CN109486956B - 猪多组学整合精准育种方法 - Google Patents

Abstract

猪多组学整合精准育种方法，本发明公开了一种与猪产仔性状相关的SNP位点，所述SNP位点位于猪HSD17B1基因第323407415位，该SNP位点的两种等位基因为A或G；所述SNP位点对应的三种基因型分别为AA、GG和AG，基因型为AG和GG的猪相较于基因型为AA的猪有更高的产仔数和窝重。在上述SNP位点的基础上，通过对基因型的选择，可加快高生产效率猪的遗传进展。

Description

猪多组学整合精准育种方法

技术领域

本发明涉及猪多组学整合精准育种方法，具体涉及用以提高猪的繁殖效率的多组学整合精准育种方法。

背景技术

我国养猪业历史悠久，猪种资源丰富，分布广泛，有着巨大的利用潜力和广阔的发展前景。种猪生产是养猪业生产的基础，只有通过科学地饲养管理，种猪才能繁殖出数量多、质量高的仔猪，才能提高养猪业的经济效益。

随着我国经济持续快速的发展，人们的生活水平逐渐提高，对猪肉的需求量也越来越高，因此，人们也越来越关注如何提高猪的繁殖性能。繁殖性能是猪的重要经济性状，包括产仔数、初生重和初生窝重、断乳窝重、初产日龄和产仔间隔等。母猪繁殖力的选育对于提高养猪生产整体效益起到至关重要作用，给养猪业带来巨大经济效益，是影响养猪业生产效率的重要因素之一。

一方面，目前获得高繁殖效率猪的方法主要集中在基因组编辑。在转基因技术和体细胞克隆技术的基础上发展起来的基因组编辑技术，可以通过对目标基因进行“编辑”，包括对特定DNA片段的敲除、特异突变引入和定点DNA片段转入等，从而实现对基因组的精确修饰。我国在基因组编辑猪相关方面研究进展迅速，并获得了一系列农用、医用工程猪。科研人员通过基因操作将有利基因引入特定的位点，从而提高外源基因的稳定性和效率，改变动物的遗传特定，如提高动物的生产性能，最终育成满足人们需要的高产、优质、抗病动物新品种。此外，也可以对于一些负调控动物生长的基因进行修饰或敲除，培育出高产的转基因动物。

然而，人们在对猪肉产量要求提高的同时，越来越注重猪的培育方法对猪品质的作用，对人类健康的影响。由于科学界难以在短时间内证实转基因动物对人类的健康完全无副作用，以及广大群众对转基因动物的认知不足，人们对食用非转基因动物存在强烈的渴求，同时造成了非转基因食用动物价格高于转基因动物。

另一方面，除去基因组编辑技术，其它育种理论的实现同样需要对猪基因组的了解。然而，目前对猪基因组的了解和认识远远不足，对影响猪繁殖效率(包括猪产仔数和平均胎重等)的基因掌握尚不全面，有必要进一步进行研究，满足猪培育方法的需求。

因此，亟需建立一种全新的高繁殖效率猪的培育方法，以满足市场需求，提高经济效益，实现我国猪育种理论和技术水平的提升，实现我国猪种业的跨越式发展。

发明内容

本发明人进行了锐意研究，针对上述猪育种方法中存在的问题，通过全基因组关联分析的方法，丰富了影响猪繁殖效率的SNP位点，同时还提供一种用以提高猪的繁殖效率的多组学整合精准育种方法，该方法未采用基因组编辑手段，提高广大群众接受度，同时克服经典遗传育种理论只考虑DNA序列变异体对性状遗传变异影响的弊端，综合多层次遗传变异效应，从而完成本发明。

本发明的目的在于提供以下方面：

(1)一种与猪产仔性状相关的SNP位点，其中，所述SNP位点位于猪HSD17B1基因第323407415位，该SNP位点的两种等位基因为A或G。

(2)根据上述(1)所述的SNP位点，其中，所述SNP位点对应的三种基因型分别为AA、GG和AG，基因型为AG和GG的猪相较于基因型为AA的猪有更高的产仔数和窝重。

(3)根据上述(1)所述的SNP位点，其中，用以检测所述SNP位点的方法中包括一组扩增引物P₁和P₂，所述扩增引物P₁和P₂的核苷酸序列分别包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列。

(4)根据上述(1)所述的SNP位点，其中，用以检测所述SNP位点的方法中包括延伸引物，所述延伸引物的核苷酸序列分别包括SEQ ID NO.3所示序列。

(5)根据上述(1)所述的SNP位点，其中，用以检测所述SNP位点的试剂盒包括一组扩增引物P₁和P₂，所述扩增引物P₁和P₂的核苷酸序列分别包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列；和/或

用以检测所述SNP位点的试剂盒包括延伸引物，所述延伸引物的核苷酸序列分别包括SEQ ID NO.3所示序列；

具体地，用以检测所述SNP位点的试剂盒包括PCR反应试剂、PCR扩增引物、PCR产物纯化试剂、延伸引物、以及SNP位点对照标本。

(6)一种鉴定或辅助鉴定猪产仔性状的方法，其中，所述方法包括检测猪HSD17B1基因第323407415位脱氧核糖核苷酸为A、或G、或A和G，以确定待测猪的基因型是AA、GG或AG的步骤，或者通过Sequenom MassArray等方法直接确定HSD17B1基因第323407415位基因型的步骤，根据基因型确定猪产仔数和/或窝重：基因型为AG和GG的猪相较于基因型为AA的猪有更高的产仔数和/或窝重，

其中，AA基因型为猪HSD17B1基因第323407415位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体；GG基因型为猪HSD17B1基因第323407415位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体；AG基因型为猪HSD17B1基因第323407415位脱氧核糖核苷酸为A与G的杂合体。

(7)一种高产仔数/窝重的猪的育种方法，其中，所述育种方法包括选择HSD17B1基因第323407415位为GG或AG基因型优选GG基因型的猪作为亲本杂交的步骤。

(8)根据上述(7)所述的育种方法，其中，所述育种方法包括如下步骤：

步骤1，选择HSD17B1基因第323407415位为GG或AG基因型的猪作为亲本杂交，获得F1代仔猪；

步骤2，对F1代仔猪进行基因型分析，选育HSD17B1基因第323407415位为GG或AG基因型的仔猪，成年后继续杂交得F2代仔猪；

步骤3，对F2代仔猪进行基因型分析，选育HSD17B1基因第323407415位为GG或AG基因型的仔猪，成年后继续杂交得F3代仔猪；

重复上述步骤2或3，最终得到基因型GG高遗传性的种猪。

(9)上述(1)所述的SNP位点在鉴定或辅助鉴定猪产仔性状以及育种方面的用途。

(10)上述(3)所述用以检测所述SNP位点的扩增引物在鉴定或辅助鉴定猪产仔性状以及育种方面的用途；和/或

上述(4)所述用以检测所述SNP位点的延伸引物在鉴定或辅助鉴定猪产仔性状以及育种方面的用途。

根据本发明提供的猪多组学整合精准育种方法，具有以下有益效果：

1、本发明发现的与猪产仔性状相关的SNP位点，可用于促进高产仔数猪的育种选择，加快育种过程；

2、本发明提供了用于检测SNP位点和基因分型的试剂盒，其使用方便，操作简单，成本低；

3、选取的与猪产仔性状相关的SNP位点、扩增引物或延伸引物，可有效用于鉴定或辅助鉴定高产仔数/窝重的猪，加快高产仔数猪的遗传进展。

附图说明

图1是实施例2中梅山猪与大白猪HSD17B1基因表达量结果图。

具体实施方式

下面通过对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一个与猪生产效率即产仔性状相关的SNP位点和这个SNP位点的鉴定及应用。本发明运用全基因组关联分析的方法寻找与猪产仔性状相关的SNP位点，以此与猪产仔性状相关的SNP位点应用于猪种选择培育中。

本发明中，选择大白猪或梅山猪进行产仔性状相关的SNP位点的鉴定。大白猪和梅山猪在我国的猪种培育中占较高比重，选择上述两种猪，便于后续对我国猪种的培育。

本发明运用全基因组关联分析的方法寻找与猪产仔性状相关的SNP位点。全基因组关联分析(GWAS)是利用全基因组范围内筛选出高密度的分子标记对所研究的群体进行扫描，分析扫描得出的分子标记数据与表型性状之间关联关系的方法，该方法也是目前进行相关SNP位点筛选最为广泛使用的方法。然而，运用全基因组关联分析的方法寻找与猪产仔性状相关的SNP位点，得到的结果庞杂无序，大多数的基因变异与目标性状并不相关。在此庞杂无序的结果中选择相关SNP位点是相当困难的。因而，有必要预先选择特定的基因，结合GWAS方法确定位于特定基因上的相关SNP位点。

本发明在众多筛选的基因中选择特定的基因，进而确定该基因上SNP位点，极大提高了对于相关SNP位点确定的成功率。

在一种优选的实施方式中，所述特定的基因是HSD17B1基因。

HSD17B1基因是HSD17B家族的一个成员，主要在雌激素生物合成的最后一步发挥作用，在动物生长、发育和生殖过程中具有重要的调控作用，能够将雌激素转化为更有生物活性的雌二醇。目前对HSD17B1与一些生殖疾病的发生、发展进行了关联，但尚未有明确的结论。有研究者在乳腺癌、子宫内膜癌中都检测到HSD17B1基因的表达；不同的研究者还分别对HSD17B1基因的多态性或者变异与乳腺癌、子宫内膜癌的相关性进行研究，结果表明，HSD17B1基因的多态性或者变异都与研究的癌症无显著性相关。

同时了解到，猪生产效率包括产仔数、胎重和窝重等生产力指标。产仔数高低可直接关系到育肥猪的数量多少和猪肉供给量的多少；平均胎重大，变异系数小，说明窝整齐度好，对提高仔猪成活率非常有好处，平均初生重大也可以刺激母猪多产奶；窝重为对产仔数、胎重的综合考量。本发明人认为，上述指标均与产仔性状候选基因相关：胎儿的存活率与猪胎重具有重要的关系，胎盘的相对大小是影响胎儿存活率的主要因素之一，而猪仔妊娠期绒毛膜上皮和子宫内膜上皮形成皱褶，皱褶折叠水平影响着胎盘的相对大小。因而，本发明人认为与猪产奶、胎盘大小有间接关系的HSD17B1基因为影响猪生产效率的产仔性状候选基因。

目前，尚未有HSD17B1基因与猪产仔性状关联的报道。本发明人运用全基因组关联分析的方法对这个基因的多态性与重要的繁殖性状进行了关联分析，经过大量的研究，首次在该猪基因中确定了产仔性状SNP位点。

通过将GWAS方法与筛选的特定基因相结合，本发明得到/提供了一个与猪生产效率即产仔性状相关的SNP位点，所述SNP位点位于HSD17B1基因第323407415位(rs323407415)，该SNP位点的两种等位基因为A或G。优选地，核苷酸A的基因频率为0.159，核苷酸G的基因频率为0.841。

该SNP位点对应的三种基因型分别为AA、GG和AG，AA基因型为猪HSD17B1基因第323407415位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体；GG基因型为猪HSD17B1基因第323407415位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体；AG基因型为猪HSD17B1基因第323407415位脱氧核糖核苷酸为A与G的杂合体。

本发明人进过大量研究发现，基因型为AG和GG的猪相较于基因型为AA的猪有更高的产仔数和窝重。

本发明中利用Sequenom MassArray检测系统确定该SNP位点的基因分型。Sequenom MassArray检测系统的基本原理为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术，首选PCR扩增目标序列，然后加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上，延伸1个碱基。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的真空管经瞬时纳秒(10^-9s)强激光激发，核酸分子解吸附并转变为亚稳态离子(多为单电荷离子)，电厂中离子飞行时间与离子质量成反比，通过飞行时间检测器检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量，从而检测出SNP位点信息。

由上述知，SNP位点基因分型测定过程中，涉及猪基因组的DNA的提取，PCR扩增反应和单碱基延伸反应等步骤。

在一种优选的实施方式中，所述PCR扩增反应中扩增引物P₁和P₂的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

在一种优选的实施方式中，所述单碱基延伸反应中延伸引物的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

即本发明提供了一种与猪产仔性状相关的SNP位点基因分型的检测方法，该方法包括以下步骤：

(1)提取猪的基因组DNA；

(2)以待测猪的基因组DNA为模板，利用扩增引物和延伸引物进行SequenomMassArray检测，确定猪HSD17B1基因第323407415位的基因型。

其中，所述PCR扩增反应中扩增引物(P₁和P₂)如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；延伸引物如SEQ ID NO.3所示。

基于上述与产仔性状相关的SNP位点及基因分型，本发明提供了一种与猪产仔性状相关的SNP位点的检测方法，所述检测方法包括直接测序或者通过试剂盒测定。

所述试剂盒包括(1)SNP位点的PCR延伸引物；优选还包括(2)PCR反应试剂：包括PCR缓冲液、dNTP、PfuDNA聚合酶，SNaPshot混合液；(3)PCR扩增引物P₁和P₂；(4)PCR产物纯化试剂：包括核酸外切酶、虾-碱性磷酸酶，以及纯化用缓冲液；(5)SNP位点对照标本：包括纯合突变阳性对照标本、杂合突变阳性对照标本、阴性对照标本。

所述SNP纯合突变阳性对照标本为含有猪rs323407415位点人工合成为G碱基的质粒。

所述SNP杂合突变阳性对照标本为含有猪rs323407415位点人工合成A和G碱基的两种质粒的混合物。

所述SNP阴性对照标本为人工合成的带有随机碱基的质粒。使用三种对照标本对反应体系进行质量控制，可保证检出结果的一致性。

本发明中提供的检测试剂盒的使用方法为：从猪耳或其它组织细胞中提取DNA样品；配制PCR反应体系，进行PCR扩增、纯化PCR产物；PCR产物与SNP位点的延伸引物同时进行延伸反应；对延伸产物进行毛细管电泳分析；SNP位点分析，进而还可得到基因分型信息。上述SNP位点分析可采用但不限于ABI3730XL自动测序仪。

进一步的，本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定猪产仔性状的方法，包括检测猪HSD17B1基因第323407415位脱氧核糖核苷酸为A、或G、或A和G，以确定待测猪的基因型是AA、GG或AG，或者直接通过Sequenom MassArray等方法确定基因型，根据基因型确定猪产仔数和/或窝重：基因型为AG和GG的猪相较于基因型为AA的猪有更高的产仔数和/或窝重，

其中，AA基因型为猪HSD17B1基因第323407415位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体；GG基因型为猪HSD17B1基因第323407415位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体；AG基因型为猪HSD17B1基因第323407415位脱氧核糖核苷酸为A与G的杂合体。

进一步的，本发明提供了一种高产仔数/窝重的猪的育种方法，包括选择HSD17B1基因第323407415位为GG或AG基因型优选GG基因型的猪作为亲本杂交的步骤。具体的：

步骤1，选择HSD17B1基因第323407415位为GG或AG基因型的猪作为亲本(F0)杂交，获得第一代(F1代)仔猪；

步骤2，对F1代仔猪进行基因型分析，选育HSD17B1基因第323407415位为GG或AG基因型的仔猪，成年后继续杂交得F2代仔猪；

步骤3，对F2代仔猪进行基因型分析，选育HSD17B1基因第323407415位为GG或AG基因型的仔猪，成年后继续杂交得F3代仔猪。

重复上述步骤2或3，最终得到基因型GG高遗传性的种猪。上述方法遵从自然繁殖，通过较少人工干预，获得高产仔数/窝重的种猪；同时，所述育种方法为非转基因方法，群众的接受度更高，可有效促进养猪业发展，提升我国猪种业的核心竞争力。

进一步的，本发明根据上述SNP位点、延伸引物、扩增引物、SNP位点测试方法、SNP位点检测试剂盒、SNP位点基因分型，还可提供基于上述公开在鉴定和/或选育猪种方面的应用，所述猪种具有较高的生产效率，所述生产效率包括产仔数和窝重。

本发明人经过大量研究认为：DNA水平变异对猪群体和个体表型差异的作用被高估，基因组表达调控机制不完全清楚，多层次组学对表型的效应被低估，猪种个性化遗传机制未受到关注。猪品种间、个体间巨大的表型遗传差异不仅取决其基因组结构和DNA顺序的变异，更主要取决于基因组多层次表达调控。为了实现基因组信息的高效应用，有必要开展猪多组学变异研究，整合多组学信息、建立种群个性化多组学整合精准育种理论和技术体系，实现多组学选择。实现多组学整合精准育种理论创新和应用，将显著提升我国猪育种理论和技术水平。

基于上述考量，本发明在转录水平上对影响猪生产效率的因素进行了分析和验证。

本发明提供了一种与猪生产效率即产仔性状相关的基因，所述基因为猪HSD17B1基因。

进一步地，本发明提供了一种鉴定或辅助鉴定猪产仔性状的方法，通过测定猪HSD17B1基因mRNA的表达量，判定猪产仔性状。

上述鉴定或辅助鉴定猪产仔性状的方法，包括获得猪卵巢组织或其它组织细胞的总RNA，经反转录、定量PCR确定猪HSD17B1基因mRNA的表达量，mRNA的表达量越低，猪有较高的产仔数和/或窝重，mRNA的表达量越高，猪有较低的产仔数和/或窝重。

其中，定量PCR扩增程序为：预变性95℃，5min；变性95℃，5s；延伸60℃，30s；重复40个循环；95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s；60℃，15s。

本发明提供了一种用于测定HSD17B1基因mRNA的表达量的PCR扩增引物P₃和P₄，P₃和P₄的碱基序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

本发明提供了一种用于测定HSD17B1基因mRNA的表达量的试剂盒，所述试剂盒包括扩增引物P₃和P₄，P₃和P₄的碱基序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

进一步的，本发明提供了一种高产仔数的猪的育种方法，包括选择HSD17B1基因mRNA的表达量低的猪作为亲本杂交的步骤。具体的：

步骤1，选择HSD17B1基因mRNA的表达量低的猪作为亲本(F0)杂交，获得第一代(F1代)仔猪；

步骤2，对F1代仔猪进行mRNA定量分析，选育HSD17B1基因mRNA的表达量低的仔猪，成年后继续杂交得F2代仔猪；

步骤3，对F2代仔猪进行mRNA定量分析，选育HSD17B1基因mRNA的表达量低的仔猪，成年后继续杂交得F3代仔猪。

重复上述步骤2或3，最终得到低表达量HSD17B1、高遗传性的种猪。

本发明根据上述与猪产仔性状相关的HSD17B1基因、扩增引物、表达量测试方法、表达量检测试剂盒，还可提供基于上述公开在鉴定和/或选育种猪方面的应用，所述种猪具有较高的生产效率，如较高的产仔数。

结合上述基因层面的分析和转录层面的分析，利用多维变异组学技术手段系统阐述遗传变异对选择和驯化的效应，实现了目标群体的多维组学选择，提高了猪育种的准确性，可精准获得高生产效率的种猪。

实施例

实施例1SNP分子标记的获得

1、实验样品采集

来自山东某种猪场的375头大白猪，用于HSD17B1基因SNP分型。逐个采集耳组织样，放于75％的酒精中并-20℃保存，待提DNA。

2、HSD17B1基因SNP分型

2.1猪基因组DNA的提取与检测

(1)剪取适量的猪耳组织，剪碎将其放进1.5mL的Axgen管中。

(2)取50mLBD离心管，将终浓度为0.4mg/mL的蛋白酶K和裂解缓冲液进行混合均匀，向装有猪耳朵组织的1.5mL的离心管中加入0.5mL裂解液进行裂解。

(3)离心管平行均匀的放置于恒温杂交炉的摇板上(严封管盖，以免液体外渗)。55℃放置6个小时以上(消化过程中样品的充分混合是非常重要的。判断依据是无明显肉眼可见的猪耳组织，消化后的混合液成乳状)；

(4)待样品充分裂解后，取出离心管，在每管中加入0.3mL饱和氯化钠溶液，进行颠倒充分混合6-8次，然后放于冰上，冰浴15分钟；

(5)冰浴过后，12000rpm室温离心15分钟，小心缓慢的将上清转移至新的1.5mLAxgen离心管中(小心避免沉淀随上清一起倒出，保持倒的手法要一致，保持每管倒得上清在量上保持相同)；

(6)加入0.7mL的异丙醇(加入异丙醇的量随倒出的上清的量的变化而变化，二者等体积)于各管，颠倒直至溶液中有絮状沉淀出现(若无絮状沉淀，可将溶液-20℃冰箱放置2小时或4℃冰箱放置过夜)；

(7)12000rpm室温离心15分钟，去掉上清液体(此过程中留意观察离心管底部的白色DNA沉淀，切勿将其与上清一起倒掉)；

(8)在各离心管中加入0.5mL 70％乙醇，轻轻颠倒以充分冲洗上述沉淀出来的DNA；

(9)10000rmp离心30s，用200μL微量移液枪将离心管中的乙醇吸掉，将沉淀的DNA留在管中(当心勿将管中的DNA沉淀吸走，此步骤所用的枪头在各离心管间操作时可不用更换)；

(10)自然风干DNA10分钟；

(11)移液枪取0.1mL的TE缓冲液于各管中，将上述DNA沉淀重新溶解，置其于55℃放置2小时，定时摇晃数次，以使DNA充分溶解；

(12)待DNA充分溶解后，用紫外分光光度计测定所提浓度(基因分型需要标化样本DNA浓度和OD值，DNA浓度15-20ng/μL，体积为30μL，A260/230介于1.5～2.3)，并琼脂糖凝胶电泳检测所提质量(可见单一条带)。

(13)将DNA溶液放置4℃过夜，次日取1μL进行PCR(若数星期内使用所提DNA，可在4℃保存；如若长时间不使用，需放置于-20℃环境下)。

2.2SNP芯片基因型判定及基因型数据的质控

将375个大白猪的DNA样品，SNP的相关信息交给北京康普森生物有限公司进行Sequenom MassArray法核酸质谱测序。

以样本DNA为模板，加入PCR扩增引物(P₁和P₂)对以及单碱基延伸引物进行PCR扩增反应，反应产物纯化后与质谱芯片共结晶，用飞行质谱法检测并分型，检测目的基因的SNP位点。

2.3数据整理与分析

1)表型数据分析

利用SAS9.2统计分析软件，对猪初产产仔测定值和经产(2-8次)产仔测定值进行描述性统计分析。

2)单倍型分析

单核苷酸多态性的基因型和等位基因频率的计算是使用PopGene3.2实现的。利用SAS9.2软件中的GLM过程分析SNP和产仔数性状的关联分析，固定效应模型如下：

y＝μ+gi+mk+e

y为繁殖性状的表型记录；μ为性状的总平均值；gi为基因型效应；mk为生产月份效应；e为随机误差。数据以概率值和平均值±标准差表示，P值＜0.05表示具有显著性差异。

2.4结果分析

通过上述Sequenom MassArray，测得大白猪HSD17B1基因SNP分型结果，如表1所示。

表1

基因型检测结果表明：5头猪的基因型为AA基因型，19头猪的基因型为AG基因型，67头猪的基因型为GG基因型。猪HSD17B1基因在检测猪群中的基因型频率结果：AA基因型频率为0.055，AG基因型频率为0.209，GG基因型频率为0.736，GG和AG的基因型频率高于AA，GG和AG基因型为优势基因。

利用SAS9.2软件对基因型和繁殖性能进行统计分析，并做样本间多重比较。结果如表2所示。

表2

从表2可以看出，HSD17B1不同基因型间初产产仔数和平均胎重差异极显著。AA型的产仔数低于AG和GG型，AG型的初产平均胎重低于AA和GG型，但窝重高于AA和GG型。经产数据中，AG和GG型的产仔数、窝重和平均胎重均高于AA型。

因此，SNP(rs323407415)位点明显对猪的产仔性状有影响，在实际的猪育种中，AG和GG型基因型猪具有更高的繁殖效率。

综上所述，可以通过确定猪HSD17B1基因rs323407415位点的核苷酸来确定猪个体为AA基因型还是AG和GG基因型，从而辅助鉴定初产/经产产仔数和平均胎重：AG和GG型基因型猪具有更高的繁殖效率。

AA基因型为猪HSD17B1基因第323407415位的核苷酸为A的纯合体。

AG基因型为猪HSD17B1基因第323407415位的核苷酸为A与G的杂合体；

GG基因型为猪HSD17B1基因第323407415位的核苷酸为G的纯合体。

实施例2HSD17B1基因表达量检测

1、实验样品采集

用于检测HSD17B1基因表达的大白猪和梅山猪，来源于天津市武清区中国农业科学院北京畜牧兽医研究所猪场。采集怀孕期49天母猪的卵巢，样品均储存在液氮中，提取总RNA。每个品种均采集三头个体作为生物学重复。

2、HSD17B1基因表达量检测

2.1卵巢组织总RNA提取

RNA提取过程中所用玻璃器皿及镊子需经过200℃干烤4h以灭活RNase，Eppendorf管及移液器枪头均需使用RNase灭活产品，整个实验过程中实验人员需佩戴口罩及乳胶手套。

(1)样品采集：将收集的卵巢组织置于1.5mL的Eppendorf离心管中，按照RNA提取说明书进行操作；

(2)用研磨杵冰上研磨组织，加入1mLTrizol裂解液,剧烈震荡30s，室温静置10min，充分裂解组织细胞；

(3)加入0.2mL氯仿(氯仿:Trizol体积比为1:5)，剧烈振荡15s，室温静置10min，在4℃的情况下，12000g离心15min，重复该步骤直至抽提完全；

(4)吸取上层水相(约450μL)到新的Eppendorf管中，加入等体积异丙醇，轻轻混匀然后室冰上静止20min，在4℃的情况下，12000g离心10min；

(5)离心后观察到离心管底有少量白色胶状沉淀，弃上清，然后加入1mL 75％乙醇(用DEPC水配置)洗涤沉淀，在4℃的情况下，12000g离心10min，弃去乙醇，于超净工作台风干5-10min至沉淀呈半透明状；

(6)加入DEPC水溶解RNA沉淀，视沉淀量多少决定加入DEPC水量；

(7)紫外分光光度计测定样品RNA浓度。

2.2总RNA质量检测方法

取所提的样本RNA 1μL，利用Agilent 2100Bioanalyzer和琼脂糖凝胶电泳的方法检测RNA的质量。取RIN值(RNA integrity number，RNA分子完整数)大于8的样品为建库样品。同时采用2％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，选取完整性高的样品进行后续mRNA定量。

2.3mRNA的反转录

用紫外分光光度计测定RNA浓度后，取2μg RNA加入2μL Oligo(dT)，用DEPC水补足体积至13μL，混匀后72℃水浴5min，然后冰上放置3-5min，离心后加入如下物质，混匀后，42℃水浴60min，-20℃保存。

表3反转录反应体系

2.4定量PCR

Real-time quantitative PCR反应按照TaKaRa SYBR Premix EX Taq(TaKaRa,DRR041S)试剂盒说明书进行。每个样品设三个重复，反应在ABI Prism 7500实时荧光定量PCR系统中进行，β-actin为内参。PCR反应体系见表4，反应条件见表5，引物序列见6。

表4RT-qPCR反应体系

表5RT-qPCR扩增程序

表6mRNAqPCR引物

2.5结果分析

梅山猪原产于我国上海嘉定、江苏太仓等地区，是我国猪种中繁殖力最强、产仔数最多的品种之一，比大白猪等现代欧洲猪种同窝产仔数高30％～40％，也是迄今为止世界上繁殖力最强的猪种之一。将梅山猪与大白猪HSD17B1基因表达量进行比较，可有效证明HSD17B1基因表达量对产仔性状的影响。检测结果见图1。

由图1可知，高产仔数的梅山猪中HSD17B1的表达量显著低于大白猪。HSD17B1是HSD17β家族中短链脱氢还原酶的典型代表，在雌激素合成过程中有着非常重要的功能。HSD17B1基因可能通过影响激素的合成及代谢，从而影响猪产仔性能。

实施例3检测相关SNP位点的试剂盒

本发明中SNP位点检测试剂盒包括以下组分：

(1)，dNTP(2.5mM)；

(2)，5×PCR缓冲液；

(3)，FastPfuDNA聚合酶(250U)；

(4)，SNaPshot混合液；

(5)，MgSO₄溶液(50mM)；

(6)，6×DNA Loading Buffer；

(7)，PCR扩增引物(P₁和P₂)：其核苷酸序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；

(8)，延伸引物：其核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；

(9)，核酸外切酶(250U)；

(10)，虾-碱性磷酸酶(100U)；

(11)，纯化用缓冲液：；

(12)，ddNTP；

(13)，SNP位点纯合突变的阳性对照标本：含有猪rs323407415位点人工合成为G碱基的质粒；

(14)，SNP位点杂合突变的阳性对照标本：含有猪rs323407415位点人工合成A和G碱基的两种质粒的混合物；

(15)，SNP位点阴性对照标本：人工合成的带有随机碱基的质粒。

通过本发明的SNP位点检测试剂盒及其使用方法，对猪HSD17B1基因第323407415位SNP位点进行检测。

1、DNA提取

剪取适量的猪耳组织，提取全基因组DNA。

2、PCR扩增反应

PCR反应试剂(20μL)包括：1μL正向引物组(10μM)，1μL反向引物组(10μM)，4μL 5×PCR缓冲液，2μL dNTP(2.5mM)，0.2μL FastPfuDNA聚合酶(250U)，H₂O补充至20μL。待测DNA样品(200ng)、SNP纯合突变阳性对照标本(100ng)、SNP杂合突变阳性对照标本(100ng)、SNP阴性对照标本(100ng)与上述PCR反应试剂构成PCR反应体系。

3、PCR产物鉴定与纯化

PCR扩增结束后，琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物鉴定。PCR扩增产物用虾-碱性磷酸酶和核酸外切酶进行纯化处理，37℃酶切60min，80℃15min灭活虾-碱性磷酸酶和核酸外切酶。纯化体系包括：2μL终浓度虾-碱性磷酸酶(0.6U)，5μL终浓度核酸外切酶(1.2U)，50ngPCR扩增产物，和2μL纯化用缓冲液。

4、延伸反应

对扩增产物进行回收，之后在含有0.1mM ddNTP的体系中使用延伸引物进行PCR扩增。

5、毛细管电泳及SNP位点分析

使用ABI 3730XL测序仪对延伸引物测序。使用GeneMapper系列软件对结果峰图进行SNP位点上脱氧核苷酸的判定。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 猪多组学整合精准育种方法

<130> 2010

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 猪HSD17B1基因SNP位点扩增引物(Sus scrofa)

<400> 1

acgttggatg acgggcttcg cttgcttct 29

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 猪HSD17B1基因SNP位点扩增引物(Sus scrofa)

<400> 2

acgttggatg aaacagcgtt gaagggaagc 30

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 猪HSD17B1基因SNP位点延伸引物(Sus scrofa)

<400> 3

cttgcttctg ctgct 15

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 猪HSD17B1基因mRNA的表达量PCR扩增引物(Sus scrofa)

<400> 4

tccaatggag aagatggcgg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 猪HSD17B1基因mRNA的表达量PCR扩增引物(Sus scrofa)

<400> 5

ggagatgtcc ggttcagagc 20

Claims (5)

1.一种高产仔数/窝重的猪的育种方法，其特征在于，所述方法包括选择HSD17B1基因第323407415位为GG或AG基因型的猪作为亲本杂交的步骤；

所述HSD17B1基因第323407415位位点的基因型为AG和GG的猪相较于基因型为AA的猪有更高的产仔数和窝重，

用以检测HSD17B1基因第323407415位位点的方法中包括一组扩增引物P₁和P₂，所述扩增引物P₁和P₂的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列；

用以检测HSD17B1基因第323407415位位点的方法中还包括延伸引物，所述延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示序列；

所述猪为大白猪和梅山猪。

2.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，使用试剂盒检测HSD17B1基因第323407415位基因型，所述试剂盒包括PCR反应试剂、PCR扩增引物、PCR产物纯化试剂、延伸引物、以及SNP位点对照标本，所述扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示序列；

所述延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示序列。

3.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述育种方法包括如下步骤：

步骤1，选择HSD17B1基因第323407415位为GG或AG基因型的猪作为亲本杂交，获得F1代仔猪；

步骤2，对F1代仔猪进行基因型分析，选育HSD17B1基因第323407415位为GG或AG基因型的仔猪，成年后继续杂交得F2代仔猪；

步骤3，对F2代仔猪进行基因型分析，选育HSD17B1基因第323407415位为GG或AG基因型的仔猪，成年后继续杂交得F3代仔猪；

重复上述步骤2或3，最终得到基因型GG高遗传性的种猪。

4.检测HSD17B1基因第323407415位位点的基因型的试剂在鉴定或辅助鉴定猪产仔性状以及育种方面的用途，所述HSD17B1基因第323407415位位点的基因型为AG和GG的猪相较于基因型为AA的猪有更高的产仔数和窝重，所述猪为大白猪和梅山猪。

5.如权利要求4所述的用途，所述试剂包括扩增引物和延伸引物，所述扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述延伸引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

Images