CN106011245A - 一种与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定方法及应用，包括样品采集、猪基因组DNA的提取与检测、然后再用SNP芯片基因型判定及基因型数据的质控，以样本DNA为模板，加入PCR扩增引物对进行PCR扩增反应，反应产物纯化后与质谱芯片共结晶，用飞行质谱法检测并分型，检测目的基因的SNP位点，单核苷酸多态性的基因型和等位基因频率的计算是使用PopGene3.2实现的；SNP多态性与性状的关联分析使用SAS9.2软件，最后进行数据整理与分析。本发明的鉴定方法通过确定猪个体基因类型，从而辅助鉴定经产窝重和胎重。

Description

一种与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定方法及应用
技术领域
本发明属于种猪生产研究技术领域，涉及猪基因的产仔性状SNP分子标记研究，更具体的说是一种与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定方法及应用。
背景技术
我国养猪业历史悠久，猪种资源丰富，分布广泛，有着巨大的利用潜力和广阔的发展前景。种猪生产是养猪业生产的基础，只有通过科学地饲养管理，种猪才能繁殖出数量多、质量高的仔猪，才能提高养猪业的经济效益。
随着我国经济持续快速的发展，人们的生活水平逐渐提高，对猪肉的需求量也越来越高，因此，人们也越来越关注如何提高猪的繁殖性能。繁殖性能是猪的重要经济性状，包括产仔数、初生重和初生窝重、断乳窝重、初产日龄和产仔间隔等。母猪繁殖力的选育对于提高养猪生产整体效益起到至关重要作用，给养猪业带来巨大经济效益，是影响养猪业生产效率的重要因素之一。
母猪繁殖性状一个很重要的指标是能否生产出较重的初生重。平均初生重大，变异系数小，说明窝整齐度好，对提高仔猪成活率非常有好处，平均初生重大也可以刺激母猪多产奶。
因此，对猪初生重相关基因的鉴定可为解释猪和其他哺乳动物胎儿生长发育的遗传机制提供重要线索，并为猪的繁殖性状遗传改良提供理论依据。猪仔妊娠期，绒毛膜上皮和子宫内膜上皮形成皱褶，皱褶折叠水平影响着胎盘的相对大小，胎盘的相对大小是影响胎儿存活的主要因素之一，胎儿的存活率又与猪初生重具有重要的关系。寻找基因中的多肽位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段。
前人研究表明，CYP19A1基因编码的产物在类固醇生成过程中参与了多种催化反应，特别是在雄激素经过芳香化，转变成雌激素过程中起着重要的作用（Balthazart J etal., 1998）。CYP19A1的mRNA的表达与卵泡发育有关，若CYP19A1的表达量降低或抑制芳香化酶活性都可能直接影响雄烯二酮和睾酮转化成雌酮和雌二醇（Echternkamp s et al.,2012）。因此，CYP19A1基因在动物生长、发育和生殖过程中具有重要的调控作用，特别在卵泡生长发育、成熟至排卵中性激素的合成转换过程中都发挥关键作用，而且CYP19A1基因SNP位点的多态性改变和雌激素水平相关，进而激素水平来调控母猪繁殖效率。初生重作为衡量母猪繁殖性状的一个重要指标，故我们探讨研究CYP19A1基因单核苷酸多态性位点与窝重与胎重的相关性。
目前，研究猪CYP19A1基因功能的报道很少，申请人运用全基因组关联分析的方法对这个基因的多态性与重要的繁殖性状进行了关联分析，并首次在猪基因组中找到的产仔性状SNP分子标记及其单倍型。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一个与猪产仔性状相关的SNP分子标记和这个SNP构成的鉴定及应用。本发明运用全基因组关联分析的方法寻找与猪产仔性状相关的SNP分子标记，以此作为猪产仔性状相关的SNP分子标记及单倍型在标记辅助选择中的应用。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
一种与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定的特异性引物，其特征在于包括如下的引物序列：
本发明进一步公开了采用特异性引物进行与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）样品采集：放于75%的酒精中并-20℃保存，待提DNA；
（2）猪基因组DNA的提取与检测：
1）从猪组织中提取基因组总DNA；
2）待DNA充分溶解后，用紫外分光光度计测定所提浓度，并琼脂糖凝胶电泳检测所提质量；
（3）SNP芯片基因型判定及基因型数据的质控：
1）取2ul原液进行电泳检测
2）引物设计：根据SNP位点序列信息，使用sequenom公司的引物设计软件Assaydesign3.1,设计PCR反应和单碱基扩展引物并合成；
每个SNP的Forward PCR引物、Rewerse PCR引物各取2.5ul，混合成500ul体系；
3）PCR反应：
SAP消化：
延伸反应：
4）上机检测：
将反应产物9ul稀释3倍，使用树脂进行脱盐，将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶，上机进行质谱检测，并收集数据，反应产物纯化后与质谱芯片共结晶，用飞行质谱法检测并分型，检测目的基因的SNP位点，单核苷酸多态性的基因型和等位基因频率的计算是使用PopGene3.2实现的；SNP多态性与性状的关联分析使用SAS9.2软件；
（4）数据整理与分析
1)表型数据分析：利用SAS9.2统计分析软件，对猪初产产仔数测定值进行描述性统计分析，包括计算该性状的平均值、标准差、最大值和最小值。
2)单倍型分析：单核苷酸多态性的基因型和等位基因频率的计算使用PopGene3.2实现。
本发明更进一步公开了与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定方法在确定猪个体基因类型辅助鉴定经产窝重和胎重方面的应用。实验结果显示：SNP（rs341891833）位点明显对经产窝重和胎重有影响，CT基因型经产窝重和胎重显著高于CC基因型，所以在实际的猪育种中，CT基因型猪具有更快的繁殖效率。综上所述，可以通过确定猪CYP19A1基因rs341891833位点的核苷酸来确定猪个体为CT基因型还是CC基因型，从而辅助鉴定经产窝重和胎重：CT基因型经产窝重和胎重显著高于CC基因型。
本发明的鉴定方法通过确定猪个体基因类型，从而辅助鉴定经产窝重和胎重。
本发明更加详细的描述如下：
本发明所述的SNP构成的单倍型的鉴定过程如下：
一、实验样品采集
来自山东某种猪场的375头大白猪，用于CYP19A1基因SNP分型。逐个采集耳组织样，放于75%的酒精中并-20℃保存，待提DNA。
二、猪基因组DNA的提取与检测
（1）剪取适量的猪耳组织，剪碎将其放进1.5ml的Axgen管中。
（2）取50mlBD离心管，将终浓度为0.4mg/ml的蛋白酶K和裂解缓冲
液进行混合均匀，向装有猪耳朵组织的1.5ml的离心管中加入0.5ml裂解液进行裂解。
（3）离心管平行均匀的放置于恒温杂交炉的摇板上。55度放置6个小时以上；
（4）待样品充分裂解后，取出离心管，在每管中加入0.3ml饱和氯化钠溶液，进行颠倒充分混合6-8次，然后放于冰上，冰浴15分钟；
（5）冰浴过后，12000rpm室温离心15分钟，小心缓慢的将上清转移至新的1.5mlAxgen离心管中（小心避免沉淀随上清一起倒出，保持倒的手法要一致，保持每管倒得上清在量上保持相同）；
（6）加入0.7ml的异丙醇（加入异丙醇的量随倒出的上清的量的变化而变化，二者等体积）于各管，颠倒直至溶液中有絮状沉淀出现（若无絮状沉淀，可将溶液-20℃冰箱放置2小时或4℃冰箱放置过夜）；0
（7）12000rpm室温离心15分钟，去掉上清液体；
（8）在各离心管中加入0.5ml 70%乙醇，轻轻颠倒以充分冲洗上述沉淀出来的DNA；
（9）10000rmp离心30s，用200ul微量移液枪将离心管中的乙醇吸掉，将沉淀的DNA留在管中；
（10）自然风干DNA10分钟；
（11）移液枪取0.1ml的TE缓冲液于各管中，将上述DNA沉淀重新溶解，置其于55℃放置2小时，定时摇晃数次，以使DNA充分溶解；
（12）待DNA充分溶解后，用紫外分光光度计测定所提浓度，并琼脂糖凝胶电泳检测所提质量。
（13）将DNA溶液放置4℃过夜，次日取1μl进行PCR。
三、SNP芯片基因型判定及基因型数据的质控
实验目的：通过电泳检测所提供DNA样品是否符合Sequenom的质量标准
实验材料：Loading buffer (TAKARA公司) EB染料 1*TAE buffer 琼脂糖
实验仪器：全自动凝胶成像系统（Bio-rad公司）电泳槽（Bio-rad公司）
实验方法：取2ul原液进行电泳检测
实验结果分析：样品总体质量非常高,符合Sequenom的质量标准。
2）引物设计：根据SNP位点序列信息，使用sequenom公司的引物设计软件Assaydesign3.1,设计PCR反应和单碱基扩展引物并合成；
每个SNP的Forward PCR引物、Rewerse PCR引物各取2.5ul，混合成500ul体系；
PCR反应：
SAP消化：
延伸反应：
上机检测：
A）将反应产物（共9ul）稀释3倍，使用树脂进行脱盐
B）将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶
C）上机进行质谱检测，并收集数据
反应产物纯化后与质谱芯片共结晶，用飞行质谱法检测并分型，检测目的基因的SNP位点，单核苷酸多态性的基因型和等位基因频率的计算是使用PopGene3.2实现的；SNP多态性与性状的关联分析使用SAS9.2软件；
四、数据整理与分析
1)表型数据分析
利用SAS9.2统计分析软件，对猪初产产仔数测定值进行描述性统计分析，包括计算该性状的平均值、标准差、最大值和最小值。
2)单倍型分析
单核苷酸多态性的基因型和等位基因频率的计算是使用PopGene3.2实现的。利用SAS9.2软件中的GLM过程分析SNP和产仔数性状的关联分析，固定效应模型如下：
y为繁殖性状的表型记录；μ为性状的总平均值；gi为基因型效应；mk为生产月份效应；e为随机误差。数据以概率值和平均值±标准差表示，P值＜0.05表示具有显著性差异。
五、结果分析
表1
基因型检测结果表明：97头猪的基因型为CC基因型，278头猪的基因型为CT基因型。猪CYP19A1基因在检测猪群中的等位基因频率及基因频率结果如表1所示：CC基因型频率为0.259，CT基因型频率为0.741， CT的基因型频率高于CC，CT等位基因为优势基因。
从表2可以看出，该多肽位点在375头大白猪中的CC基因型有97个，CT基因型有278个。CYP19A1与经产窝重和胎重差异极显著。CT型大于CC型。
利用SAS9.2软件对基因型和经产窝重和胎重进行统计分析，并做样本间多重比较。结果如表2所示：SNP（rs341891833）位点明显对经产窝重和胎重有影响，CT基因型经产窝重和胎重显著高于CC基因型，所以在实际的猪育种中，CT基因型猪具有更快的繁殖效率。
综上所述，可以通过确定猪CYP19A1基因rs341891833位点的核苷酸来确定猪个体为CT基因型还是CC基因型，从而辅助鉴定经产窝重和胎重：CT基因型经产窝重和胎重显著高于CC基因型。
CT基因型为猪CYP19A1基因第341891833位的核苷酸为C与T的杂合体；
CC基因型为猪CYP19A1基因第341891833位的核苷酸为C的纯合体。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1
一种与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定方法：
（1）样品采集：放于75%的酒精中并-20℃保存，待提DNA；
（2）猪基因组DNA的提取与检测：
1）从猪组织中提取基因组总DNA；
2）待DNA充分溶解后，用紫外分光光度计测定所提浓度，并琼脂糖凝胶电泳检测所提质量；
（3）SNP芯片基因型判定及基因型数据的质控：
1）取2ul原液进行电泳检测
2）引物设计：根据SNP位点序列信息，使用sequenom公司的引物设计软件Assaydesign3.1,设计PCR反应和单碱基扩展引物并合成；
每个SNP的Forward PCR引物、Rewerse PCR引物各取2.5ul，混合成500ul体系；
3）PCR反应：
SAP消化：
延伸反应：
4）上机检测：
将反应产物9ul稀释3倍，使用树脂进行脱盐，将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶，上机进行质谱检测，并收集数据，反应产物纯化后与质谱芯片共结晶，用飞行质谱法检测并分型，检测目的基因的SNP位点，单核苷酸多态性的基因型和等位基因频率的计算是使用PopGene3.2实现的；SNP多态性与性状的关联分析使用SAS9.2软件；
（4）数据整理与分析
1)表型数据分析：利用SAS9.2统计分析软件，对猪初产产仔数测定值进行描述性统计分析。
实施例2
一种与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定方法：
1. 引物设计：
1st-PCRP：正向引物（F）
2nd-PCRP: 反向引物（R）
UEP_SEQ：单碱基延伸引物
UEP_MASS:单碱基延伸引物质量
UEP_DIR：单碱基延伸引物所在DNA链
F：正义链
R：反义链
2. 实验流程：
a.首先将引物稀释好，引物稀释 ：
（1）每个SNP，有三条引物，将这三条引物的编号标记在引物合成管的管盖上。
（2）Forward PCR引物、Rewerse PCR引物先离心空甩后加水，加水量与OD值相关（引物管和引物设计表均有标识），每1OD加36ul水。加水后室温放置30min后震荡混匀备用。
（3）每个Well中多重SNP的Forward PCR引物、Rewerse PCR引物混合时计算方
法：每个SNP的Forward PCR引物、Rewerse PCR引物各取2.5ul，混合成500ul体系。
加水量（ul）=500-重数*2.5*2（重数：well中SNP个数）
（4）uEP引物的加水量计算
按照UEP质量分别稀释每管UEP，再将多重SNP的引物混合到500ul
每个uEP体积（ul）=500/重数
b.PCR扩增
PCR扩增采用多重PCR技术, 在384孔板中进行，每个反应体系总体积为5μl
（1）在一个新的2.0ml EP管中配制PCR master mix溶液；
（2）将配制好的PCR master mix溶液震荡混匀后分置8连排的PCR管中备用，使用8通道加样器，调节加样体积为4μL，在384孔板的每个加样孔中加入PCR master mix液。该384孔板即为PCR反应板。
（3） 取出已经制备好的DNA样品96孔板，使用8通道加样器，调节加样体积为1μL，加至相对应的384PCR反应板，贴上封口膜，震荡混匀后空甩。
（4） 将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件：
c.PCR产物碱性磷酸酶处理
（1） 在PCR反应结束后，384反应板取出并空甩。
（2） 配制碱性磷酸酶处理反应液，SAP Mix；
（3）将配制好的SAP mix溶液震荡混匀后分置8连排的PCR管中备用，使用8通道加样器，调节加样体积为2μL，将SAP Mix加入384孔PCR反应板。贴上封口膜，震荡混匀后空甩。反应体系总体积为7 μl（其中PCR产物5 μl，SAP混合液2 μl）。
（4） 将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件：
启动PCR仪进行单碱基延伸反应。
单碱基延伸
（1） 在碱性磷酸酶处理结束后，将384反应板取出后空甩，在进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9 μl。
（2） 配制单碱基延伸反应液，EXTEND Mix；
（3）将配制好的EXTEND mix溶液震荡混匀后分置8连排的PCR管中备用，使用8通道加样器，调节加样体积为2μL，将EXTEND Mix对应加入384孔反应板。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系包含SAP处理后PCR产物7μl及 EXTEND Mix液2μl，总体系9ul。
（4） 将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件：
启动PCR仪进行单碱基延伸反应。
树脂纯化：将反应产物加16ul水进行稀释，稀释后使用树脂进行脱盐；
f.芯片点样：将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶；
g.质谱检测：上机进行质谱检测，并收集数据。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所；天津市畜牧兽医研究所
<120> 一种与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定方法及应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acgttggatg gaaccatgag gttgcagttg 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acgttggatg accatagctc atgacaacgc 30
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cggatcctta acccactgag 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cggatcctta acccactgag c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cggatcctta acccactgag t 21

Claims (3)

1.一种与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定的特异性引物，其特征在于包括如下的引物序列：
。
2.采用权利要求1所述的特异性引物进行与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定的方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）样品采集：放于75%的酒精中并-20℃保存，待提DNA；
（2）猪基因组DNA的提取与检测：
1）从猪组织中提取基因组总DNA；
2）待DNA充分溶解后，用紫外分光光度计测定所提浓度，并琼脂糖凝胶电泳检测所提质量；
（3）SNP芯片基因型判定及基因型数据的质控：
1）取2ul原液进行电泳检测
2）引物设计：根据SNP位点序列信息，使用sequenom公司的引物设计软件Assaydesign3.1,设计PCR反应和单碱基扩展引物并合成；
每个SNP的Forward PCR引物、Rewerse PCR引物各取2.5ul，混合成500ul体系；
3）PCR反应：
SAP消化：
延伸反应：
4）上机检测：
将反应产物9ul稀释3倍，使用树脂进行脱盐，将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶，上机进行质谱检测，并收集数据，反应产物纯化后与质谱芯片共结晶，用飞行质谱法检测并分型，检测目的基因的SNP位点，单核苷酸多态性的基因型和等位基因频率的计算是使用PopGene3.2实现的；SNP多态性与性状的关联分析使用SAS9.2软件进行数据整理与分析。
3.权利要求2所述的与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定方法在确定猪个体基因类型辅助鉴定经产窝重和胎重方面的应用。
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