CN102719523B - 一种用于猪背膘厚标记辅助选择的分子标记的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可用于猪背膘厚标记辅助选择的分子标记的方法，通过测定SEQ ID NO:1的5′端第650位核苷酸，以及SEQ ID NO:2的5′端第95位核苷酸，确定猪在该位点的基因型，来判断同品种或同类型猪背膘厚的大小。本发明可用于检测第6、7肋间活体背膘厚、最后肋骨处活体背膘厚、平均活体背膘厚、平均胴体背膘厚等反映猪背膘厚大小的性状，从而为通过标记辅助选择减少背膘厚提高猪的瘦肉率提供新的重要分子标记，并将在猪的育种中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用基因的单核苷酸多态性来评定猪背膘厚度大小，并用于猪背膘厚标记辅助选择的分子标记的方法。
背景技术
现代数量遗传学的原理和方法在猪育种实践中的应用取得了巨大成功，如今它对一些遗传力高且呈连续性正态分布的数量性状仍然是必不可少的选择方法。但对于低遗传力性状，如母猪的产仔数等，选择反应并不理想。另外大多数重要经济性状需要等到成年后才能鉴定，这无疑增大了世代间隔，降低了年遗传改进量。因此，动物遗传育种学家从分子遗传水平上找到性状的遗传差异或与数量性状连锁的遗传标记，从而实现真正的基因型选择。分子遗传学及测定技术的飞速发展，对家畜基因组分析的深入研究起了有力的推动作用。通过基因组分析可以从核酸水平认识遗传物质，鉴定基因型并确定控制表型性状的基因或与该基因紧密连锁的遗传标记，在此基础上可对家畜直接进行基因型选择或标记辅助选择(marker assisted selection，MAS)，且不受性别、时间和环境等因素的影响，从而加快遗传进展。
在当今的猪肉市场，瘦肉产量仍然是决定猪胴体商业价值最重要的因素。世界养猪发达国家的分级标准也是根据胴体瘦肉率的不同将猪胴体划分为不同的等级。在实际工作中，瘦肉率是难以直接测量的，必须屠宰之后才能测，但作为种猪来说，屠宰之后就没有可利用的价值了。因此，人们一直试图寻找一种简便的活体评定瘦肉率的方法，以减少屠宰带来的经济损失。幸运的是，遗传相关分析结果表明，背膘厚与胴体瘦肉率存在极强的负相关(rA＝-0.7～-0.86)，且活体背膘厚有较高的遗传力(h2＝0.4～0.6)(彭中镇等：《猪的遗传改良》，北京，农业出版社，1991)。这一研究结果的发现为通过背膘厚来选育提高猪的瘦肉率成为可能。
目前已研究的与猪的脂肪沉积或是与背膘厚相关的基因有：类胰岛素生长因子2(Insulin like growth
)，黑素皮质激素受体4(Melanocortin-4receptor，MC4R)，瘦素基因(Leptin，LEP)等。尽管影响猪脂肪沉积性能的侯选基因的研究取得了一些重要进展，但猪的重要经济性状通常是数量性状，涉及到的生理生化过程相当复杂，即使同一个数量性状，尽管已揭示其1-2个受控基因，因此其它具有较大效应的新基因或QTL仍有待发现。
可卡因-安非他明调节转录肽(Cocaine-and Amphetamine RegulatedTranscript，CART)是一种神经调节肽(Michael，1999)。人的CART基因定位于5q132，由3个外显子和2个内含子组成。cDNA的核苷酸同源性为92％，编码区同源性更高达95％。这显示CART基因在哺乳动物里是很保守的(Douglass等，1996)。CART肽主要分布于中枢及周围神经系统如：下丘脑、垂体和肾上腺等(Koylu等，1997；傅茂等，2002)。
CART的生理功能
厌食动物的CARTmRNA在下丘脑的弓状核内表达量较高。而肥胖动物由于Leptin信号传递受阻，在下丘脑的弓状核内CARTmRNA几乎无表达。当给小鼠脑内注射重组的CART可抑制正常和饥饿状态下的摄食，说明CART在动物体内可能是一个内源性摄食抑制剂，可通过下丘脑-垂体-肾上腺轴抑制采食，调节体脂含量(Lambert等，1998；Boguslawa等，2006；Judit等，2007)。Elias等(1998)认为Leptin激活这些神经通路有助于产热、消耗能量、减少体脂含量。另外在瘦素缺乏和瘦素受体缺乏的小鼠下丘脑弓状核中，CART的mRNA水平明显降低。瘦素缺乏的小鼠，给予瘦素后下丘脑CART的mRNA水平明显增加，说明CART参与摄食及体内体脂含量的调节(Menyhert等，2007)。Wierup等(2005)研究发现，CART基因敲除小鼠的胰岛素分泌减少，在采食量没有变化的情况下，40周龄小鼠的体脂含量显著增加。认为CART可通过调控动物体内胰岛素的分泌来调控采食行为，减少体脂。
CART的SNP与肥胖的关系
国内外学者对CART基因的SNP与肥胖的关系做了大量的研究。但各种研究的结果差异较大。Guerardel等(2005)分析CART基因5′上游的3.7kb区域，筛查得到31个SNP，发现SNP-3608T＞C与高加索人的肥胖有极显著相关。DelGiudice等(2001)在研究一个遗传肥胖的意大利家族时发现，CART前体蛋白的一个Leu34Phe突变可引起儿童早期肥胖，但后期正常。Yanik等(2006)在此基础上，做了更深入的研究，发现在肥胖家族中CART前体蛋白的Leu34Phe突变，导致体内活性CART肽的显著降低。提示人类肥胖发生可能是由于Leu34Phe突变，导致活性CART肽的缺失引起。
但也有研究持相反观点。Echwald等(1999)筛选到CART3′UTR的多态，发现这种多态性与丹麦高加索人的肥胖不相关。Challis等(2000)筛查英国白人的CART因的全部编码区，发现CART因A1475G位的变异和Ser66Thr的变异与肥胖无关。傅茂等(2002)用PCR-SSCP法也得到CART基因1457位碱基A的缺失与中国人肥胖的发生无显著关联。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用基因的单核苷酸多态性来评定猪背膘厚度大小，并用于猪背膘厚标记辅助选择的分子标记的方法。
发明通过以下技术方案实现上述目的：
发明提供了一种评价猪个体间背膘厚度大小的方法，是利用CART基因单核苷酸多态性来预测脂肪在猪背膘中沉积性能的方法。
本发明检测的是NCBI Genbank数据库中序列登录号为EF581838的序列(SEQ ID NO：1)5′端第650位核苷酸或SEQ ID NO：2的5′端第95位核苷酸C还是T，属于包嘧啶到胸腺嘧啶的碱基置换，以确定猪个体在此位点的基因型，然后通过基因型确定脂肪在背膘中的沉积性能。如果NCBI数据库中序列登录号为EF581838的序列5′端第650位核苷酸及SEQ ID NO：2的5′端第95位核苷酸为C时，其纯合体的基因型为CC；SEQ ID NO：1的5′端第650位核苷酸及SEQ ID NO：2的5′端第95位核苷酸为T时，其纯合体的基因型为TT；它们的杂合体基因型为CT。所述方法中，所述检测NCBI数据库中序列登录号为EF581838的序列5′端第650位核苷酸或SEQ ID NO：2的5′端第95位核苷酸为C还是T的方法包括先PCR扩增含有序列表中序列2的5′端第95位核苷酸的基因组片段，然后对扩增产物进行测序或者用TaqI酶切扩增产物。
通过测定SEQ ID NO：1的5′端第650位核苷酸，以及SEQ ID NO：2的5′端第95位核苷酸，确定猪的基因型，来评价猪个体间背膘厚度大小。
当SEQ ID NO：1的5′端第650位核苷酸及SEQ ID NO：2的5′端第95位核苷酸为C时，基因型为CC，判断猪的背膘厚度较小，瘦肉率较高。
当SEQ ID NO：1的5′端第650位核苷酸及SEQ ID NO：2的5′端第95位核苷酸为T时，基因型为TT，判断猪的背膘厚度较大，瘦肉率较低。
当SEQ ID NO：1的5′端第650位核苷酸及SEQ ID NO：2的5′端第95位核苷酸为一个为C，一个为T时，基因型为CT，判断猪的背膘厚度较大，瘦肉率较低。
所述含有NCBI数据库中序列登录号为EF581838的序列5′端第650位核苷酸(C/T)的基因组片段PCR扩增产物可为SEQ ID NO：2的1039bp的核苷酸片段；TaqI酶切所述1039bp PCR扩增产物，若得到1039bp单一片段，其基因型为TT纯合体；若得到1039bp，95bp及945bp三个酶切片段时，其基因型为CT杂合体；若得到95bp及945bp两个片段时，基因型为CC纯合体。在进行凝胶电泳时，120V，20分钟以内为宜，如果时间过长，94bp的片段会跑出胶外而消失。
更具体地说，测定SEQ ID NO：1的5′端第650位核苷酸及SEQ ID NO：2的5′端第95位核苷酸，可以采用以下方法：先PCR扩增含有SEQ ID NO：2的5′端第95位核苷酸的基因组片段，然后对扩增产物进行测序或者用TaqI酶切扩增产物；所述含有SEQ ID NO：1的5′端第650位核苷酸(C/T)的基因组片段PCR扩增产物为SEQ ID NO：2的1039bp的核苷酸片段；TaqI酶切所述1039bp PCR扩增产物，若得到1039bp单一片段，其基因型为TT纯合体；若得到1039bp，94bp及945bp三个酶切片段时，其基因型为CT杂合体；若得到94bp及945bp两个片段时，基因型为CC纯合体。通过长白-蓝塘F2资源群体各基因型个体的脂肪沉积性能进行评估：
a.CC型个体背膘厚度相对较小；TT和CT型脂肪在背膘中沉积相对较多，且两者背膘厚度基本无显著差异；
b.在反映脂肪沉积性能高的性状如板油重、第6、7肋间活体背膘厚、最后肋骨处活体背膘厚、平均活体背膘厚、平均胴体背膘厚等性状，CC型的值最低，CT值最高，TT型次之，CC型与CT或TT型都呈现显著性差异，
而CT与TT型之间无差异。
本发明的猪可卡因-安非他明调节转录肽及其编码基因CART可用于检测猪的活体背膘厚、胴体背膘厚、板油重等反映猪脂肪沉积性能的性状。即当以猪的基因组为模版，利用表1中相应引物进行PCR扩增，其产物用相应限制性内切酶进行酶切，凝胶电泳后按照上述方法进行基因型及脂肪沉积性能断定。从而为猪的分子育种提供了一个新的遗传标记，并将在猪的育种中发挥重要作用。
附图说明
图1为预测方法流程图；
本发明利用CART基因单核苷酸多态性来评定猪背膘厚度大小，并用于猪背膘厚标记辅助选择的分子标记的方法流程图。
图2为TaqI-RFLP三种基因型(CC，CT，TT)的电泳结果；
本发明中PCR扩增产物的TaqI-RFLP的三种基因型(CC，CT，TT)电泳结果。M：DNA分子量标准DL2000plus(200-2000bp ladder)注，由于跑胶时间过长，94bp的片段已跑出胶外。
具体实施方式
下述实施例中提到的实验方法，如无特别说明均为常规方法。
本发明利用单核苷酸多态性来评定猪背膘厚度大小，并用于猪背膘厚标记辅助选择的分子标记的方法流程图如图1所示，PCR扩增反应体系、PCR扩增反应程序、酶切反应体系分别如表1、表2、表3所示。
具体方法如下述实施例所述。
实施例1用于评定猪背膘厚度大小的SNP所在DNA序列的获得及多态性分析
用于该单核苷酸多态性检测的DNA样品来自猪的基因组，可通过采集猪的唾液或毛囊然后参照常规方法提取其基因组DNA后于-20℃保存备用。
根据序列表中序列1设计引物PCAL/PCAR，它们分别位于该基因的第2显示子(Exon 2)和第三外显子(Exon 3)区，其引物序列如下：
SEQ ID NO：3：
PCAL：5’-GATTGAAGCGCTGCAGGAAGTC-3’
SEQ ID NO：4：
PCAR：5’-CAGGAGGAAGGAATTGCAGGAG-3’
该引物扩增片段长度1039bp，位于猪CART基因的第2内含子上，即SEQ ID NO：1中自序列的5’端第556-1594bp处的核苷酸片段，也即SEQ ID NO：2。
序列分析结果表明在这1039bp的DNA片段中，在SEQ ID NO：2的自5’端第95位(SEQ ID NO：1的第650位核苷酸)存在C-T的突变。当SEQ ID NO：2的5’端第95位核苷酸为C时，该基因假定为由C等位基因控制，当SEQ ID NO：2的5’端第95位核苷酸为T时，该基因假定为由T等位基因控制，这两个等位基因可组成三种基因型：纯合体CC、TT，杂合体CT。
即SEQ ID NO：2的5’端第95位核苷酸为C时，存在1个TaqI酶切位点(T↓CGA)，因此将上述扩增片段用TaqI酶切鉴定其基因型。当基因型为TT时，扩增片段经TaqI酶切后只有1039bp一个片段；当基因型为CC时，扩增片段经TaqI酶切后为94bp、945bp两个片段；当基因型为CT时，扩增片段经TaqI酶切后为1039bp、94bp、945bp bp三个片段；三种基因型的酶切鉴定凝胶电泳图如图2所示。图2中M：DNA分子量标准(200-2000bp ladder)。
PCR扩增反应体系、反应程序以及酶切体系如表1、表2、表3所述。
表1 PCR扩增反应体系
| 扩增体系 | 成份含量 |
| 2×PCR Reaction Mix | 5μl |
| 上游引物(10pM/μl) | 0.4μl |
| 下游引物(10pM/μl) | 0.4μl |
| 模板DNA(50ng/μl) | 0.5μl |
| Taq酶(5U/μl) | 0.2μl |
| 双蒸水 | 3.5μl |
| 总体积 | 10μl |
注：所使用的Taq酶为TaqMix Kit(广州东盛生物科技有限公司)
表2PCR扩增反应程序
酶切反应体系为：
表3酶切反应体系
| 酶切体系 | 成份含量 |
| 10×Buffer | 1μl |
| PCR产物 | 7μl |
| 限制性内切酶 | 0.5μl |
| 双蒸水 | 1.5μl |
| 总体积 | 10μl |
所用限制性内切酶为TaqI，酶切温度为65℃，酶切4h。检测时用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。
实施例2长白×蓝塘F2资源群体中标记基因型与性状关联分析
用于该单核苷酸多态性检测的DNA样品来自长白×蓝塘F2资源群体，共230个DNA样品。采用常规方法提取其基因组DNA后于-20℃保存备用。
首先建立如下的分析模型以消除性别、体重及批次对表型值的影响：
yijkl＝μ+si+bj+gk+riCovW+eijkl
其中，yijkl是性状观察值，μ为最小二乘均数，si为性别效应(i＝1为公猪，i＝2为母猪)，bj为批次效应(j＝1～4)，gk基因型效应(k＝CC，CT和TT)，ri为协变量的回归系数，Covw为宰前活体重协变量，eijkl为误差。假定服从N(0，σ2)分布。
应用该模型就可以直接分析基因型的效应，同时进行基因型间的两两比较。
试验猪群基因型与经济性状关联分析是应用82版本的SAS软件中一般线性模型中的最小二乘法来完成的。利用之前我们获得的TaqI-RFLP基因型检测结果，对具有经济性状的长白×蓝塘F2资源群体(共计230头份)进行了基因型与背膘厚相关性状(板油重、活体背膘厚、胴体背膘厚)间的关联分析(TaqI-RFLP突变位点，即序列表中序列2的第95位核苷酸)。在消除了性别、体重及批次等的影响后，基因型间脂肪沉积相关性状的简单均数和标准差分析结果总结于表4。
其中，检测并关联分析的性状及其缩写如下：
板油重leaf fat weight(LFW)，
第6、7肋间活体背膘厚live backfat thickness between 6th and 7th ribs(BFA)，
最后肋骨处活体背膘厚live backfat thickness at last rib(BFB)，
平均活体背膘厚average live backfat thickness(BFAV)，
平均胴体背膘厚mean of carcass backfat thickness(CBFM).
结果表明，在板油重、第6、7肋间活体背膘厚、最后肋骨处活体背膘厚、平均活体背膘厚、平均胴体背膘厚等方面，147个基因型为CC(序列表中序列2的第95位为C的纯合体)的个体分别与10个基因型为TT(序列表中序列2的第95位核苷酸均为T)的个体、73个基因型为CT(序列表中序列2第181位核苷酸均为T和C的杂合体)的个体间均存在显著性差异(P＜0.05)。而TT型与CT型个体间无差异。
表4猪CART基因TaqI-RFLP基因型与脂肪沉积相关性状的关联分析
注：肩注*表述P＜0.05
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种用于猪背膘厚标记辅助选择的分子标记的方法
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 2042
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tttcatcacc atggagagcc cccgcctgcg gctgctgccc ctgctaggtg ccgccctgct 60
gctgctgcta cctctgctgg gcgcccttgc ccaggaggat gccgagctcc agccgcgagc 120
cctggacatc tactctgccg tggaggatgc ctcccatgag aaggagctgg tcggtatccc 180
ccttgcctca gacttccctg ggctgccgcg aggtcccttg ttccccgcct ccctacccct 240
ttccccagag tcagggcgcg gggagactcc cgctgtcacc tgaagaatgt ctccagcccc 300
caggctcccg atagtctgta gagcggatcc tttatcccag ctcctcggag caacaggagt 360
cttcgcggtt cctggacctg cggtcagtac gcgggacagc gctaagtttc tatctcttaa 420
acggccctct ttgtggagtc ccctggagga atgtgtgtga ttcccgggct ccttacaaca 480
agggctggag gtgagcacct gggctgggct cacagccaag gtggcaactt ggggctccgt 540
gggtggtgtg ttgcagattg aagcgctgca ggaagtcctg aagaagctca agagtaaacg 600
tatcccgatt tatgagaaga agtatggcca agtccctatg gtaaggcttc gaggtcaccc 660
cgcttcatgt ttttccaaga tgaaacacac caacttgagt tttacacaca gccttctccc 720
caggatgtgg ctaataattc atacaatggg tttgcagaat tctgtgggct cccctttatt 780
tccatggttg acccttgccc cttggtctct aaggttaaag accaggttgg gctgttttgg 840
aggatgggac aggttgtgcc aggaatcagc tcttgggtct gtgtgaaaag gagtatttcc 900
tgagaatgtg cttttaattt ttttaacttc atgaagaatt ctctgagttg gaaggaccag 960
agaattaagt ctagtaagtt cctttccctc caattttctt cctgacttcc ggagcactgc 1020
cagtttttaa aaatctaagt tctaggatca aaaattccaa tgcatacaaa cacacgcgcg 1080
cacacacaca cacacacaca cacaccccac actgaactct ttcttcttgg gataaggagg 1140
ggggagcagg ggtgatgaaa atatatagtc tgttgttcat ttcttagtta acatgtctgc 1200
ttgatttttt atcttttgga tgagaaacta aatgagccag aaaatgtcac tttcccacaa 1260
aatgtagaag aaagtaggag gggctcaata atttaaatat ctgtcttttt atggtctctc 1320
actgggatta taaacacaag gctctgggca tttcaggcct gactatactt agacccattg 1380
tgatggtgac agggtccatc cagctcttcc ataaggcaaa aactgttgat ggagagatgt 1440
gcctgctggg agcatgggtt tcctcaagtg ggatggttac acattgtgtt gtttgcagtg 1500
tgacgcagga gagcagtgcg ccgtgcgaaa aggagctaga atcgggaagc tgtgtgactg 1560
tccccgagga acctcctgca attccttcct cctgaagtgc ttatgagacg tccacccttc 1620
tccttaagta ccccccccca acacacacac accccacttt cctcagacga ccatactttc 1680
atccctggct ttagcaacaa agtttgtatt ttcctttgag aaaaaggggc tcttttcctg 1740
gctgtttcca aataaaagaa cacattagac gtttctgtgt gaacagtaat gccttgtatg 1800
gtgttgatat gtgtgcaaag cattcttatt ttatctgcct gacaaacttt tgtgtatatt 1860
tgagtaaaga aggggaactt cacctcaaaa tttgtatttt tgtaggtggc atggcaggat 1920
gaaactagat ctagtgaatc ttggtagatg acatcacaac ctggaaacta aattacccca 1980
agcatcacaa attgaagcat gtaaaaacta tacataataa agtgtttttc ataattgccc 2040
ta 2042
<210> 2
<211> 1039
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gattgaagcg ctgcaggaag tcctgaagaa gctcaagagt aaacgtatcc cgatttatga 60
gaagaagtat ggccaagtcc ctatggtaag gcttcgaggt caccccgctt catgtttttc 120
caagatgaaa cacaccaact tgagttttac acacagcctt ctccccagga tgtggctaat 180
aattcataca atgggtttgc agaattctgt gggctcccct ttatttccat ggttgaccct 240
tgccccttgg tctctaaggt taaagaccag gttgggctgt tttggaggat gggacaggtt 300
gtgccaggaa tcagctcttg ggtctgtgtg aaaaggagta tttcctgaga atgtgctttt 360
aattttttta acttcatgaa gaattctctg agttggaagg accagagaat taagtctagt 420
aagttccttt ccctccaatt ttcttcctga cttccggagc actgccagtt tttaaaaatc 480
taagttctag gatcaaaaat tccaatgcat acaaacacac gcgcgcacac acacacacac 540
acacacacac cccacactga actctttctt cttgggataa ggagggggga gcaggggtga 600
tgaaaatata tagtctgttg ttcatttctt agttaacatg tctgcttgat tttttatctt 660
ttggatgaga aactaaatga gccagaaaat gtcactttcc cacaaaatgt agaagaaagt 720
aggaggggct caataattta aatatctgtc tttttatggt ctctcactgg gattataaac 780
acaaggctct gggcatttca ggcctgacta tacttagacc cattgtgatg gtgacagggt 840
ccatccagct cttccataag gcaaaaactg ttgatggaga gatgtgcctg ctgggagcat 900
gggtttcctc aagtgggatg gttacacatt gtgttgtttg cagtgtgacg caggagagca 960
gtgcgccgtg cgaaaaggag ctagaatcgg gaagctgtgt gactgtcccc gaggaacctc 1020
ctgcaattcc ttcctcctg 1039
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gattgaagcg ctgcaggaag tc 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
caggaggaag gaattgcagg ag 22
Claims (2)
1.一种用于猪背膘厚标记辅助选择的分子标记的方法，其特征在于：通过测定SEQ ID NO:2的5′端第95位核苷酸，确定猪的基因型，并以此来判断猪个体间背膘厚度大小；
所述SEQ ID NO:2序列是以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列为引物，以猪的基因组为模板进行PCR获得；
所述猪为长白猪与蓝塘猪杂交所得猪；
所述SEQ ID NO:2的5′端第95位核苷酸均为C时，基因型为CC，判断猪的背膘厚度较小，瘦肉率较高；
所述SEQ ID NO:2的5′端第95位核苷酸均为T时，基因型为TT，判断猪的背膘厚度较大，瘦肉率较低；
所述SEQ ID NO:2的5′端第95位核苷酸为一个为C，另一个为T时，基因型为CT，判断猪的背膘厚度较大，瘦肉率较低。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于测定SEQ ID NO:2的5′端第95位核苷酸的方法为：先PCR扩增含有SEQ ID NO:2的5′端第95位核苷酸的基因组片段，然后对扩增产物进行测序或者用TaqI酶切扩增产物；所述PCR扩增产物为SEQ ID NO:2所示的1039bp的核苷酸片段；TaqI酶切所述1039bp PCR扩增产物，若得到1039bp单一片段，其基因型为TT纯合体；若得到1039bp，94bp及945bp三个酶切片段时，其基因型为CT杂合体；若得到94bp及945bp两个片段时，基因型为CC纯合体。
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