CN110257532B - Angptl5基因作为牛背膘厚分子标记及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了ANGPTL5基因作为牛背膘厚分子标记及检测方法，通过对牛的全基因组DNA进行PCR扩增后，并通过直接测序的方法检测PCR产物序列存在的SNPs，发现了ANGPTL5基因序列内含子1和内含子2上的4个SNPs位点与牛背膘厚性状的相关性。提供了在DNA水平上，一种简单、快速和有效的筛查和检测与牛背膘厚性状密切相关的遗传标记，可应用于肉牛的分子育种，在牛饲养初期，以功能SNPs作为中国西门塔尔牛背膘厚性状改良的分子育种和辅助选择的标记，能够快速预测和评估牛的背膘厚，从而在降低成本的前提下，进一步提高牛肉质，加快良种选育速度和提高种群品质。

Description

ANGPTL5基因作为牛背膘厚分子标记及检测方法

技术领域

本发明公开ANGPTL5基因作为牛背膘厚分子标记的用途，同时还提供了检测方法，涉及一种与中国西门塔尔牛背膘厚性状相关的ANGPTL5基因单核苷酸多态性及其检测方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

随着肉牛产业和经济的发展，消费者对牛肉品质和口感的要求越来越高，因此，肉质性状和胴体性状在牛育种和性状改良等研究备受关注。肉质性状包括眼肌面积、脂肪颜色、大理石花纹评分，胴体性状包括胴体重、胴体长、胴体深、屠宰率、屠宰PH，净骨重、背膘厚等。其中，背膘厚是在十二至十三肋骨之间的背部肉厚，可以反映出牛的育肥状况，背膘越厚，说明脂肪含量越高，因此，是活体评估肉质性状的一个重要性状。背膘厚受饲料营养、饲养环境和遗传等诸多因素影响。

血管生成素样蛋白（Angiopoietin-ike protein，ANGPTLs）是一类与血管生成素高度同源的分泌糖蛋白家族，是血管生成的重要调控因子。2002年，李增在对人类胎儿大脑cDNA文库进行大规模DNA测序时，克隆了一种新的人类血管生成素样cDNA，根据其与ANGPTLs家族其他几个成员在氨基酸序列上的同源性，将新发现的基因命名为ANGPTL5。

目前，已在人、牛、马、黑猩猩、犬、小鼠、斑马鱼、热带爪蟾、鸡、恒河猴、猪等多种生物中发现了ANGPTL5的存在。牛血管生成素样蛋白5基因位于牛15号染色体，有8个外显子。该基因编码388个氨基酸，氨基酸序列具有N-末端卷曲螺旋结构域和C-末端纤维蛋白原样结构域。其mRNA在牛各组织中均表达，在心脏中表达水平最高，其它组织表达水平均较低。但目前对于牛ANGPTL5基因的功能研究较少。

发明内容

本发明公开ANGPTL5基因作为牛背膘厚分子标记的用途，针对中国西门塔尔牛该基因SNPs进行检测，为牛ANGPTL5基因SNPs的检测分析以及中国西门塔尔牛良种选育和品种改良提供分子标记。

本发明解决的问题在于先设计特异性检测引物，再利用直接测序的方法对中国西门塔尔牛的个体样品进行直接测序，提供了一种简单、快速、准确的牛ANGPTL5基因多态性的检测方法。

本发明所述的ANGPTL5基因作为牛背膘厚分子标记中的用途，其特征在于，该基因的单核苷酸多态性位点包括：

1）牛ANGPTL5基因的第1内含子的SNP1-I1-1776G>A单核苷酸多态性位点；

2）牛ANGPTL5基因的第2内含子SNP2-I2-77T>C单核苷酸多态性位点；

3）牛ANGPTL5基因的第2内含子SNP2-I2-1391C>T单核苷酸多态性位点；

4）牛ANGPTL5基因的第2内含子SNP2-I2-1505A>T单核苷酸多态性位点；

本发明所述的所述的ANGPTL5基因单核苷酸多态性作为牛背膘厚分子标记的检测方法,包括以下步骤：

1）采集需要检测的牛的全血或组织样品，用牛的全血或组织样品进行基因组DNA提取；

2）根据牛ANGPTL5基因序列设计的2对引物如下：

ANGPTL5-1S：5’GAATGTCCTGCTGGCATAGAA 3’；

ANGPTL5-1AS：5’TGAGAATTACTGTGCTGCTACT 3’；

ANGPTL5-2S：5’ATGGGTGTATATGCTTGTGTGT 3’；

ANGPTL5-2AS：5’GCAACTTTCTAACAGCATTCAC 3’；

3）PCR混池扩增产物测序，用所提取的全基因组DNA和权利要求2中的引物，分别进行PCR扩增，PCR反应程序为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，循环35次；延伸72℃ 10 min；16℃保存，备用；PCR反应体系：Taq PCR Mix 10 μL，引物（上游/下游）各 0.5 μL，DNA混池/个体DNA 2 μL，去离子水7 μL，共20 μL体系用于PCR；获得PCR扩增产物1和PCR扩增产物2，送至测序公司测序，采用Seqman软件进行测序结果分析，找出权利要求1所述的分子标记位置，对检测的牛样品进行基因型分析；

4）所述的4个SNPs位点的基因型检测和预测牛背膘厚性状；

其中，拥有I1-1776G>A位点的GA基因型，I2-77T>C的TC基因型，I2-1391C>T的TC基因型和I2-1505A>T的AT基因型的个体具有显著高于其它基因型牛的背膘厚；

本发明所述的4个SNPs中，I1-1776G>A与I2-77T>C强连锁，I1-1776G>A与I2-1391C>T强连锁，I1-1776G>A与I2-1505A>T强连锁，I2-77T>C与I2-1391C>T强连锁，I2-77T>C与I2-1505A>T强连锁，I2-1391C>T与I2-1505A>T强连锁，4个SNPs形成了两个单倍型，分别为ACTT和GTCA；

即本发明所述的4个SNPs位点以及这4个位点形成的2种单倍型均可作为为肉牛背膘厚的分子育种和标记辅助选择标记。

本发明的有益效果在于：

通过对牛的全基因组DNA进行PCR扩增后，并通过直接测序的方法检测PCR产物序列存在的SNPs，发现了ANGPTL5基因序列内含子1和内含子2上的4个SNPs位点与牛背膘厚性状的相关性。提供了在DNA水平上，一种简单、快速和有效的筛查和检测与牛背膘厚性状密切相关的遗传标记，可应用于肉牛的分子育种，在牛饲养初期，以功能SNPs作为中国西门塔尔牛背膘厚性状改良的分子育种和辅助选择的标记，能够快速预测和评估牛的背膘厚，从而在降低成本的前提下，进一步提高牛肉质，加快良种选育速度和提高种群品质。同时，本发明也发现，这4个SNP位点之间也具有高度的连锁性，在分子标记检测过程中可以通过1个SNPs推测其余3个位点的基因型，快速判断个体基因型。解决了SSCP、PCR-PFLP技术的繁琐性和可能存在误差，提高了检测的准确性和精确度。

附图说明

图1为本发明的中国西门塔尔牛ANGPTL5基因PCR产物琼脂糖凝胶结果（注：M.DL2000Marker，E2. E2引物对的PCR产物，E3. E3引物对的PCR产物）；

图2为本发明的中国西门塔尔牛I1-1776 G>A位点、I2-77 T>C位点、I2-1391 C>T位点和I2-1505 A>T位点测序图（注：M. DL2000Marker，E2. E2引物对的PCR产物，E3. E3引物对的PCR产物）；

图3为本发明的中国西门塔尔牛I1-1776 G>A位点三种基因型的测序图；

图4为本发明的中国西门塔尔牛I2-77 A>C位点三种基因型的测序图；

图5为本发明的中国西门塔尔牛I2-1391 T>C位点三种基因型的测序峰图；

图6为本发明的中国西门塔尔牛I2-1505 T>C位点三种基因型的测序峰图；

图7为本发明的中国西门塔尔牛4个SNPs位点连锁分析结果。

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

1、材料和方法

1.1 实验材料

中国西门塔尔牛（28月龄，公牛）血液DNA样品来自内蒙古宝龙山牛场屠宰场。

试验试剂

Taq PCR Mix（诺唯赞），Trizol、DL2000 DNA marker（TaKaRa），DNA loadingBuffer，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（北京天根），琼脂糖（北京鼎国生物技术有限公司），溴化乙锭替代物、甘油（长春鼎国），无水乙醇、冰醋酸（北京化工），Na₂EDTA‧2H₂O、Tris-base（Sigma）。

实验仪器设备

伯乐T100梯度PCR仪购自Bio-Rad公司；天美电子天平分析天平FA1204B购自上海精科；-80℃超低温冰箱、HL-300制冰机购自SANYO公司；DYCZ-20F DNA序列分析电泳仪购自北京六一；TGear微型离心机购自北京天根科技，LX系列400小型离心机北美离心机，凝胶成像分析系统，高速台式离心机、NanoDrop 2000购自Thermo，PCR max实时荧光定量PCR仪购自英国PCR max公司。

实验所用主要软件

使用Primer 6.0设计PCR引物，测序结果数据分析软件SeqMan和统计分析软件SPSS 23.0等。使用HaploView软件分析4个SNP的连锁关系和单倍型。

实验方法

引物设计

根据Ensembl中公布的牛ANGPTL5基因序列（ENSBTAG00000005308），利用PrimerPremier 6.0软件设计7对引物，并由金唯智生物科技（苏州）有限公司合成，引物序列见表1；

表1. ANGPTL5基因引物序列：

提取血液DNA及琼脂糖凝胶电泳检测分析

根据北京天根科技有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒，根据说明书操作步骤，提取牛血液中的基因组DNA。根据DNA片段大小确定凝胶浓度，配1.5％的琼脂糖凝胶25 mL，取4 μL提取好的基因组DNA，用移液器点样，并加入合适的DNA marker指示片段大小。

ANGPTL5基因PCR扩增及SNPs筛查和统计分析

制作混池：将-20℃保存的之前提取的牛的DNA样品，于冰上解冻。待DNA样品完全解冻，将DNA吹打均匀，依次取1 μL于洁净无菌PCR管中，形成一个DNA混合池。

PCR反应程序为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，循环35次；延伸72℃ 10 min；16℃保存，备用。PCR反应体系：Taq PCR Mix 10 μL，引物（上游/下游）各 0.5 μL，DNA混池/个体DNA 2 μL，去离子水7 μL，共20 μL体系用于PCR。取5 μL获得的PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳120 V检测23 min，使用凝胶成像分析系统观察。将符合测序标准的PCR扩增产物送金唯智生物工程(苏州)有限公司测序。个体PCR反应：步骤与上述混池PCR相同。同样需要先检测5 μL PCR产物，以确定是否扩增成功。若凝胶成像分析仪中为单个条带且为目标片段大小，纯化后即送去金唯智生物工程（苏州）有限公司测序。

数据分析：混池模板扩增的PCR产物测序成功后，用SeqMan分析，筛查中国西门塔尔肉牛群体中ANGPTL5基因存在的SNPs位点。确定SNPs位点在基因序列的位置和突变位点。将每个个体DNA为模板获得的PCR产物测序结果各SNPs基因型汇总，并计算基因型和基因频率。将肉牛个体的肉质和胴体数据分别与该群体中的SNPs进行关联分析。所有性状数据均以Mean±SD表示，p<0.05定义为统计学存在显著差异。

结 果

2.1 PCR扩增结果

以混池提取基因组DNA为模板，用设计的2对引物进行扩增（引物见表一），电泳结果显示PCR产物长度与预期980 bp和858 bp相符，条带均一，无二聚体和抹带，结果见图1。

引物的PCR扩增产物测序结果分析显示，引物E2扩增的PCR产物中存在两处明显的套峰，分别是I1-1776处的G>A转换和I2-77处的T>C转换，引物E3扩增的PCR产物中也存在两处明显的套峰，分别是I2-1391处的C>T转换和I2-1505处的A>T颠换。如图2所示。

基于在混池测序结果中发现：对引物2扩增的产物进行测序得到的位点为：I1-1776G>A和I2-77T>C位点，如图3和图4；对引物3扩增的产物测序得到的位点：I2-1391C>T和I2-1505A>T位点各SNPs不同基因型部分测序结果如图5和图6所示。

位点在中国西门塔尔牛群体中的基因型频率和基因频率分析

对于I1-1776G>A位点，在所检测的119头中国西门塔尔牛中，AA基因型个体35头，AG基因型个体62头，GG基因型个体22头，AG基因型在该群体中为优势基因型；对于I2-77T>C位点，在所检测的119头中国西门塔尔牛中，CC基因型个体37头，CT基因型个体60头，TT基因型个体22头，CT基因型在该群体为优势基因型。对于I2-1391C>T位点，在所检测的100头中国西门塔尔牛中，CC基因型个体22头，CT基因型个体47头，TT基因型个体31头，CT基因型为该位点的优势基因型。对于I2-1391C>T位点，在所检测的100头中国西门塔尔牛中，CC基因型个体22头，CT基因型个体47头，TT基因型个体31头，CT基因型为该位点的优势基因型。对于I2-1505A>T位点，在所检测的100头中国西门塔尔牛中，AA基因型个体22头，AT基因型个体47头，TT基因型个体31头，CT基因型为该位点的优势基因型。基因型频率和基因频率如表2所示。

表2.中国西门塔尔牛SNPs基因型频率和基因频率

2.3 ANGPTL5基因SNPs与中国西门塔尔牛肉质和胴体性状关联分析

经SPSS 23.0分析，I1-1776G>A位点与中国西门塔尔牛背膘厚呈显著相关关系（p<0.05），其中GA基因型个体背膘厚（0.30±0.13 cm）显著高于GG基因型个体（0.23±0.11cm）。I2-77T>C位点中与背膘厚呈显著相关关系（p<0.05），CT基因型个体背膘厚（0.30±0.13 cm）显著高于TT基因型个体（0.23±0.11 cm）。I2-1391C>T位点与中国西门塔尔牛背膘厚呈显著相关关系（p<0.05），CT基因型个体背膘厚（0.30±0.14 cm）显著高于TT基因型个体（0.23±0.10 cm）。I2-1505A>T位点与中国西门塔尔牛背膘厚呈显著相关关系（p<0.05），CT基因型个体背膘厚（0.30±0.14 cm）显著高于CC基因型个体（0.23±0.10 cm）。不同基因型的最小二乘均值和标准差如表3所示。

表3.ANGPTL5基因SNPs位点与中国西门塔尔牛背膘厚性状相关性分析

注：同列中被标注不同小写字母的均值代表差异显著（p<0.05）。

基因SNPs位点连锁分析

通过单倍型和连锁分析发现，中国西门塔尔牛的该群体中ANGPTL5基因内含子1和内含子2区域的SNPs发现，I1-1776G>A与I2-77T>C强连锁（D’=1.0，LOD=49.8，r²=0.983），I1-1776G>A与I2-1391C>T强连锁（D’=1.0，LOD=38.5，r²=0.978），I1-1776G>A与I2-1505A>T强连锁（D’=1.0，LOD=38.5，r²=0.978），I2-77T>C与I2-1391C>T强连锁（D’=1.0，LOD=40.54，r²=1.0），I2-77T>C与I2-1505A>T强连锁（D’=1.0，LOD=40.54，r²=1.0），I2-1391C>T与I2-1505A>T强连锁（D’=1.0，LOD=45.71，r²=1.0）。同时，4个SNPs形成了两个单倍型，分别为ACTT（0.550）和GTCA（0.446）。结果如图7所示。

序列表

<110> 吉林大学

<120> ANGPTL5基因作为牛背膘厚分子标记及检测方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 980

<212> DNA

<213> 牛(bos)

<400> 1

gaatgtcctg ctggcataga aatgtaggcc tctcagggaa ccttcttagt atccatagaa 60

ggaatttcaa atggcatgat tcctgaaaga ggaatggctc agcactgtat cacacaggga 120

aatgtgtaac agtcaaggcc ataaaaccac tgtaatggaa agtaggccct aaatgaatcc 180

tcttggaatt ggagaggaaa aaagagagca aaagatttgt ttgtggaagt ttgaattaac 240

caattaacta tatagtcttt ctttgtgtat gtcctaaaat ctcatttttt tctagagtct 300

tatttatgat atattaggta atataacata cttcatatat tttttcttct tcttattttt 360

ttttaatata aaggattctc caggagttaa cattgtagaa gatgaatcta atacaaaagg 420

tgaaagtaaa actaatgcta ctgtttacaa agaagattgt gaggagtcat gtgatattaa 480

aactaaaatt acacgagaag aaaaatattt catgtgtagt aagtattaaa aataaccaga 540

attataaaag tatatgattt attatttcta tggtcgagat ggaaaaatat actttaacat 600

ttgttgagtc atttaccata tatcccgatc atcctaggtt agaggtatat gtcttgggca 660

catagtaggt gcttcacacc taatttacct aatttgtaaa tgaacaattc cttcttctat 720

attatatagc ccagtaacat caagtgacca cagaaggccc tgatactatc aatttgccta 780

ggactatttt cttagtttcg tctgaatcaa tagaaaattt cacctaaatt ttgagggggg 840

aattaattaa tattgaataa ctgctacaat agatataatg caaattcata gccaatttat 900

gtagcaaagc atgaaaaata aagaatttaa aaattttcgc ttttgtttaa aactatttag 960

tagcagcaca gtaattctca 980

<210> 2

<211> 858

<212> DNA

<213> 牛(bos)

<400> 2

atgggtgtat atgcttgtgt gtttgcattt tctttataca aaaatatagc attaatagaa 60

aaaaattaaa agaaagattt aacttagaaa ttaactttca tgatacggaa ttattgcctt 120

ttactttctt attaataaga attggtgaat ttttgacctc ctgcttcttt ctctctcata 180

aagtgagaat tgatattcag aatgttgtct ctcatttata tcagattaaa ttagggggtt 240

aaaatagatt attaggaagc atattttcat tgggacgtac tgaaacaatt gttttcttcg 300

ttaatcttta gttaaacaaa aaagtcctaa gcagaatatg caactctatg tatttagtta 360

gattgagatg ttattgcatt tacatattta tccaaaatca tttaaaaatt ctttatgttt 420

tactgtagtt attttctata acaatataat gtttagcaaa cccgttttat tatgatttaa 480

gggaatttgc aaaattctat tgtttcttat acacgaagta ccaaaaaact actaagaaac 540

atgatggatg agcagcaagc ttccttggat tatttaatta atcaggtatg gctttttttt 600

ttttttttag aactgtgctc ttattgtata tatacattga tatagttagc tagaagtata 660

attgtttgat ttttttaata tccagaaatc tatttagtgc ctactatggc agagacacca 720

tagtaaagta caggcaaaca gaaagcaata accaaaaaaa ggatcttcac ttaaagctta 780

ttcagtctga gcaggggggg ttggggggtg gggcagaaaa atgtattgaa aatgttgtga 840

atgctgttag aaagttgc 858

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

gaatgtcctg ctggcataga a 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

tgagaattac tgtgctgcta ct 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

atgggtgtat atgcttgtgt gt 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

gcaactttct aacagcattc ac 22

Claims (4)

1.ANGPTL5基因的单核苷酸多态性位点作为中国西门塔尔牛背膘厚分子标记物的用途，其特征在于，该基因的单核苷酸多态性位点包括：

1）牛ANGPTL5基因的第1内含子的SNP1-I1-1776G>A单核苷酸多态性位点；

2）牛ANGPTL5基因的第2内含子SNP2-I2-77T>C单核苷酸多态性位点；

3）牛ANGPTL5基因的第2内含子SNP2-I2-1391C>T单核苷酸多态性位点；

4）牛ANGPTL5基因的第2内含子SNP2-I2-1505A>T单核苷酸多态性位点。

2.权利要求1中所述的ANGPTL5基因单核苷酸多态性位点用于检测中国西门塔尔牛背膘厚的检测方法，其特征在于根据牛ANGPTL5基因序列设计的2对引物如下：

ANGPTL5-1S：５’GAATGTCCTGCTGGCATAGAA３’；

ANGPTL5-1AS：５’TGAGAATTACTGTGCTGCTACT３’；

ANGPTL5-2S：５’ATGGGTGTATATGCTTGTGTGT３’；

ANGPTL5-2AS：５’GCAACTTTCTAACAGCATTCAC３’。

3.根据权利要求2所述的检测方法，包括以下步骤：

1）采集需要检测的牛的全血或组织样品，用牛的全血或组织样品进行基因组DNA提取；

2）根据权利要求2设计引物；

3）PCR混池扩增产物测序，用所提取的全基因组DNA和权利要求2中的引物，分别进行PCR扩增，PCR反应程序为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，循环35次；延伸72℃ 10 min；16℃保存，备用；PCR反应体系：Taq PCR Mix 10 μL，步骤2)的上游/下游引物各 0.5 μL，DNA混池/个体DNA 2 μL，去离子水7 μL，共20 μL体系用于PCR；获得PCR扩增产物1和PCR扩增产物2，送至测序公司测序，采用Seqman软件进行测序结果分析，找出权利要求1所述的分子标记位置，对检测的牛样品进行基因型分析；

4）权利要求1中涉及的4个SNPs位点的基因型检测和预测牛背膘厚性状；

其中，拥有I1-1776G>A位点的GA基因型，I2-77T>C的TC基因型，I2-1391C>T的TC基因型和I2-1505A>T的AT基因型的个体具有显著高于其它基因型牛的背膘厚。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：该基因的单核苷酸多态性位点4个SNPs中，I1-1776G>A与I2-77T>C强连锁，I1-1776G>A与I2-1391C>T强连锁，I1-1776G>A与I2-1505A>T强连锁，I2-77T>C与I2-1391C>T强连锁，I2-77T>C与I2-1505A>T强连锁，I2-1391C>T与I2-1505A>T强连锁，4个SNPs形成了两个单倍型，分别为ACTT和GTCA；所述的4个SNPs位点以及这4个位点形成的2种单倍型均可作为肉牛背膘厚的分子育种和标记辅助选择标记。

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