂肪高于CT基因型和TT基因型。
10.一种猪育种方法，其特征在于，按照权利要求5～9任一权利要求所述的方法检测待测猪的基因型，选择CC基因型猪进行育种。
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| GR01 | Patent grant | ||
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