CN110452996A - 一种与香猪产仔数相关的fstl5基因中sv477标记及其检测方法 - Google Patents
一种与香猪产仔数相关的fstl5基因中sv477标记及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种与香猪产仔数相关的SV477标记及其检测方法,其特征在于:SV477结构变异较猪参考基因组(Sscrofa 11.1)缺失477bp,位于类叶酸5基因(Follistatin‑like 5,FSTL5)内含子2中,区间为chr8:50916421‑50916897。对香猪繁殖性状和结构的关联分析显示,SV477缺失或正常对其产仔数有显著影响,在所有胎次中,II型所对应的的产仔数最高,产仔数最低的是DD型。
Description
技术领域
本发明涉及家畜分子生物学检测领域,具体来说,涉及一种与香猪产仔数相关的FSTL5基因中SV477标记及其检测方法。
背景技术
猪是重要的经济动物,猪繁殖性能的高低直接影响到养殖业的生产效率和经济效益,然而繁殖性状是一个低遗传力的数量性状,主要包括产仔数、产活仔数、初生重、初生窝重、20日龄窝重、断奶头数、断奶重和断奶窝重等指标,如何提高母猪繁殖性能是养猪业健康高效、可持续发展的关键,也是当前遗传育种研究的重点和热点。
繁殖性状是由多个基因共同控制的数量性状,遗传力低,受环境等因素影响较大,常规的选育方法难以取得较大的进展(李庆岗等,2014)。近年来,随着分子生物学的快速发展,DNA标记技术在育种上的应用受到人们重视,通过遗传标记的方法对繁殖性状进行选择成为一个热门技术(侯振平等,2006)。运用分子标记辅助选择需与控制该性状的基因进行定位,将基因定位于数量性状位(Quantitative Trait Locus,QTL)找到相关的候选基因位点(王爱华等,2002)。因此,从分子水平上找到繁殖性状调控基因并将其运用到育种上已成为主流趋势。目前,分子标记及其检测技术已经发展到了第三代,主要以单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)、表达序列标签(Expressed sequence Tag,EST)、结构变异(structure variation,SV)为主。
结构变异SV通常是指获得与缺失变异(PAVs presence/absence variants)和拷贝数变异(CNVs,copy numbervariants),包括缺失、插入、串联重复、倒置等,结构变异的片段长度较大,因此比SNP有更多可遗传核苷酸序列(0.5%-1%:0.1%)(Conrad et al.,2010;Pang et al.,2010),对基因组和动物性状的影响的权重可能更大,是遗传变异产生的主要原因。
类叶酸5(Follistatin-like 5,FSTL5)是卵泡抑素家族的一个成员,编码生成分泌性糖蛋白。研究显示,这个家庭的成员中FSTL1和FSTL3在发育、动态平衡和先天性疾病中发挥重要作用,且发现FSTL5基因在气味感知方面发挥作用(Masuda et al.,2014)。FSTL5基因中的1个错义突变和CNV的发生可能与产生精神分裂症的有关,并提示FSTL5基因可能在精神分裂症的产生和发展有关(GardeLLa et al.,2017)。FSTL5基因可能对肝癌细胞起抑制作用,抑制肿瘤细胞的增殖与促进细胞的凋亡(Zhang et al.,2015)。本发明所述的结构变异SV477位于FSTL5基因内含子2中,缺失片段大小为477bp,与繁殖相关的QTL性状为乳头数和子宫容量。提示FSTL5基因的结构变化可能与猪的繁殖性状相关。
发明内容
本发明要解决的技术问题是:提供一种与香猪产仔数相关的FSTL5基因中SV477标记及其检测方法。
本发明的技术方案是:一种与香猪产仔数相关的FSTL5基因中SV477标记,是指该结构变异较猪参考基因组(Sscrofa 11.1)缺失477bp,位于类叶酸5基因(Follistatin-like 5,FSTL5)内含子2中,区间为chr8:50916421-50916897。将结构变异SV477存在的两种基因命名为D或I,.三种基因型分别命名为DD、DI和II型,其中II为正常基因型、DD为纯合缺失的基因型、DI为杂合缺失的基因型。
本发明还提供用于检测香猪品种结构变异SV477类型的一组引物,引物信息分别为:正向引物FSTL5-F:TGGCCATCTTCCTTATCTTATGAG,反向引物FSTL5-R:AACACCTTCTGCAGCTTAATAACAA。目的序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2,SEQ ID No.3为实际缺失序列。
本发明可提供检测前述与香猪产仔数相关的FSTL5基因中SV477标记的PCR试剂盒,所述试剂盒包含上述引物FSTL5-F和FSTL5-R。所述试剂盒还包括10×PCRMix、去离子水。
本发明提供所述SV477标记在鉴定香猪产仔数中的检测方法。
所述检测方法包括以下步骤:
(1)提取香猪的基因组DNA;
(2)以上述香猪基因组DNA为模板,利用所述引物FSTL5-F和FSTL5-R,进行PCR扩增,检测猪基因组SV477的基因型;
(3)根据上述检测结果,如果目的片断纯合不缺,则待测猪有产仔数较高的可能性;如果此片断缺失,则待测个体有低产仔数倾向。6.步骤(2)中进行PCR所用的扩增体系,10μL。
PCR反应条件为:
所述香猪产仔数相关的分子标记SV477可作为辅助选择技术应用于高产香猪选育。
所述的应用包括以下步骤:
(1)采用PCR技术检测该SV477位点在香猪群体中的基因型分布情况。
(2)应用SPSS v20.0中的卡方检验进行双侧检验,分析高产仔数香猪群体与低产仔猪香猪群体SV477的基因型分布频率。
(3)根据结构变异SV477进行有高产仔数优势母猪的选育。
在本发明的实施例中,以结构变异SV477位点(chr8:50916421-50916897)为候选位点,通过PCR技术检测该位点在群体中的结构变异分布情况;如果待测个体SV477区段纯合不缺,则待测猪属于有高产仔数优势的个体。该结构变异位点的检出,为揭示猪产仔数分子机理和标记辅助选择的实施提供理论基础。
本发明的有益效果:
(一)本发明提供的分子遗传标记不受猪的年龄、性别、饲养环境营养和营养等因素的限制,可用于香猪种猪的早期选择,例如在香猪刚出生时就可准确地进行后备种猪的筛选,从而提高养猪业的经济效益。
(二)本发明提供的分子标记检测方法准确可靠,操作简便,检测所需的条件普通实验室可以满足。
(三)本发明可作为分子标记用于产仔数性状的辅助选择,为猪产仔数的分子标记辅助选择提供技术支持。
附图说明
图1为本发明实施例1中SV477基因型检测结果,M:DL2000DNA Marker;1-2:II型;3-4:DI型;5-6:DD型。
具体实施方式
以下实例对本发明做进一步的解释,但不限定本发明的范围,若无特别指明,实施例中所用的技术方法和条件均为本领域技术人员所熟知的技术方法和常规实验条件,或按照相关试剂厂商说明书建议的方法和条件。
实施例1结构变异SV477的检测方法,步骤如下:
1.猪血液/组织基因组DNA提取
本方法采用天根生化科技(北京)有限公司生产的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒,从猪血液/耳组织中提取基因组DNA,具体方法如下:
1)前处理。血液:从-80℃超低温冰箱中取出猪血液样品,待其自然溶解完全后,取300μL的血液于1.5mL的离心管中,加入900μL的红细胞裂解液后不断上下颠倒数次后,10000rpm离心1min,吸去上清,留白色沉淀(此步骤可多重复,直至溶液澄清)。加入200μL缓冲液GA及20μL Proteinase K,漩涡混匀;耳组织:取小于50mg的耳组织置于2μL的离心管中,用手术剪刀充分剪碎;加入200μL缓冲液GA及20μL蛋白酶K,漩涡混匀,56℃消化2-4小时(每隔0.5h混匀一次)至组织块消化完全;
3)然后在向离心管中加入200μL缓冲液GB,充分颠倒混匀后,放入70℃水浴锅中消化10min,此时溶液变澄清,离心30s去除管内壁水珠;
4)向离心管中加入无水乙醇200μL后漩涡混匀15s。
5)将吸附柱分别放入收集管中并按顺序编号标记。
6)将上一步所得的溶液倒入相应编号的吸附柱CB3中,进行12000rpm离心1min,弃废液;
7)吸附柱再次放回收集管中,向柱中加入500μL缓冲液GD,12000rpm离心1min后弃废液。
8)将吸附柱CB3放回收集管中,向其中再加入600μL的漂洗液PW,12000rpm离心1min后弃废液。
9)将吸附柱CB3放回收集管中,重复操作步骤8。
10)将吸附柱CB3再次放回至收集管中后,进行2min空离(12000rpm),弃废液,室温放置30min从而使吸附材料中残留的漂洗液中的乙醇能够彻底晾干(乙醇存在会影响后续酶反应实验)。
11)将晾干后的吸附柱转移至已经灭菌过的1.5mL离心管中,然后向吸附膜的中间部位悬空滴加80μL的洗脱液TE,静置2min后,12000rpm离心2min(如果想提高基因组DNA的得率,可再将离心得到的溶液加入吸附柱CB3中重复一次,静置2min,12000rpm离心2min)。
12)将离心管中的溶液(基因组DNA)分装,密封保存于-20℃冰箱备用。
2.目标序列的扩增
参考NCBI Genbank收录的该区域的序列设计引物,引物信息分别为:正向引物FSTL5-F:TGGCCATCTTCCTTATCTTATGAG,反向引物FSTL5-R:AACACCTTCTGCAGCTTAATAACAA。以10μL计:
10×PCR Mix | 5.00μL |
FSTL5-F(0.10μg/μL) | 0.10μL |
FSTL5-R(0.10μg/μL) | 0.10μL |
DNA | 1.00μL |
ddH<sub>2</sub>O | 3.80μL |
PCR反应条件为:
本测试方法所包含的引物符合PCR扩增要求,扩增效果稳定、特异性强,PCR扩增结果可准确反应基因组中目标序列的结构变异分布情况。
3.琼脂糖凝胶电泳检测及基因型判断
电泳检测选用1.5%的琼脂糖凝胶。取PCR产物5μL,加入点样孔中,同时加入D2000DNA Marker 0.3μL对参照,设置电压为120V,时间为30min。电泳完成后,做好图像的保存,在凝胶成像系统中观察结果。
每个基因组,以引物FSTL5-F、FSTL5-R组合进行PCR检测。若扩增出单条带且大小为1010bp,将基因型定义为II型;若扩增两条带,一条带大小为1010bp而另一条带为533bp,则基因型定义为DI型;若扩增出单条带而且大小为533bp,将基因型定义为DD型(图1)。
实施例2结构变异SV477的检测及应用
按照实施例1的方法,以猪基因组区域结构变异位点chr8:50916421-50916897为候选位点,通过PCR技术检测SV477在群体(香猪142头,其中产仔数高的个体67头,产仔数低的个体45头)中的结构变异情况,142头香猪的血样采自贵州从江县和清镇。以SV477候选区域,应用本发明建立检测技术分析群体中的结构变异SV5的分布频率(表1),结果显示香猪群体中存在SV477变异,且3种基因型在高低产群体中均被检测出来,并且在香猪高产群体以II型为主,低产群体中以DI型为主。χ2检验结果表明,在香猪高、低产群体之间SV447位点的基因型分布差异显著(P<0.05),等位基因频率之间没有显著差异(P>0.05)。SV477位点在高、低产群体中分布均处于遗传平衡状态(P>0.05)。
对香猪的2胎产仔数进行统计并计算平均值(表2),表中可以看出在第1胎中,II型所对应的的产仔数最高,有7.47±0.01头,最低的是DD型的6.92±0.20头,第2胎中产仔数最高II型平均每胎产10.13±0.29头,比平均产9.33±0.29头的DD型高出0.8头(P<0.01)。
表1香猪群体中候选SV477位点的基因型频率和等位基因频率检测结果
备注:同列肩标含相同字母表示差异不显著(P>0.05),相邻字母表示差异显(P<0.05),相间字母表示差异极显著(P<0.01)。HWE test中P>0.05表示基因型频率在群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态。
表2 SV477位点3种基因型对应的香猪产仔数统计分析
应用本发明建立的检测技术可检测待测个体基因组中结构变异SV477的基因型,不受香猪的年龄、性别、饲养环境和营养等因素的限制,且操作简便,结果准确。虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域的技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
SEQ ID No.1:
<110> 贵州大学
<120> 一种与香猪产仔数相关的FSTL5基因中SV477标记及其检测方法
<210> 1
<211> 533
<212> DNA
<213>香猪SV477区段缺失
<400> 1
AACACCTTCTGCAGCTTAATAACAAAAAACAAACAACCACATCAAAAAATGGACAGATCT 60
AAACAGACAATTCTCCAAAGAAGACACACAAATGGCCCAAAAAAACACATTAAAAGTTGT 120
TCAACATCACTTATTATTAGAGAAATGCAAACCAAAACTACTAAGAGGTACCATCCTACA 180
CCAGCCAGAATTGCCATCATCAAAAAGTCTACAAACAATTAGTGCTGGAGAGGGTGTGGA 240
GGAGGTCTCCAGAGGAGACAGTTTGGGGAGAGGGGGGATGCGCTGGGGTTGTGGAATGGA 300
AATACTATAAAATTGGTTTGTGATGATTTTATTACAACTACGAATGTAATAAATTCATTG 360
AGTAATAATGAAAAAGAAGTGAGTGGTACCAGTGGAATTGGAGTGTTAGGTATAGCTGTA 420
AAGAGTTGATAGAATAAGTGATGGGTGTGAGATTCTGAACAGATTAGGGTGATCTCAAGG 480
GTTTGAGCCACTGAAGAATGTGGTTACTCCTCATAAGATAAGGAAGATGGCCA 533
SEQ ID No.2:
<210> 2
<211> 1010
<212> DNA
<213>香猪SV477区段正常
<400> 2
AACACCTTCTGCAGCTTAATAACAAAAAACAAACAACCACATCAAAAAATGGACAGATCT 60
AAACAGACAATTCTCCAAAGAAGACACACAAATGGCCCAAAAAAACACATTAAAAGTTGT 120
TCAACATCACTTATTATTAGAGAAATGCAAACCAAAACTACTAAGAGGTACCATCCTACA 180
CCAGCCAGAATTGCCATCATCAAAAAGTCTACAAACAATTAGTGCTGGAGAGGGTGTGGA 240
GGAAAAGGAACCCTAGTATGCTGTTGGTGGGATTGTAAATTGGTGCAACTACTGTGGAAA 300
ACTGTATGGATATTCCTCAGAAAACTACAAATAGAACTACCATTTGATCCAGCAATCCCA 360
CTCCTGGGCATCTATCCAGAGAAAACCATGACTTGAAAAGACACATGTACTCCAATATTC 420
ATTGCAGCACTATTTTCAATAGCCAAGACATGGAAACAACCTAAATTTCCATTGACGGAG 480
GAGTGGACCAAGAAGATGTGGTACATATACACAATGGAATATTGCTCAGCTATTAAAATG 540
CGTGTAATAGTGGCATTTTTAGCAACATGGATGGACCTGGAAATTATCATGCTAAGTGAA 600
GTCAGCCATACAATGAGACAGCAACATCAAATGCTTTCACTGACATGTGGAATCTGAAAG 660
AAGGACAGAATGATCTTCTTTGCAGAATGGATACTGACTCACAGACTTTGAAAAACTTAT 720
GGTCTCCAGAGGAGACAGTTTGGGGAGAGGGGGGATGCGCTGGGGTTGTGGAATGGAAAT 780
ACTATAAAATTGGTTTGTGATGATTTTATTACAACTACGAATGTAATAAATTCATTGAGT 840
AATAATGAAAAAGAAGTGAGTGGTACCAGTGGAATTGGAGTGTTAGGTATAGCTGTAAAG 900
AGTTGATAGAATAAGTGATGGGTGTGAGATTCTGAACAGATTAGGGTGATCTCAAGGGTT 960
TGAGCCACTGAAGAATGTGGTTACTCCTCATAAGATAAGGAAGATGGCCA 1010
Claims (5)
1.一种与香猪产仔数相关的FSTL5基因中结构变异SV477分子标记,其特征在于:所述的SV477结构变异为猪参考基因组缺失477bp,位于类叶酸5基因内含子2中,SV477结构变异片段为chr8:50916421-50916897。
2.根据权利要求1所述的一种与香猪产仔数相关的结构变异SV477分子标记,其特征在于:所述的SV477分子标记的引物为:正向引物FSTL5-F:TGGCCATCTTCCTTATCTTATGAG,反向引物FSTL5-R:AACACCTTCTGCAGCTTAATAACAA。
3.如权利要求1或2所述的SV477分子标记在鉴定香猪产仔数中的检测方法,其特征在于:包括以下步骤:(1)提取香猪的血液/组织基因组DNA;(2)以上述香猪基因组DNA为模板,利用所述引物FSTL5-F和FSTL5-R,进行PCR扩增,检测猪基因组SV477的基因型;(3)根据上述检测结果,如果目的片断纯合不缺失,则待测猪有产仔数较高的可能性;如果此片断缺失,则待测个体有低产仔数倾向。
4.根据权利要求3所述的SV477分子标记在鉴定香猪产仔数中的检测方法,其特征在于:步骤(2)中进行PCR所用的扩增体系,10μL。
PCR反应条件为:
5.如权利要求1或2所述的SV477分子标记在香猪产仔数相关的分子标记辅助选择方法中的应用,其特征在于:包括以下步骤:(1)采用PCR技术检测该SV477位点在香猪群体中的基因型分布情况(2)应用SPSS v20.0中的卡方检验进行双侧检验,分析高产仔数香猪群体与低产仔猪香猪群体SV477的基因型分布频率。(3)根据结构变异SV477进行有高产仔数优势母猪的选育。
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- 2019-08-31 CN CN201910819710.XA patent/CN110452996A/zh active Pending
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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