CN117385045B - 山羊amhr2基因作为产羔数关联分子标记的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，特别是涉及山羊AMHR2基因作为产羔数关联分子标记的应用。所述的山羊SNP分子标记位点如SEQ ID NO.1所示，位于该序列片段的第189位碱基位点处存在一个C/T的碱基突变。本发明通过优选该SNP分子标记的优势等位基因型，能够加快山羊产羔性状的遗传进展，缩短山羊的繁殖性状的育种时间，从而降低繁殖成本，有效地提高肉羊养殖业的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物技术和分子标记技术领域，尤其涉及一种山羊AMHR2基因作为产羔数关联分子标记的应用。
背景技术
东宝黑头羊是地方品种改良的肉用山羊，其肉质鲜美，膻味轻，但年产肉量并不高。提高羊肉年产量最直接的方法是增加产羔个数，故研究如何通过选育来提高山羊产羔性能，对于提升山羊生产繁殖效益具有十分重要的意义。
在分子育种中，分子标记辅助选择（molecular marker-assisted selection，MAS)借助与重要经济性状相关联的分子标记来综合评估畜禽的生产潜能，尤其对于低遗传力性状和难以测量的性状具有更大优势，能有效加快畜禽重要经济性状的改良。分子标记是能够直接反映生物个体或种群间基因组间差异的DNA片段，因其存在共显性、高多态性的优势且来源丰富、表现稳定，从基因层面上解释可遗传变异所带来的育种潜力成为热点。
单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）属于其中的一种，指个体间基因组中同一位置单个核苷酸发生变异而导致的DNA序列改变，后续可影响基因表达量、转录活性及剪接修饰等。故而，借助SNP对山羊重要经济性状的选择进展进行辅助选择，将有利于我国山羊产业的可持续发展。PCR-RFLP是一种可对多态性位点进行基因分型的技术，其原理是扩增不同个体同一DNA序列时，由于碱基突变引起限制性内切酶识别位点发生变化，存在多态性的DNA序列在内切酶作用后可产生不同的DNA序列片段，经电泳可将大小不同的条带分开，从而可完成各基因型的鉴定。
抗缪勒管激素Ⅱ型受体（Anti-Müllerian Hormone Receptor Type II，AMHR2）是生长转化因子TGF-β家族的一员，是只指向AMH激素的受体，大量研究表明AMH对AMHR2具有更高的亲和力。AMHR2蛋白的结构域在膜内、膜外及跨膜均有分布，其本质是跨膜丝氨酸/苏氨酸受体激酶。在AMH激素信号传导过程中，AMH激素与AMHR2的胞外结构域特异结合后，I型受体(ALK2/3/6)与AMHR2受体异二聚并被AMHR2磷酸化，进而促使AMH信号进入细胞核。目前已在多个物种中克隆并鉴定出AMHR2，在雌性动物中主要在卵巢颗粒细胞表达。AMHR2基因定位于山羊第5号染色体，由12个外显子组成。AMHR2基因除了与AMH基因一起参与性腺分化、卵泡发育，还与卵巢疾病的发生有关，有研究发现小鼠卵巢中存在AMHR2的两种新可变剪接体，对抗缪勒管激素信号转导发挥抑制作用。在人类中，AMHR2基因启动子区-482A>G多态位点与血清LH、LH/FSH有关，AMHR2基因突变能使妇女已生育次数和年龄关系发生改变。不少研究表明AMHR2基因多态性可能会提高女性罹患多囊卵泡综合症的风险，但并不与血清AMH水平相关。这些研究表明AMHR2基因可参与卵巢原始卵泡的招募及排卵，最终对卵巢储备造成影响。
到目前为止，并未记载有AMHR2基因的相关调控区存在与山羊产羔性状相关的SNP分子标记。
发明内容
本发明的目的在于筛选出一种与山羊产羔数关联的分子标记，利用该分子标记在山羊产羔数性状检测或山羊育种中的应用。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种山羊SNP分子标记在山羊产羔数性状检测或山羊育种中的应用，所述SNP分子标记位于山羊AMHR2基因外显子8中，其所在核苷酸序列如下所示（SEQ IDNO:1）：
AAGAAGGTCCTGCCCCTTCAGCCTGGCTTCTCCCACAGGCCAGTATAAACCAGGTATCGCCCACCGAGATCTGAGCAGCCAGAATGTGCTCATTCGGGACGATGGGTCATGCGCCATTGGAGATCTGGGCCTCGCCTTGGTGCTCCCTGGCCTCGCCCAGCCCCCAACCTGGGCCCCTAGTCAACCCCNAGGCCCGGCTGCCATCATGGAGGTCAGTACTCTGGAGGAGGGTGAGACCCAGGTTGGTGGTGGTGGTGCTGATGACGAAGCAGCGACAGTGCAGCAGCACCGATAGTGTATGGGGTGCTGCTGAGGCTAGTCCGGGGTTTGCATGGACTAGTGTTGCGGTGAGGGTTGCCATGGAGATGATCCCTGCCGTCCAGGCTGGCACCCAGCGGTACATGGCACCGGAGCTCTTGGACAAGACTCTGGACCTTCAGGACTGGGGCACAGCCCTGCGGCGAGCTGACGTCTACTCTCTGGCTCTGCTCTTGTGGGAGATTATGAGTCGCTGCCGAGATTTGCGACCTGGTGAGGC。
该序列中的N是G或A，A突变的出现导致了Ava-I酶切位点发生变化。
本发明对山羊的品种不做限定，可选的为东宝黑头羊、麻城黑山羊、波尔山羊、宜昌白山羊和马头山羊等山羊品种。
本发明还提供了用于检测上述SNP分子标记的引物对，其特征在于：所述引物对的核酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
本发明还提供了一种试剂盒，其特征在于，包括上述的引物对。
本发明的上述引物对或试剂盒能够用于在山羊产羔数性状检测或山羊育种中的应用。
本发明提供了一种检测山羊产羔数性状的方法，检测山羊的上述SEQ ID NO:1序列中，N标记的单核苷酸是G还是A。
优选的，用上述引物对或试剂盒进行检测。
作为一种可实施的方式，包括以下步骤：提取山羊的基因组DNA，用上述引物对或试剂盒对山羊基因组DNA进行PCR扩增，对扩增所得片段进行Ava I酶切分型，琼脂糖凝胶电泳检测，若观察到186bp和352bp两条带，记为CC基因型；若观察到186bp、352bp和538bp三条带，记为CT基因型；若只观察到538bp一条带，记为TT基因型。
本发明提供了一种与山羊产羔数关联的分子标记辅助选择方法，包括以下步骤：提取山羊的基因组DNA，根据山羊AMHR2基因基因组序列设计引物，用所述引物对山羊基因组DNA进行PCR扩增，对扩增所得片段进行Ava I酶切分型，得到存在Ava I-RFLP多态性的核苷酸序列；该多态性DNA序列如SEQ ID NO:1所示，其189bp处存在一个G/A的等位基因突变，以该多态位点作为分子标记与山羊产羔性状进行关联分析。
本发明提供了一种提高山羊产羔数的遗传育种方法，确定山羊核心群中种羊上述的SNP分子标记，并根据山羊SNP分子标记做出相应的选择：种羊的继代选育挑选SNP标记中第189位碱基为TT型和/或TC型的个体，淘汰CC型个体，以逐代提高该位点基因T的频率，从而提高后代山羊的产羔数性能。
本发明的有益效果：
本发明通过对山羊基因组DNA进行二代测序，获得AMHR2基因上的全部SNP位点，通过分析各位点与产羔性状的相关性，获得了可增加产羔数的分子标记g.26335365C>T。使用该分子标记进行山羊的标记辅助选择，能够极大地增加山羊的产羔数，加快育种进程。通过优选该分子标记的优势T等位基因，能够增加山羊产羔数性状的遗传进展，减少山羊繁殖性状的育种时间，从而有效提高种羊育种的经济效益。
本发明提供了一种用于鉴定影响山羊产羔性状分子标记的引物对和试剂盒，通过该分子标记及引物对，可建立高效准确的分子标记辅助选择育种技术，将其应用于山羊繁殖性状的遗传改良中，从而提高羊的产羔数，挖掘羊的繁殖潜力，进而提高企业肉羊养殖的经济效益，增加其核心竞争力。
附图说明
图1：山羊AMHR2基因片段PCR扩增序列。
图2：本发明对AMHR2基因目的片段进行Ava I-RFLP的检测结果。电泳时使用了浓度为2%的琼脂糖凝胶。其中泳道: M道是DL2000 Marker，左图中第1、2、3、6道及右图中1、3、5、7、8道为CC型；左图中第4、5、8、9道及右图中第2、4、6、9、10道为CT型；左图中第7道为TT型。
具体实施方式
本发明通过对山羊基因组DNA进行二代测序，获得AMHR2基因上的全部SNP位点，结合二代测序结果，通过分析各位点与产羔数性状的相关性，筛选出可用的分子标记g.26335365C>T。本发明针对此标记，获得东宝黑头羊AMHR2基因包含外显子8和部分内含子7、内含子8在内的DNA序列，序列长度为538bp，该DNA序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
本发明实施例以东宝黑头羊为试验动物，采集全血并提取基因组DNA，根据NCBI数据库中AMHR2基因序列设计相应的引物，其序列如下：
上游引物：AAGAAGGTCCTGCCCCTTCAGC（5’→3’）
下游引物：GCCTCACCAGGTCGCAAATCTC（5’→3’）
使用此对引物进行PCR扩增，将所得的PCR扩增片段用限制性内切酶Ava-I酶切分型，得到Ava I-RFLP多态性核苷酸序列，筛选到SEQ ID NO:1所示与山羊产羔数关联的分子标记，该序列的第189位碱基位点处存在一个G/A的碱基突变。验证了上述SNP对应不同基因型个体与其产羔性状之间的相关性，得到筛选g.26335365C＞T的TT基因型母羊个体，有望获得更多的产羔数的结论，对山羊育种繁育有重要意义。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
SNP检测片段的获得及多态位点检测方法的建立
1、山羊基因组DNA的提取
选择麻城黑山羊改良所得肉羊——东宝黑头羊为试验动物，样本来源于湖北省农业科学院畜牧兽医研究所种羊场。采用血液基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司生产）提取山羊全基因组DNA，具体步骤参照试剂盒说明书。对所得基因组DNA进行浓度和质量检测，标上编号置于-80℃冰箱内保存备用。
2、SNP遗传标记检测片段的获得
（1）PCR扩增
根据山羊AMHR2基因组序列（Gene ID: 102175649）设计引物，引物序列信息如下：
上游引物：AAGAAGGTCCTGCCCCTTCAGC（5’→3’）
下游引物：GCCTCACCAGGTCGCAAATCTC（5’→3’）
使用以上引物对东宝黑头羊基因组DNA进行PCR扩增。反应体系见表1。
PCR反应程序设置为：98℃预变性45s; 98℃变性10 s；退火温度设置为58.6℃，时长为30 s；72℃延伸16 s；循环数固定，34×；72℃终延伸5 min；12℃，1 min。4℃保存PCR扩增产物。
借助NEB网站在线检测发现，此序列中第189位碱基处发生了G/A碱基突变，该突变导致限制性内切酶Ava I酶切位点发生变化。
取8.7 μL的PCR产物于PCR管中，向其中加入1.3 μL限制性内切酶Ava I、3 μL10×buffer和7 μLddH2O，37℃酶切1小时，酶切产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察并记录酶切结果。当此位置碱基均为C(即未发生突变时），酶切位点不受到影响，酶切完成后观察到两条带（186bp＋352bp），记为CC基因型；当此位置C和T碱基均存在时（即表现为杂合突变），酶切结果为三条带（186bp＋352bp＋538bp），记为CT基因型；当此位置碱基均为T时（即发生了纯合突变），酶切位点完全消失，酶切后只观察到一条带（538bp），记为TT基因型。结果如图1所示，表明该山羊的基因型为TT。
实施例2
分子标记在山羊群体中的多态性分布检测
本实施例在东宝黑头羊群体中检测山羊AMHR2基因上g.26335365C>T位点进行多态性检验，检测结果如表2所示。
表2 山羊AMHR2基因g.26335365C>T位点基因型频率与基因频率
由表2结果可知：山羊AMHR2基因g.26335365C>T位点在东宝黑头羊群体中存在三种基因型个体，即CC、CT、TT基因型，其中以纯合CC型为优势基因型，等位基因C的基因频率为0.94。经卡方检验，该位点的基因型分布符合哈代-温伯格平衡状态。
实施例3
分子标记与山羊产羔性状的关联分析和应用
为确定山羊AMHR2基因外显子8上的SNP与其产羔表型是否相关，选择500头东宝黑头羊为试验材料，样本采集、相关产羔信息均来自湖北省农业科学院畜牧兽医研究所种羊场。使用PCR-Ava I-RFLP进行多态性检验，并分析对应不同基因型个体与其产羔性状之间的相关性。采用SAS统计分析软件中的GLM程序进行分子标记不同基因型个体性状间的关联分析，采用模型为：
模型1：Y=总体均值+基因型+羊场环境效应+残差
模型2：Y=总体均值+加性效应+显性效应+羊场环境效应+残差。
其中，Y为性状表型值。加性效应=（纯合子1-纯合子2）/2，用1、0、-1分别代表纯合子1、杂合子、纯合子2；显性效应=杂合子-（纯合子1+纯合子2）/2，用1、-1、1分别代表纯合子1、杂合子、纯合子2。统计分析结果如表3所示：
注：表中第一列数据表示同一胎次总产羔窝数。以上数值均为最小二乘值±标准误。同行比较中，不同小写字母代表差异显著（P<0.05）。
由表3可知，在东宝黑头羊群体中，TT突变型个体的头胎产羔数分别高出CT型、CC型0.83头、0.85头（P＜0.05）；对于第三胎产羔数，TT纯合突变个体产羔数显著高于CT型、CC型（P＜0.05）；对于第五胎产羔数，CC型个体较纯合突变TT型少1.92头（P＜0.05），CT型较TT型少1.8头，二者差异显著；TT型个体的第六胎产羔数高出CT型1.43头（P＜0.05），CC型个体与CT型、TT型则差异不显著（P＞0.05）。至于平均产羔数这一性状，TT型个体的表现也明显优于CT、CC型（P＜0.05），TT型个体分别高出CC型、CT型0.72头、0.74头。因此，筛选g.26335365C＞T的TT基因型母羊个体，有望获得更多的产羔数。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种山羊SNP分子标记在东宝黑头羊产羔数性状检测或东宝黑头羊产羔数性状育种中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记位于山羊AMHR2基因外显子8中，核苷酸序列如SEQID NO:1所示，该序列中的N是G或A，A突变的出现导致了Ava-I酶切位点发生变化。
2.一种检测东宝黑头羊SNP分子标记的引物对或试剂盒在东宝黑头羊产羔数性状检测或东宝黑头羊产羔数性状育种中的应用，其特征在于，所述SNP分子标记位于山羊AMHR2基因外显子8中，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该序列中的N是G或A，A突变的出现导致了Ava-I酶切位点发生变化。
3.一种检测东宝黑头羊产羔数性状的方法，其特征在于，检测东宝黑头羊的SEQ IDNO:1所示序列中，N标记的单核苷酸是G还是A。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，用扩增SEQ ID NO:1所示序列的引物对或含有所述引物对的试剂盒进行检测。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取东宝黑头羊的基因组DNA，用扩增SEQ ID NO:1所示序列的引物对或含有所述引物对的试剂盒对东宝黑头羊基因组DNA进行PCR扩增，对扩增所得片段进行Ava I酶切分型，电泳检测；若观察到186bp和352bp两条带，记为GG基因型；若观察到186bp、352bp和538bp三条带，记为GA基因型；若只观察到538bp一条带，记为AA基因型。
6.一种与东宝黑头羊产羔数关联的分子标记辅助选择方法，其特征在于，包括以下步骤：提取东宝黑头羊的基因组DNA，根据东宝黑头羊AMHR2基因基因组序列设计引物，用所述引物对东宝黑头羊基因组DNA进行PCR扩增，对扩增所得片段进行Ava I酶切分型，得到存在Ava I-RFLP多态性的核苷酸序列；该多态性DNA序列如SEQ ID NO:1所示，其189bp处存在一个G/A的等位基因突变，以该多态位点作为分子标记与东宝黑头羊产羔性状进行关联分析。
7.一种提高东宝黑头羊产羔数的遗传育种方法，其特征在于，确定东宝黑头羊核心群中种羊的权利要求1中所述的SNP分子标记，并根据东宝黑头羊SNP分子标记做出相应的选择：种羊的继代选育挑选SNP标记中第189位碱基为AA型和/或AG型的个体，淘汰GG型个体，以逐代提高该位点基因A的频率，从而提高后代山羊的产羔数性能。
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