CN101142481B - 一种检测猪肉质性状及胴体性状的方法 - Google Patents

一种检测猪肉质性状及胴体性状的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测猪肉质性状及胴体性状的方法。本发明所提供的检测猪肉质性状及胴体性状的方法，是用由具有序列表中SEQ ID NO：1和SEQID NO：2的核苷酸序列组成的一对引物对待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定自序列表中SEQ ID NO：3的5′端第177位碱基为A还是G。

Description

一种检测猪肉质性状及胴体性状的方法
技术领域
本发明涉及一种检测猪肉质性状及胴体性状的方法。
背景技术
中国是养猪大国，也是猪种资源最丰富的国家，很早就开始将野猪驯化为家猪。经过长期选择，形成了许多各具特色的地方品种，仅《中国猪品种记》(张仲葛主编，中国地方猪品种志，上海科技出版社，1986)记载的就有48个。与国外的商品猪相比，中国地方品种具有许多突出的优点：肉质好，产仔数高，抗逆性好和适应性强等，但却有着两个共同的缺点：瘦肉率低和增重慢。因此，增加胴体瘦肉率和提高生长速度一直是我国家猪的遗传改良工作的主要目标。
胴体性状主要包括以下两个方面：一方面是胴体各组分的度量值，如背膘厚度、眼肌面积、胴体长、小肠长度以及各种内脏重等；另一方面是各组成的重量百分比，如屠宰率、腿臀比率、腿臀肉骨率、板油率和内脂率等。
肉质是一个综合性状，它包括一系列的评价指标。关于肉质的定义在各个国家有所差异，广泛接受的是Hofmann(1994)的定义，即肉质应考虑感官属性(性状)、技术因素、营养价值、卫生和毒性或食品的安全性等方面。在猪的育种中，度量肉质性状的主要指标包括以下内容：pH值(pH1、pH2)、系水力(失水率、滴水损失、贮存损失、熟肉率)、肌内脂肪含量、嫩度(剪切力)、大理石纹、肉色、肌纤维直径等。
许多胴体性状属于数量性状，由多基因控制、并存在主基因(major gene)效应。由于胴体性状表现晚且不便活体测量，采用常规育种方法对其进行选择周期长，收效慢。分子生物学技术的发展，使人们可以在DNA水平寻找控制胴体性状的主基因或与其紧密连锁的分子标记，在育种过程中用于标记辅助选择(marker assisted selection，MAS)，以便提高选择进展，更好地改善胴体品质，满足人们的需要，同时获得较大的经济效益。
目前，通过候选基因法，已经找到了一些影响猪的胴体品质的基因。位于猪12号染色体上的生长激素基因(GrowthHormon，GH)是神经分泌内生长轴中调控动物生长发育的核心基因，其产物生长激素具有调节新陈代谢、促进生长发育等作用，是与猪的生长和胴体性状相关的主要候选基因，中外学者对它的基因型与生产性状的关系进行了广泛的研究。Knorr等(Knorr C，Moser G，Muller E，Geldermann H.Associations of GH gene variants withperformance traits in F2 generations of European wild boar，Pietrainand Meishan pigs.Anim Genet，1997，28：124-128.)发现梅山猪与皮特兰猪杂交的F2代群体中，不同的GH基因型与8个胴体性状显著相关。李加琪等(李加琪，陈赞谋，刘德武，刘小红，孙宝丽，凌飞，张豪，陈瑶生.IFG-1基因对长白×蓝塘猪资源群生产性能的遗传效应分析。遗传学报，2003，30(9)：835-839)发现在长白×蓝塘猪构建的资源群体中类胰岛素生长因子1(Insulin-like growth factor I，IGF-I)不同基因型对断奶后日增重、骨率、胴体瘦肉量和皮脂率等性状有显著影响。刘桂兰等(刘桂兰，蒋思文，熊远著，郑嵘，屈彦纯.IGF2基因PCR-RFLP多态性与脂肪沉积相关性状的关联分析。遗传学报，2003，30(12)：1107-1112)分析了类胰岛素生长因子2(Insulin-like growth factor II，IGF-II)基因第8内含子两个NciI酶切位点的多态性在大白猪×梅山猪构成的F2代中的多态性分布情况，发现B位点B1B1基因型的个体显著比B2B2基因型的个体背膘薄18.28％(P＜0.01)，瘦肉率高8.71％(P＜0.01)。垂体转录因子(Pituitan transcription factor1，PIT1)是生长激素、催乳素和促甲状腺素重要的调节因子，Yu等(Yu TP，Tuggle CK，Schmitz CB，Rothschild MF.Association of PIT1 polymorphismswith growth and carcass traits in pigs.J Anim Sci，1995，73：1282-1288)曾报道PIT1与平均背膘厚存在显著相关，近年来Kuryl等(Kuryl J，Pierzchala M.Association of POU1F1/RsaI genotypes with carcass traitsin pigs.J Appl Genet，2001，42：309-316.)和Brunsch等(Brunsch C，Sternstein I，Reinecke P，Bieniek J.Analysis of associations of PIT1genotypes with growth，meat quality and carcass composition traits inpigs.J Appl Genet，2002，43：85-91)分别在不同的资源家系中检测到PIT1与数种胴体性状相关。其它与胴体性状相关的候选基因还包括生长激素释放素(GHRH)、瘦素(Leptin)、生长素(Ghrelin)、肌细胞生成素(Myogenin)、生长激素抑制素(somatostat in，SS)、黑素皮质激素受体4(Melanocortin-4，MC4R)和生长素受体(growthhormone receptor，GHR)(Xia，et al.，2003)、MSTN(Jiang YL，Li N，Plastow G，Liu ZL，Hu XX，Wu CX.Identificationof three SNPs in the porcine myostatin gene(MSTN).Anim Biotechnol，2002，13：173-178)等基因。位于18号染色体上的瘦素基因(Leptin)被认为是与生长、胴体性状相关的一个基因(Sasaki S，Clutter AC，Pomp D.Assignment of the porcine obese(leptin)gene to chromosome 18 bylinkage analysis of a new PCR-based polymorphism.Mamm Genome，1996，7：471-472)，但Jiang等(Jiang ZH，Gibson JP.Genetic polymorphisms inthe leptin gene and their association with fatness in four pig breeds.Mamm Genome，1999，10：191-193)的研究却没有发现明显的关联。位于猪9号染色体上的肌细胞生成素(Myogenin)是MyoD基因家族的成员，主要功能是调节成肌细胞分化为肌纤维。Te Pas等(Te Pas MF，Soumillion A，HardersFL，Verburg FJ，van den Bosch TJ，Galesloot P，Meuwissen TH.Influencesof myogenin genotypes on birth weight，growth rate，carcass weight，backfat thickness，and lean weight of pigs.J Anim Sci，1999，77：2352-2356.)在两个大白猪群中检测了该基因的多态性，分析发现不同基因型的个体在出生重、生长速度和瘦肉量等性状上有显著差异。对两个选择系肌肉的MyoD基因家族成员mRNA表达水平比较发现F-系(选择生长速度)中myogenin、myf-5、MyoD1的mRNA表达水平比L-系(选择瘦肉率)高，在F-系中，背膘厚与成肌细胞的表达成负相关(Te Pas MF，Verburg FJ，GerritsenCL，de Greef KH.Messenger ribonucleic acid expressionof the MyoD genefamily in muscle tissue at slaughter in relation to selection forporcine growth rate.JAnim Sci，2000，78：69-77)。Kim等(Kim KS，LarsenN，Short T，Plastow G，Rothschild MF.A missense variantof the porcinemelanocortin-4 receptor(MC4R)gene is associated with fatness，growth，and feed intake traits.Mamm Genome，2000，11：131-135)在5个猪商品系中检测到MC4R基因遗传变异与背膘厚显著相关。刘桂兰等(刘桂兰，蒋思文，熊远著，郑嵘，屈彦纯.猪资源家系MC4R基因扫描及其与脂肪性状的相关分析。遗传学报，2002，29(6)：497-501)对大白×梅山的F2代174个体检测发现MC4R基因多态性与猪胸腰椎间膘厚(P＜0.05)、臀部膘厚(P＜0.02)、平均背膘厚(P＜0.04)、眼肌宽度(P＜0.003)、眼肌面积(P＜0.05)、皮率(P＜0.02)呈显著相关。
采用基因组扫描法，研究者们还定位了一些影响胴体性状的数量性状位点(QTL)。影响背膘厚的主基因被定位于第2和7号染色体上(de Koning DJ，Janss LL，Rattink AP，van Oers PA，de Vries BJ，Groenen MA，van derPoel JJ，et al.Detection of quantitative trait loci for backfatthickness and intramuscular fat content in pigs(Sus scrofa).Genetics，1999，152：1679-1690)。Paszek等(Paszek AA，Wilkie PJ，Flickinger GH，Miller LM，Louis CF，Rohrer GA，Alexander LJ，Beattie CW，Schook LB.Interval mapping of carcass and meat quality traits in a divergent swinecross.Anim Biotechnol，2001，12：155-165)利用119个分子标记对116个F2个体的胴体和肉质性状进行分析后发现在猪12号染色体上存在影响胴体长、第10肋骨背膘厚、平均背膘厚、板油率、眼肌面积和肌内脂肪含量等多个性状的QTL。最近，Clop等(Clop A，Ovilo C，Perez-Enciso M，CercosA，Tomas A，Fernandez A，Coll A，et al.Detection of QTL affecting fattyacid composition in the pig.Mamm Genome，2003，14：650-656)对伊比利亚猪与长白猪构建的F2进行基因组扫描，发现12号染色体上存在影响不饱和脂肪酸(亚麻酸)含量的QTL。Yue(Yue G，Schroffel JR，Moser G，Bartenschlager H，Reiner G，Geldermann H.Linkage and QTL mapping forSus scrofa chromosome 12.Journal of Animal Breeding and Genetics，2003，120：95-102)等以野猪、梅山猪和皮特兰构成的三个F2群体为研究对象，在12号染色体上发现了数个影响13-14肋骨间的背膘厚、瘦肉切割率等性状的QTL。据统计，除了SSC16和SSC17外，猪的所有染色体上均发现了影响背膘厚的QTL(Bidanel JP，Rothschild MF.Current status of quantitativetrait locus mapping in pigs.pig news and information，2002，23：39N-53N)。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。这种变异可能是转换(C→T，在其互补链上则为G→A)，也可能是颠换(C→A，G→T，C→G，A→T)。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的SNP约占2/3，其它几种变异的发生几率相似。
SNP检测方法常采用一些已有的成熟技术，如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)等，也采用根据DNA列阵的微测序法、动态等位基因特异的杂交、寡聚核苷酸特异的连接、DNA芯片以及TaqMan系统等。但不管哪一种方法，首先必须进行靶序列的扩增，然后才能进行其它检测。
发明公开
本发明的目的是提供一种检测猪肉质性状及胴体性状的方法。
本发明所提供的检测猪肉质性状及胴体性状的方法，是用由具有序列表中SEQ ID №：1和SEQ ID №：2的核苷酸序列组成的一对引物对待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定自序列表中SEQ ID NO：3的5′端第177位碱基为A还是G。
如果PCR扩增产物的单核苷酸多态性检测结果是自序列表中SEQ ID NO：3的5′端第177位碱基，即自序列表中序列4的5′端第512位碱基为G时，其纯合体的基因型为GG；自序列表中SEQ ID NO：3的5′端第177位碱基，即自序列表中序列4的5′端第512位碱基为A时，其纯合体的基因型为AA；它们的杂合体基因型为AG。
其中，GG基因型个体的平均背膘厚度极显著地高于AG基因型和AA基因型的个体，GG基因型猪的眼肌面积极显著地低于AG基因型和AA基因型的个体。在失水率和pH性状中，该等位基因不同等位基因型与性别有较强的互作效应，其中在不同等位基因中，公猪的失水率和pH性状变化不显著，而不同等位基因基因型的母猪个体之间变化很显著，表现为G等位基因纯合的母猪个体失水率稍高于A等位基因纯合的母猪个体，而且杂合子母猪的失水率显著的高于杂合子公猪的失水率。而在pH值性状中，不同性别的纯合个体的pH值之间差异不显著，而在杂合体中，母猪的pH值显著的低于公猪的pH值，表明G等位基因体现的是显性效应。
所述单核苷酸多态性检测可采用DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)、根据DNA列阵的微测序法、动态等位基因特异的杂交、寡聚核苷酸特异的连接、DNA芯片以及TaqMan系统等进行检测。
本发明的第二个目的是提供一种猪肉质性状及胴体性状相关基因。
本发明所提供的猪肉质性状及胴体性状相关基因，名称为MNTF1，具有由序列表中序列4的核苷酸序列组成的核苷酸片段。
含有本发明的猪肉质性状及胴体性状相关基因的载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1a为Sfi I A和Sfi I B接头序列
图1b为pBluescript II SK(-)的物理图谱
图2为猪血液基因组DNA的PCR扩增产物电泳图谱
图3为PCR扩增产物的测序峰图
实施发明的最佳方式
实施例1、MNTF1的获得
利用Clontech公司的SMART cDNA Library Construction Kit和改造的pBluescript II SK克隆载体(pBluescript II SK的改造载体，具体为将pBluescript II SK(-)的EcoR I和Not I之间的序列改造为Sfi I A和SfiI B接头序列，利用Sfi I A和Sfi I B酶切后可定向插入cDNA片断(SfiI A→Sfi I B)。Sfi I A和Sfi I B接头序列和pBluescript II SK(-)的物理图谱分别如图1a和图1b所示)，用猪胚胎发育第55天的骨骼肌组织的mRNA，按照常规方法构建了全长cDNA文库。通过对文库克隆子的测序获得了大量的在骨骼肌组织中表达的基因。
利用比较功能基因组学原理和方法，利用BLAST在NCBI的数据库中进行比对没有发现在人鼠以及其它物种存在同源基因，仅在牛物种中存在同源EST，它具有由序列表中SEQ ID №：4的核苷酸序列(cDNA)组成的核苷酸片段，将该基因命名为猪MNTF1基因。
应用cDNA macroarray分析发现该基因在不同的发育阶段具有差异表达，应用Northern杂交试验验证了该基因是一个在不同发育时期差异表达的基因。
根据猪cDNA序列设计一对引物：
5’-GCGAGAAGCACCAGCCAGAA-3’(PrimerL)，
5’-TCAAGGCGGGAGTGAAGCAG-3’(PrimerR)
以RH克隆板(INRA-Minnesota porcine radiation hybrid panel，ImpRH)中的猪×仓鼠杂种体细胞的DNA(购自法国农业科学院，Laboratoirede Génétique Cellulaire，INRA)为模板进行PCR扩增。扩增条件为：95℃变性3min；94℃变性20s，65℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环。最后在72℃延伸3min。其中的反应体系组成如表1所示。
表1.PCR的反应体系
Figure G60839427150141001D000071
扩增片段经2％的琼脂糖凝胶电泳进行PCR扩增片段分型。其中，阳性结果的为1，阴性结果的为0。结果为：
0010000010101100001001000010000001011000000110001000000000111000001110 100000001001101000111101000001100001000101000000，将该结果提交到IMpRH数据统计分析服务器
(http://www.toulouse.inra.fr/lgc/pig/RH/IMpRH.html/)上进行分析，得到如表2的结果：
表2.PCR扩增片段分型的分析结果
Figure G60839427150141001D000072
经过生物信息学分析和同源性比较，在人基因组、小鼠基因组等物种的基因组中没有发现该基因的同源基因或者同源序列。
实施例2、MNTF1的部分DNA序列的单核苷酸多态性的检测
1、引物设计
用由具有序列表中序列4核苷酸序列的cDNA序列为信息探针，获得猪MNTF1的UniGene编号Ssc.6303。利用DNAStar分析工具分析在该基因的外显子区域中的突变位点。根据上述cDNA序列以及分析获得的突变位点信息设计扩增引物。序列如下：
5’-GCGAGAAGCACCAGCCAGAA-3’(正向)(序列1)，
5’-TCAAGGCGGGAGTGAAGCAG-3’(反向)(序列2)
2、PCR扩增及其产物的纯化、克隆和测序
分别以129头猪(30头通城猪，39头大白猪，30头长白猪，15头大长通和15头长大通三元杂交群体)血液基因组的总DNA为模板进行PCR扩增。其中，反应体系：10×缓冲液2μl，Mg2+(15mMol/L)2μl，每种引物0.2μmol/L，100μmol/L dNTP混合物，1.5U Tag DNA聚合酶，模板DNA 20ng。其中，10×缓冲液来自于TaKaRa Taq试剂盒(TaKaRa公司，Code No.：DR100A)反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环，72℃延伸5min下进行PCR扩增。PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示，表明获得的PCR产物大小约为333bp，1-5泳道分别为通城猪，大白猪，长白猪，大长通和长大通三元杂交群体猪血液基因组的总DNA的PCR扩增产物，M泳道为DNA分子量标记(100-1000bpladder)。然后按照如下方法进行PCR产物的纯化、克隆和测序：
(1)PCR产物的纯化：在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml Ependorff管中，于70℃温育至凝胶完全融化，然后用PCR产物纯化试剂盒(Promega)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是在每300μl融化的凝胶中加入1ml树脂(Resin)，混匀20s，将Resin/DNA混合物装入注射器，使浆液通过微柱(Minicolumn)挤出。再在注射器中加入80％的异丙醇2ml，轻推活塞使异丙醇通过Minicolumn挤出，取下Minicolumn装入1.5ml Ependorff管中，10,000g离心2min以干燥Resin，将Minicolumn装入另一个干净的1.5ml Ependorff管中，加入30-50μl无菌水，静置1min，10,000g离心20s，以洗脱DNA存于Ependorff管中。
(2)连接反应：将纯化的PCR产物与pGEM-T easy载体连接，连接反应总体积是5μl，其中包括2.5μl 2×缓冲液，0.5μl的T载体，1.5μl的纯化PCR产物，0.5μl的T4DNA连接酶，置16℃水浴过夜。
(3)感受态细胞的制备：从37℃培养了16-20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2ml LB中，于37℃振荡培养3h，转接1ml菌液于含有30ml LB的瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待OD600达到0.3-0.4时将瓶从摇床取出置冰浴冷却10-15min，然后将菌液转入离心管中于4℃4,000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，冰浴30min，重复4℃4,000g离心10min一次，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，置4℃保存备用。
(4)转化：无菌状态下取100-120μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3-4min，加入400μl无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。
(5)质粒的小量制备：挑取平板上的单菌落，接种于2-3ml LB中，37℃300r/min培养过夜。用1.5ml EP管12000r/min离心数秒收集菌体。每管加入100μl用冰预冷的溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0))，涡旋振荡至菌体充分悬浮。加入新配制的溶液II[0.2M NaOH，1％SDS]200μl，快速颠倒混匀，冰浴5min，然后加入预冷的溶液III(5M乙酸钾，冰乙酸11.5ml，H2O 28.5ml)150μl，混匀后冰浴5min，12000r/min离心5min，将上清转至另一EP管中，加入苯酚:氯仿:异戊醇500μl，涡旋振荡，离心后小心吸取上层水相，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r/min离心5min，沉淀用70％乙醇洗涤2次，抽干，加入含有RNA酶的TE 20μl。
(6)重组质粒的酶切鉴定：取3μl质粒DNA与双蒸水混匀，使其总体积为10μl，加入5U限制性内酶EcoR I及1μl相应的10×限制性内切酶反应缓冲液，轻弹管壁混匀并离心，置37℃水浴1-2小时，取2-3μl反应液于琼脂糖凝胶电泳检测，得到酶切结果与预计完全相同的目的重组质粒。
(7)测序：重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序，序列测定由上海博亚生物技术有限公司完成。测序结果表明该PCR产物的长度为333bp，自序列表中SEQ ID NO：3的5′端第177位碱基，即自序列表中序列4的5′端第512位碱基处存在G、A两个等位基因(图3)。图3中，箭头所指的是多态位点。
实施例3、检测猪背膘厚度，眼肌面积，失水率和pH值
以62头纯繁通城猪、22头纯繁长白猪、24头长白♂×(大白×通城)♀和21头大白♂×(长白×通城)♀三元杂交组合猪，共129个个体为实验对象进行性状关联分析，具体方法如下：
1、按照实施例2中步骤2的方法，分别以上述129头猪的猪血液基因组的总DNA为模板，在引物5’-GCGAGAAGCACCAGCCAGAA-3’(序列1)和5’-TCAAGGCGGGAGTGAAGCAG-3’(序列2)的引导下进行PCR扩增，对扩增产物进行测序。如测序结果表明自序列表中SEQ ID NO：3的5′端第177位碱基，即自序列表中序列4的5′端第512位碱基为G时，其纯合体的基因型为GG；自序列表中SEQ ID NO：3的5′端第177位碱基，即自序列表中序列4的5′端第512位碱基为A时，其纯合体的基因型为AA；它们的杂合体基因型为AG。
2、用如下最小二乘模型分析(屠宰体重，胴体重，屠宰率，瘦肉重，脂肪重，骨重，平均膘厚，眼肌面积)和肉质性状(肌间脂肪含量，pH值，失水率，大理石纹评分，肉色，滴水损失)：
yij＝μ+GENOTYPEi+GROUPj+GENOTYPEi×GROUPj+εij，
其中，yij是性状观察值，μ为总体均数，GENOTYPEi为基因型效应，GROUPj为不同杂交组合的效应，GENOTYPEi×GROUPj为这两者的互作效应，εij为随机误差，假定服从N(0，σ2)分布。
结果表明在所检测的群体中，GG基因型的个体有89个，AA基因型有9个个体，TT基因型有31个个体。不同基因型之间性状的性状显著差异的结果(最小二乘均数和标准误分析)如表3、表4、表5所示，其它性状在不同的基因型之间没有显著的差异。表3表明，GG基因型的平均背膘厚度均极显著地高于AG基因型和AA基因型的猪(P＜0.01)。相反，GG基因型猪的眼肌面积均极显著地低于AG基因型和AA基因型的猪(P＜0.01)。说明G等位基因是影响背膘厚的增效基因，而A等位基因是影响眼肌面积的增效基因。
表3.不同基因型与背膘厚性状和眼肌面积性状的关联分析
Figure G60839427150141001D000111
注：**表示在0.01水平上差异极显著。
表4表明该等位基因不同等位基因型与性别有较强的互作效应，G等位基因纯合的母猪个体失水率稍高于G等位基因纯合的公猪个体。两者差异不显著，同样A等位基因纯合的不同性别的个体的失水率之间差异不显著，但G等位基因纯合个体的失水率大于A等位基因纯合个体的失水率，而在杂合个体中，母猪的失水率显著的高于公猪的失水率。
表4.不同基因型与失水率的关联分析
Figure G60839427150141001D000112
注：*表示在0.05水平上差异显著。
表5表明在pH值性状中，不同性别的纯合个体的pH值之间差异不显著，但G等位基因的纯合个体的pH值低于A等位基因纯合个体的pH值，而在杂合体中，母猪的pH值显著低于公猪的pH值，表明G等位基因体现的是显性效应。
表5.不同基因型与pH值的关联分析
Figure G60839427150141001D000121
注：*表示在0.05水平上差异极显著。
工业应用
本发明的检测猪肉质性状及胴体性状的方法可用于检测猪背膘厚度，眼肌面积，失水率和pH值，将在猪的育种中发挥重要作用。

Claims (5)

1.检测猪肉质性状及胴体性状的方法，是用由序列表中SEQ ID №：1和SEQ ID №：2的核苷酸序列组成的一对引物对待测猪的基因组DNA进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定自序列表中SEQ ID NO：3的5′端第177位碱基为A还是G；
自序列表中SEQ ID NO：3的5′端第177位碱基为G时，其纯合体的基因型为GG；自序列表中SEQ ID NO：3的5′端第177位碱基为A时，其纯合体的基因型为AA；它们的杂合体基因型为AG；
GG基因型猪的平均背膘厚度高于AG基因型和AA基因型的猪；
GG基因型猪的眼肌面积低于AG基因型和AA基因型的猪；
GG基因型猪的失水率大于AA基因型的猪；AG基因型猪中，母猪的失水率高于公猪的失水率；
GG基因型猪的pH值低于AA基因型的猪；AG基因型猪中，母猪的pH值低于公猪的pH值。
2.猪肉质性状及胴体性状相关基因，是由序列表中序列4的核苷酸序列组成的核苷酸片段。
3.含有权利要求2所述的猪肉质性状及胴体性状相关基因的载体。
4.含有权利要求2所述的猪肉质性状及胴体性状相关基因的细胞系。
5.含有权利要求2所述的猪肉质性状及胴体性状相关基因的宿主菌。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102559890A (zh) * 2011-12-28 2012-07-11 中山大学 一种评价猪的脂肪沉积性能的方法
CN102719523A (zh) * 2011-12-28 2012-10-10 中山大学 一种用于猪背膘厚标记辅助选择的分子标记的方法

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100591692C (zh) * 2007-08-13 2010-02-24 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种猪脂肪沉积相关蛋白及其编码基因与应用
CN103215365B (zh) * 2013-04-26 2015-10-28 广西大学 一种陆川猪及其肉制品的dna分子鉴定方法
CN110157816B (zh) * 2019-06-06 2022-04-26 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种鉴定猪的肌纤维直径大小的方法及其所用引物对
CN110157818B (zh) * 2019-07-08 2023-04-25 云南东恒经贸集团猪育种有限公司 一种与猪眼肌高产性状相关的分子标记及其应用
CN110343774A (zh) * 2019-08-31 2019-10-18 贵州大学 一种鉴别贵州地方猪种与大白猪的klf8基因中sv103分子标记及其检测技术
CN110373483A (zh) * 2019-08-31 2019-10-25 贵州大学 一种与香猪产仔数相关的nelfa基因中sv40分子标记及应用
CN110343772A (zh) * 2019-08-31 2019-10-18 贵州大学 一种鉴别香猪与大白猪的结构变异smc1a基因中sv320分子标记及其检测技术
CN110452996A (zh) * 2019-08-31 2019-11-15 贵州大学 一种与香猪产仔数相关的fstl5基因中sv477标记及其检测方法
CN110343773A (zh) * 2019-08-31 2019-10-18 贵州大学 一种用于鉴定香猪品种的结构变异tro基因中sv108分子标记及其检测技术
CN110343771A (zh) * 2019-08-31 2019-10-18 贵州大学 一种用于鉴定中国地方猪种香猪的结构变异klf8基因中sv322分子标记及其检测技术
CN110373481A (zh) * 2019-08-31 2019-10-25 贵州大学 一种区分大白猪和贵州地方猪品种的dkk2基因中结构变异sv91及其检测技术
CN112111580B (zh) * 2020-09-08 2022-07-01 中国肉类食品综合研究中心 青峪猪源性成分的鉴别方法
CN112646896A (zh) * 2020-12-24 2021-04-13 贵州大学 一种依据arnt基因中结构变异sv323区分大白猪和贵州地方猪品种的检测技术
CN112626231A (zh) * 2020-12-24 2021-04-09 贵州大学 一种利用smad5基因中sv314分子标记区分中国地方猪品种与大白猪的检测技术
CN112538536B (zh) * 2020-12-24 2023-07-25 贵州大学 一种区分香猪和大白猪的sv289分子标记及其检测技术
CN112626230A (zh) * 2020-12-24 2021-04-09 贵州大学 一种利用dgkk基因中sv119分子标记区分大白猪和香猪的检测技术
CN114369669B (zh) * 2022-01-20 2023-12-12 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 一种与猪肉质性状相关的分子标记及其应用
CN116287281B (zh) * 2022-08-10 2024-03-15 武汉中粮肉食品有限公司 一种与长白猪眼肌面积及瘦肉率性状相关的snp分子标记及其应用
CN116769931B (zh) * 2023-07-11 2024-03-26 华中农业大学 一种与猪胴体直长有关的snp标记及应用
CN117487936B (zh) * 2024-01-02 2024-03-26 江西农业大学 影响长白猪眼肌面积的snp分子标记及其应用
CN118460742A (zh) * 2024-07-15 2024-08-09 海南省农业科学院三亚研究院(海南省实验动物研究中心) 一种与大白猪眼肌面积相关的snp分子标记及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1540350A (zh) * 2003-10-31 2004-10-27 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种诊断猪瘟抗体的间接酶联免疫吸附测定方法
EP1222312B1 (de) * 1999-09-28 2004-12-29 Cytonet GmbH & Co. KG Multiplex-pcr zum nachweis von ehec-infektionen

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1222312B1 (de) * 1999-09-28 2004-12-29 Cytonet GmbH & Co. KG Multiplex-pcr zum nachweis von ehec-infektionen
CN1540350A (zh) * 2003-10-31 2004-10-27 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种诊断猪瘟抗体的间接酶联免疫吸附测定方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
孙立彬.猪钙蛋白酶抑制蛋白基因的克隆、多态及其与肉质性状和背膘厚间的关系研究.《中国优秀硕士学位论文全文数据库》.2004, *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102559890A (zh) * 2011-12-28 2012-07-11 中山大学 一种评价猪的脂肪沉积性能的方法
CN102719523A (zh) * 2011-12-28 2012-10-10 中山大学 一种用于猪背膘厚标记辅助选择的分子标记的方法
CN102719523B (zh) * 2011-12-28 2014-06-25 中山大学 一种用于猪背膘厚标记辅助选择的分子标记的方法

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