CN110373483A

CN110373483A - 一种与香猪产仔数相关的nelfa基因中sv40分子标记及应用

Info

Publication number: CN110373483A
Application number: CN201910819725.6A
Authority: CN
Inventors: 冉雪琴; 牛熙; 王嘉福; 卢圣菲
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou University
Priority date: 2019-08-31
Filing date: 2019-08-31
Publication date: 2019-10-25

Abstract

本发明公开了提供一种与香猪产仔数相关的NELFA基因中SV40分子标记及应用，其特征在于：SV4结构变异较猪参考基因组(Sscrofa 11.1)缺失40bp，位于NELFA基因的内含子1中，区间为chr8：50916410‑50916886。对香猪繁殖性状和结构的关联分析显示，SV40缺失或正常对其产仔数有显著影响，分析香猪的前3胎产仔数，发现II型所对应的的产仔数最高，产仔数最低的是DD型。

Description

一种与香猪产仔数相关的NELFA基因中SV40分子标记及应用

技术领域

本发明涉及动物分子生物学检测领域，具体来说，涉及一种与香猪产仔数相关的SV40标记及其应用技术。

背景技术

猪是非常重要的经济动物，它的数量性状和质量性状如繁殖力、抗病力、肉质、生长和经济性状产仔数等一直备受学者们的关注，驯化过程中，由于环境气候、地理生态、饲养条件和选育方法等不同，造成国内外猪品种在外貌和性能上差异较大，然而我国地方猪极具特色(尚以顺等，2017)。许多欧洲的国家从上世纪起已经开展关于生长速度、繁殖率、瘦肉率等方面的育种工作，所以许多欧洲家猪在这一系列的重要经济性状上得到了较好的改良(Falkenberg H et al， 2008)，同欧洲发达国家比较，我国地方猪品种的改良及选育起步较晚，因为改良猪品种的发展速度较慢，所以贵州保存着丰富的猪品种资源，这些猪品种肉质、抗病能力、耐粗饲、适应性等方面具有突出的优势，但是繁殖率变化大，生长速度较缓慢(张芸等，2007)。如何在未来的猪品种改良和选育研究中，发挥和保持这些地方猪品种的优势、避开劣势是本领域的研究关键点。

二十一世纪以来，伴随生物信息学和生物工程技术的极速发展，高通量测序技术和全基因组芯片技术应用于猪的转录组和基因组水平研究，全基因组水平的甲基化检测、结构变异等研究，使得中外猪品种间的遗传差异等研究和全方位解析地方猪种的遗传特异性成为可能(Jian Y E et al，2017)。

基因组结构变异包括平衡变异和不平衡变异，在变异类型中，结构变异是相当复杂的一种类型。其中平衡变异主要有以下几种类型，分别是：串联重复、缺失、插入、倒置和易位，(Feuk et al.,2006)。对于物种来讲，结构变异会带来巨大的影响，结构变异会导致基因剂量的改变，还可能使得基因本身的破坏和与新基因相融合，迫使基因发生重新排序，从而导致一些疾病的产生，例如：细胞的癌变导致的癌症(Liu et al.,2009)，神经表达相关的基因结构缺失导致精神分裂 (Vacic et al.,2011)；但并非所有的基因组结构变异都是有害的，某些基因组结构变异会对物种适应新的环境产生有利的影响(Iskow et al.,2012)，像这样的结构变异基因，往往是一个猪种进化产生的一个分支点，与物种的进化密切相关(Petrov,2002；OLson,1999)。在1936 年的时候(MuLLer,1936)，摩尔根等人在果蝇的研究中，发现在果蝇中的棒眼基因Bar的复制会形成棒眼果蝇(Bridges,1936)，可能是基因组结构变异最早的记载。随着高通量测序技术的不断发展与完善，当前已经在动物、植物上取得了重大的进展，在动物上，经过基因组重测序对物种进行分析，在牛(Boussaha etal.,2015)、鸡(Kerstens et al.,2011)、鼠(alvarez et al.,2012)、狗(Keane et al.,2014)等动物中，都检测到了大量的结构变异；通过高通量测序也在高粱 (Zhang et al.,2014)、大豆(Shen et al.,2015，)等植物中检测到了大量的结构变异。

NELFA属于负延伸因子家族成员，参与了RNA聚合酶Ⅱ转录延伸的调控，编码的蛋白可以与HLA-A2限制性位点以及肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞发生反应，为大量癌症患者的特异性免疫治疗提供靶点。胎儿组织中NELFA的表达水平高于成人。本发明所述的结构变异SV40位于NELFA基因内含子1中，缺失片段大小为40bp，定位于黄体数和产活仔数的QTL区域，提示SV40基因的结构变化可能与猪的产仔数相关。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：一种与香猪产仔数相关的NELFA 基因中SV40分子标记及应用。

本发明的技术方案是：一种与香猪产仔数相关的SV40分子标记及应用，是指猪基因组中，候选区域chr8：1111424-1111463的结构变异，该区域的结构变异是基因组中缺失或不缺失40bp片段。该结构变异位于于负伸长率复构件A(Negative ELongation FactorCompLex MemberA，NELFA)基因的内含子1中。将结构变异SV40存在的两种基因命名为I或D，分别对应II、DI和DD基因型。

用于检测与香猪产仔数相关的SV40标记的引物对，所述引物对的信息分别为：正向引物NELFA-F： GCCTTGACCTACTGCATCCATG，反向引物NELFA-R：CAGAACCACGCATACAGTCAGATC。该组引物扩增获得两种序列，分别是SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2。

本发明可提供用于PCR检测前述与香猪产仔数相关的SV40标记的试剂盒，所述试剂盒包含上述引物NELFA-F和NELFA-R。所述试剂盒还包括10×PCRMix和ddH₂O。

本发明提供所述SV40标记在鉴定香猪产仔数中的检测方法。

所述检测方法包括以下步骤：

(1)提取香猪的基因组DNA；

(2)以上述香猪基因组DNA为模板，利用所述引物NELFA-F和 NELFA-R，进行PCR扩增，检测香猪基因组SV40的基因型；

(3)根据上述检测结果，如果目的片断纯合不缺，则待测香猪有产仔数较高的可能性；如果此片断纯合缺失，则待测香猪个体有低产仔数倾向。

步骤(2)中进行PCR所用的扩增体系以20μL为例：

2×PCR Mix	10.00μL
		NELFA-F(0.10μg/μL)	0.20μL
NELFA-R(0.10μg/μL)	0.20μL
		基因组DNA	1.00μL
ddH<sub>2</sub>O	8.60μL
		Total VoLume	20.00μL

PCR反应条件为：

1)预变性：95.0℃5min；2)扩增反应：变性：95.0℃30sec，退火：60.0℃30sec，延伸：72.0℃45sec，30个循环；72.0℃10min。 3)4℃，保存。

所述SV40标记可作为香猪产仔数相关的分子标记辅助选择技术的应用。

所述的应用包括以下步骤：

(1)提取香猪的基因组DNA；

(2)以上述香猪基因组DNA为模板，利用所述引物NELFA-F和 NELFA-R，进行PCR扩增，检测香猪基因组SV40的基因型。

(3)利用SPSSv22.0软件将结构变异与猪的产仔数进行关联分析；

(4)根据结构变异SV40进行有高产仔数优势母猪的选育。

在本发明的实施例中，以结构变异SV40位点(chr8： 1111424-1111463)为候选位点，通过PCR技术检测该位点在香猪群体中的结构变异分布情况；如果待测个体SV40区段纯合不缺，则待测香猪有产仔数较高的可能性；如果此片断纯合缺失，则待测香猪个体有低产仔数倾向。该结构变异位点的检出，为揭示香猪产仔数分子机理和标记辅助选择的实施提供理论基础。

本发明的有益效果：

(一)本发明提供的分子遗传标记不受香猪的年龄、性别和营养和环境等因素的限制，可用于种猪的早期选择，从而为提高养猪业的经济效益提供帮助。

(二)检测结构变异的方法准确可靠，操作简便，检测所需的条件普通实验室可以满足。

(三)本发明可做为分子标记用于香猪产仔数性状的辅助选择，为香猪产仔数的分子标记辅助选择提供技术支持。

附图说明

图1为本发明实施例1中琼脂糖凝胶电泳检测SV40基因型结果，M: DL2000 DNAMarker；1-2:II型；3:DI型；4-5:DD型。

具体实施方式

以下实例对本发明做进一步的解释，但不限定本发明的范围，若无特别指明，实施例中所用的技术方法和条件均为本领域技术人员所熟知的技术方法和常规实验条件，或按照相关试剂厂商说明书建议的方法和条件。

实施例1为本发明的检测方法，步骤如下：

1.猪耳组织基因组DNA提取

使用天根公司离心柱型组织基因组DNA提取试剂盒(目录号： DP304)提取香猪耳组织基因组DNA，步骤如下：

(1)将适量香猪耳组织剪碎置于1.5mL离心管中，加入适量缓冲液GA(50mg耳组织加入200μL缓冲液GA)，彻底振荡使组织碎块悬浮；

(2)加入4μL RNaseA(100mg/mL)，振荡15s，室温放置5min，以去除组织中的RNA；

(3)加入20μL Proteinase K溶液，混匀后置于56℃水浴1～3h，直至组织完全溶解，简短离心以去除管壁的水珠；

(4)加入200μL细胞裂解液GB，充分颠倒混匀，70℃水浴10 min，直至溶液变清亮，说明细胞裂解完全，简短离心以去除管壁的水珠；

(5)加入200μL无水乙醇，充分振荡15s，此时可能会出现絮状沉淀，短时离心以去除管壁的水珠；

(6)将上步所得的溶液和絮状沉淀全部加入CB3吸附柱中，吸附柱放入收集管中，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中，此时基因组DNA被吸附于吸附柱中；

(7)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中，此操作目的是为了去除吸附柱中的蛋白质；

(8)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中，重复此步骤一次，以彻底去除吸附柱中的金属盐离子；

(9)将空吸附柱放入离心机中，12000rpm离心2min，弃掉收集管中残留的漂洗液PW；

(10)将吸附柱盖子打开，室温放置20min，以彻底晾干漂洗液 PW中残余的乙醇，以免影响后续的酶反应实验；

(11)将吸附柱CB3转入一个无菌的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2min后12000rpm离心 2min，将基因组DNA溶液收集到离心管中，-20℃保存。

2.目标序列的扩增

根据NCBI数据库登录的该区域的序列设计引物，所述引物对为：正向引物NELFA-F：GCCTTGACCTACTGCATCCATG，反向引物 NELFA-R：CAGAACCACGCATACAGTCAGATC。以20μL为例：

PCR反应条件为：

本试剂盒所包含的引物符合PCR扩增要求，扩增效果稳定、特异性强，PCR扩增结果可准确反应待测香猪样本基因组中目标序列的结构变异情况。

3.琼脂糖凝胶电泳检测

选用2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。点样时，用微量加样器将PCR 产物5μL，加入点样孔中，同时加入D2000 DNA Marker 0.5μL对照，设置电压为120V，时间为40min。电泳完成后，在凝胶成像系统中观察结果，并进行基因型检测。

实施例2结构变异SV40的检测及应用

按照实施例1的方法，以猪基因组区域结构变异位点(chr8： 1111424-1111463)为候选位点，通过PCR技术检测SV40在群体(香猪 226头，其中产仔数高的个体106头，产仔数低的个体120头)中的结构变异情况，226头香猪的血样采自从江县。以SV40候选区域，应用本发明建立检测技术分析群体中的结构变异SV40的分布频率，结果显示基因分型结果显示，高产群体和低产群体中均有3种基因型，且都以II型为主要基因型(表1)。

统计香猪的前3胎产仔数并计算平均值(表2)，发现在3胎中，均是II型比其余2种基因型拥有更高的产仔数，分别是7.44±0.13、 9.56±0.08和10.36±0.03头。比较分析发现第1胎和第2胎的3种基因型之间产仔数无显著差异，在第3胎中发现DD型每胎比II型少0.95头仔猪 (P<0.01)，且发现在第3胎中，SV40的基因型与对应产仔数之间存在弱相关(P<0.05)。

表1香猪群体中候选SV40位点的基因型频率和等位基因频率检测结果

表2 SV40位点3种基因型对应的香猪产仔数统计分析

序列表

SEQ ID No.1：

<110> 贵州大学

<120> 一种与香猪产仔数相关的NELFA基因中SV40分子标记及应用

<210> 1

<211> 673

<212> DNA

<213> 香猪SV40不缺失时的序列

<400> 1

GCCTTGACCTACTGCATCCATGGCAATGGCTCTTCCCACATAGGACATGGATGAGGGTCC 60

AGGTGAGATGCTGCTCAATGGTGTGACCATGTACCACGTCACTTCGCATCTACGTCACTT 120

CGCCAGGTACCACGTCACTTCGCCAGGTACCACGTCACTTCGCCATGTACCACGTCACTT 180

CACCATGTACGTCACTTCATCATGTACCACGTCACTTCGCATCTACGTCACTTCGCCATA 240

TACGTCACTTCACATCTACGTCACTTCGCCATGTACCACGTCACTTCGCCATTACCAAGT 300

CACTTCGCCATGTACCACGTCACTTCACCATCTACGTCACTTCGCCATGTACCACGTCAC 360

TTCGCCATGTACCACATCACTTCACCATGTACCACGTCACTTCACCATGTACCACATCAC 420

TTCACCATGTACCACGTCACTTCACCATGTACCACGTCACTTCACCATCTACCACGTCAC 480

TTCGCCATGTACCACATCACTTTGCCATGTACCTCGTCACTTTGCCATGTACCTGTCACT 540

TCACCATTTGTGTTAAACTGATGCATACTAATTGTAAAACAATGACCATCTGGGGGCCCA 600

TTCATCCAGCTATCTCTTGGTGCTTTTGCTTCGGATTTCTCATGCATGGGATCTGACTGT 660

ATGCGTGGTTCTG 673

SEQ ID No.2：

<210> 2

<211> 633

<212> DNA

<213> 香猪SV40发生缺失时的序列

<400> 2

GCCTTGACCTACTGCATCCATGGCAATGGCTCTTCCCACATAGGACATGGATGAGGGTCC 60

AGGTGAGATGCTGCTCAATGGTGTGACCATGTACCACGTCACTTCGCATCTACGTCACTT 120

CGCCAGGTACCACGTCACTTCGCCAGGTACCACGTCACTTCGCCATGTACCACGTCACTT 180

CACCATGTACGTCACTTCATCATGTACCACGTCACTTCGCATCTACGTCACTTCGCCATA 240

TACGTCACTTCACATCTACGTCACTTCGCCATGTACCACGTCACTTCGCCATTACCAAGT 300

CACTTCGCCATGTACCACGTCACTTCACCATCTACGTCACTTCGCCATGTACCACGTCAC 360

TTCGCCATGTACCACATCACTTCACCATGTACCACGTCACTTCACCATGTACCACATCAC 420

TTCACCATGTACCACGTCACTTCACCATGTACCACGTCACTTCACCATCTACCACGTCAC 480

TTCGCCATGTACCTGTCACTTCACCATTTGTGTTAAACTGATGCATACTAATTGTAAAAC 540

AATGACCATCTGGGGGCCCATTCATCCAGCTATCTCTTGGTGCTTTTGCTTCGGATTTCT 600

CATGCATGGGATCTGACTGTATGCGTGGTTCTG 633

SEQ ID No.3：

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 香猪SV40实际缺失的序列

<400> 3

ACATCACTTTGCCATGTACCTCGTCACTTTGCCATGTACC 40

Claims

1.一种与香猪产仔数相关的NELFA基因中SV40分子标记，其特征在于：所述的SV40分子标记是指猪基因组中，候选区域chr8：1111424-1111463的结构变异，该区域缺失40bp，或不缺失。

2.根据权利要求1所述的一种与香猪产仔数相关的SV40分子标记，其特征在于：所述的SV40分子标记的引物对为正向引物NELFA-F：GCCTTGACCTACTGCATCCATG，反向引物NELFA-R：CAGAACCACGCATACAGTCAGATC。

3.如权利要求1或2所述的SV40分子标记在鉴定香猪产仔数中的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)提取香猪的血液/组织基因组DNA；(2)以上述提取的DNA基因组为模板，利用2所述引物NELFA-F和NELFA-R，进行PCR扩增，检测香猪基因组SV40的基因型；(3)根据上述检测结果，如果目的片断纯合不缺，则待测香猪有产仔数较高的可能性；如果此片段缺失，则待测香猪个体有低产仔数倾向。

4.根据权利要求3所述的SV40分子标记在鉴定香猪产仔数中的检测方法，其特征在于：步骤(2)中进行PCR所使用的扩增体系为20μL，分别为：2×Taq PCR Master Mix 10μL，浓度10μmoL/L引物NELFA-F/NELFA-R 0.2μL，ddH₂O 8.6μL，浓度10ng/μL基因组DNA 1μL；进行PCR采用的反应条件：1)预变性：95.0℃5min；2)扩增反应：变性：95.0℃30sec，退火：60.0℃30sec，延伸：72.0℃45sec，30个循环；72.0℃10min。3)4℃，保存。

5.如权利要求1或2所述的SV40分子标记在香猪产仔数相关的分子标记辅助选择方法中的应用，其特征在于：包括以下步骤：(1)提取香猪的基因组DNA；(2)以上述香猪基因组DNA为模板，利用所述引物NELFA-F和NELFA-R，进行PCR扩增，检测香猪基因组SV40的基因型；3)利用SPSS 20.0软件将结构变异与猪的产仔数进行关联分析；4)根据结构变异SV40进行有高产仔数优势母猪的选育。