CN112646896A - 一种依据arnt基因中结构变异sv323区分大白猪和贵州地方猪品种的检测技术 - Google Patents

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黄世会
徐倩
牛熙
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Abstract

本发明公开了一种依据ARNT基因中结构变异SV323区分大白猪和贵州地方猪品种的分子标记及检测技术，其特征在于：SV323位于猪参考基因组Sscrofa 11.1 chr4:98349210‑98349532，共323bp，存在ARNT基因第一内含子中，SV323缺失基因定为D，正常不缺失的基因定为I。应用本发明所述的检测技术，得出大白猪II基因型频率显著高于其它贵州地方猪品种的II基因型；大白猪以不缺失的I基因为主，而贵州地方猪品种以缺失的D基因为主，应用分子标记SV323可以区分大白猪和贵州地方猪品种。

Description

一种依据ARNT基因中结构变异SV323区分大白猪和贵州地方 猪品种的检测技术
技术领域
本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体来说，涉及一种区分大白猪和贵州地方猪品种的分子标记及其应用技术。
背景技术
我国是养猪和猪肉消费大国，拥有丰富的地方猪品种资源。贵州省位于云贵高原的东部，地理环境复杂，具有典型的喀斯特地貌，素称“天无三日晴，地无三尺平”，交通相对闭塞，多民族聚居，长期以来，地方猪品种自繁自育自养，形成肉质优良、抗病力强、耐粗饲和基因比较纯合等特点，但普遍存在生长速度缓慢、饲养周期长和产仔数不搞等问题。近年来，在国家和政府的大力帮扶下，交通便利，经济开放，随之引进大量国外猪品种，导致地方猪品种大面积杂交，本地纯种数量急剧下降。随着人们生活水平的提高，消费者对猪肉的需求产生了从量到质的转变，给地方猪品种的发展带来很好的机遇。现今，如何运用分子生物学和生物信息学等技术，既能将贵州地方猪品种的优势继续保持又能与国外猪品种的优点形成互补是科研工作者们共同努力的方向。
2003年4月人类基因组计划完成后，生命科学研究迅速发展，为各种疾病的关联分析提供基础数据，促进人类进化史的研究。基因组研究主要包括结构基因组学和功能基因组学，前者以全基因组测序为目标，后者以基因功能鉴定为目标。功能基因组学又称后基因组学，它是对基因、非基因元件、核酸和蛋白质产物的功能进行的全基因组范围研究，系统分析基因的功能。结构变异(Structural Variation，SV)是生物遗传多样的主要因素之一，一般指基因组上大片段DNA变异现象，常见的类型有插入(Insertion)、缺失(Deletion)、倒置(Inversion)、重复(Duplications)、易位(Translocation)和一些复杂的变异类型。基因组学研究表明，部分结构变异的产生可直接影响机体的表型及性能。细胞分裂周期蛋白25A(Cell division cycle 25A,CDC25A)基因中20 bp插入/缺失显著影响山羊的十字部高度、管围等生长相关性状(Cui et al.,2019)。
本发明所述的结构变异主要指ARNT(Ary hydrocarbon-receptor nucleartranslocator)基因的第1内含子中的323 bp序列发生缺失或不缺失的变异类型。ARNT是芳香烃受体核转运蛋白(核转运子)，是碱性螺旋-环-螺旋-PAS转因子超家族的重要成员，是存在于许多动、植物和原核生物内的信号转导分子中，定位于细胞核，并可广泛表达(梁英等，2009)。ARNT可与芳香烃受体(AhR)、缺氧诱导因子(HIF)1α、2α等形成异物二聚体，介导免疫抑制、胚胎发育、肿瘤血管生成与侵袭等一系列生物学反应(梁英等，2009；杨祝等，2013)。利用TRANSFAC软件分析发现SV323缺失区间存在一个TFBS，序列是ttccttttctagtCAATTtgatga，与之结合的转录因子是COMP1；应用UCSC软件对该SV区间进行分析，检测到2个SINE和1个Simple_repeat；根据RegRNA2.0软件预测到变异区间存在2个ESE/7个ESS/1个ISE元件；通过QTLdb数据库的对比，该变异区域与猪的免疫、繁殖、生长等QTL有一定的关系。研究SV323对ARNT基因转录本的表达是否存在影响，发现在香猪卵巢组织中杂合的ID型转录本优先表达DD型，提示SV323的存在不利于ARNT基因的转录。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种依据ARNT基因中结构变异SV323区分大白猪和贵州地方猪品种的分子标记及检测技术。
本发明的技术方案是：ARNT基因中一种区分大白猪和贵州地方猪品种的结构变异SV323，位于猪参考基因组Sscrofa 11.1chr4:98349210-98349532，该结构变异存在三种基因型，分别命名为II、ID和DD型，其中II为正常基因型、DD为纯合的缺失型、ID为杂合缺失型。
本发明提供用于检测猪品种SV323基因型的一组引物，所述的引物分别为：上游引物SV323F：5’-CCACATTGGCAACTGCTCG-3’，下游引物SV323R：5’-CCAGAAAAGTAAGAAGCCTCCCA-3’，目的序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，SEQ ID No.3为缺失区间序列。
本发明还提供猪群中检测所述结构变异SV323基因型的方法。
所述检测方法包括以下步骤：
(1)提取大白猪、香猪、柯乐猪、糯谷猪和江口萝卜猪的基因组DNA；
(2)以上述5个猪品种的基因组DNA为模板，分别利用引物SV323F、SV323R，进行PCR检测；
(3)1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶成像系统记录条带并判断SV323的基因型。
步骤(2)中进行PCR所使用的扩增体系为20μL，即：2×Taq PCRMaster Mix 10μL，10μmol/L的上游引物SV323F 0.3μL，10μmol/L的下游引物SV323R 0.3μL，10 ng/μL基因组DNA 1μL，ddH2O 8.4μL；PCR反应条件：①预变性：94.0℃5 min；②变性：94.0℃30 sec；③退火：66.0℃30 sec；④延伸：72.0℃45 sec；⑤步骤②-④共32个循环；⑥72.0℃10 min；⑦4℃保存。
本发明进一步提供所述结构变异在区分贵州地方猪品种和大白猪中的应用技术。
前述的应用技术包括以下步骤：
(1)采用PCR技术检测结构变异SV323在各猪群体中的基因型分布，统计等位基因频率；
(2)应用SPSS v26.0进行卡方检验，分析大白猪和其它4个贵州地方猪品种在SV323等位基因分布频率是否有显著差异。
(3)根据结构变异SV323的基因型和等位基因频率的不同区分贵州地方猪品种和大白猪。
本发明所述结构变异SV323可作为区分大白猪和贵州地方猪品种的分子标记。
本发明的有益效果：(1)本发明提供的分子标记可不受猪的年龄、性别和饲养等因素的限制，可用于贵州地方猪品种和大白猪的个体选择。
(2)本发明所选的检测地方猪品种的分子标记SV323方法准确可靠，操作简便。
附图说明
图1为本发明实施例1中SV323基因型分型结果，M为D2000；
1、2为II基因型；3、4为ID基因型；5、6为DD基因型；
图2为本发明实施例2中SV323在5个猪品种间的基因型频率和等位基因频率分布情况。
具体实施方式
以下实例对本发明做进一步的解释，但不限定本发明的范围，若无特别指明，实施例中所用的技术方法和条件均为本领域技术人员所熟知的技术方法和常规实验条件，或按照相关试剂厂商说明书建议的方法和条件。
实施例1区分猪品种的分子标记SV323的检测技术，步骤如下：
1、基因组DNA的提取
本发明采用购自天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，用于从血液或组织中提取基因组DNA，具体方法如下：
1)处理材料
提取材料为血液时，可直接使用200μL新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，不足200μL可加缓冲液GA补足。
提取材料为动物组织时(脾组织用量应少于10 mg)打碎处理为细胞悬浮液，然后10000 rpm(11，200×g)离心1 min，倒尽上清，加200μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。
注意：去除RNA，可加入4μL RNaseA溶液，振荡15 sec，室温放置5 min。
2)提取血液基因组时，加入20μL蛋白酶K，混匀，即可继续进行下一步；提取组织基因组时，加入蛋白酶K并混匀后，于56.0℃水浴2-4 h(每小时混匀样品2～3次)直至组织块完全溶解；
3)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70.0℃水浴10 min，可见溶液变清亮；
4)加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15 sec，此时可能会出现絮状沉淀；
5)将步骤4)所得的溶液和沉淀都加入吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；
6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(已加入无水乙醇)，12000 rpm离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；
7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(已加入无水乙醇)，12000 rpm离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；
8)重复操作步骤7)一次；
9)将吸附柱CB3放回收集管中12000 rpm离心2 min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；
10)将吸附柱CB3转入一个干净的1.5 mL离心管中，向吸附柱中部悬空滴加50-200μL洗脱液TE，室温放置2-5 min，12000 rpm离心2 min，将溶液收集到离心管中；
11)为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的TE溶液再重复加入吸附柱CB3中，放置2 min，12000 rpm离心2 min；
12)基因组DNA放于4.0℃备用或-20.0℃保存。
2、目标序列的扩增
本发明ARNT基因中SV323区间位于Sscrofa 11.1chr4:98349210-98349532，参考NCBI Genbank收录的相应序列，使用Premier 5.0软件在结构变异区间外围设计两条特异性引物，上游引物SV323F：5’-CCACATTGGCAACTGCTCG-3’，下游引物SV323R：5’-CCAGAAAAGTAAGAAGCCTCCCA-3’组合进行PCR检测，目的片段长度为1461 bp或1138 bp，测序后得出目标序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，SEQ ID No.3为缺失区间序列。
PCR所使用的扩增体系为20μL，计为：2×Taq PCR Master Mix10μL，10μmol/L的上游引物SV323F/下游引物SV323R取各取0.3μL，ddH2O取8.4μL，10 ng/μL基因组DNA取1μL。
进行PCR采用的反应条件：①预变性：94.0℃5 min；②变性：94.0℃30 sec；③退火：66.0℃30 sec；④延伸：72.0℃45 sec；⑤步骤②-④共32个循环；⑥72.0℃10 min；⑦4℃保存。
3、PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测及基因型判断
PCR结束后，取4μL PCR产物经1.2％含有核酸染料Gelview的琼脂糖电泳检测，凝胶成像系统成像并观察记录条带。
以待测样品基因组为模板，结合引物SV323F和SV323R，进行PCR扩增。若扩增出单条带且大小为1461 bp，将基因型定义为II型，序列为SEQ ID No.1；若扩增两条带，一条带大小为1461 bp而另一条带为1138 bp，则基因型定义为ID型；若扩增出单条带而且大小为1138 bp，将基因型定义为DD型，序列为SEQ ID No.2。
实施例2 SV323基因型与猪品种类型的相关性与检测应用
按照实施例1所述的方法，以采自贵州从江县和清镇的香猪共329头、铜仁市江口县的萝卜猪42头、毕节市的柯乐猪25头和大白猪42头和纳雍县的糯谷猪28头为实验材料，利用PCR技术检测结构变异SV323(chr4:98349210-98349532)在5个猪品种群体中的分布情况，应用SPSS v26.0软件中的卡方检验分析SV323等位基因分布频率的差异情况。结果显示，(表1，图2)大白猪的II基因型频率显著高于其它贵州地方猪品种，香猪以DD型占绝大优势；大白猪I等位基因频率极显著高于糯谷猪、江口萝卜猪、柯乐猪和香猪的相应值(P＜0.01)。
表1 SV323的基因型和等位基因频率
Figure BDA0002856921000000091
备注：P<0.01表示差异极显著。
Figure BDA0002856921000000092
Figure BDA0002856921000000101
Figure BDA0002856921000000111
序列表
SEQIDNo.1：
<110>贵州大学
<120>一种依据ARNT基因中结构变异SV323区分大白猪和贵州地方猪品种的检测技术
<160>5
<210>1
<211>1461
<212>DNA
<213>SV323正常基因型（不缺失）碱基序列
<400>1
CCACATTGGCAACTGCTCGATTTTTTTTTTTTTTTTTGAGTTTTGAAATATAGGTGATTT60
TATATGTTGAGGTTTTTTTGTATTTTCCAAATAAAATAAATCAGAGGAGATGAGTTATAT120
GTATCTGTTGCATGAGTGGAATATGTAAACCAATTTGTGTTTTAGATTAATATTATGTTA180
CTATTACAAGCTTTTAAAAGTGAAGACTGCAGACTATAGTATCTCTTCAAACCTGTATGA240
CGTCGGGGGAACTGAAGTTTAGGACAATCTTTTTTCAGTCTAAGAATTCAAGAAAAGCAA300
TCTGGACATGAGCATTTGGGTTTTCTAGCAAACTATTGAGATCTTATCCCCAGCTTGAGC360
CTTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTCTTTGTTGTTGTTGCTATTTCTTGGGCCG420
CTCCCGCGGTATATGGAGGTTCCCAGGCTAGGGGTCGAATCGGAGCTGTAGCCACCGGCC480
TACGCCAGAGCCACAGCAACTCGGGATCCGAGCCGCGGCTGTGACCTACACCACAGCTCA540
CGGCAACGCTGGGATCGTTAACCCACTGAGCAAGGGCAGGGACCGAACCCGCAACCTCAT600
GGTTCCTAGTCGGATTCGTTAACCACTGCGCCACGACGGGAACTCTGAGCCTTCCTTTTC660
TAGTCAATTTGATGATGATGATAAGCAAGGACAGTCTTTTTATTTATTTATTTATTTATT720
TATTTATGCTATTTCTTGGGCTGCTCCCATGGCATATGGAAGTTCCCAGGCTAGGGGTCG780
AATCGGAGCTGTAGCCACCGGCCTACGCCAGAGCCACAGCAACTCGGGATCTGAGCCGAG840
TCTGCAACCTACACCACAGCTCACGGCAACGCTGGGATCGTTAACCCACTGAGCAAGGGC900
AGGGACCGAACCCGCAACCTCATGGTTCCTAGTCGGATTCGTTAACCACTGTGCCATGAC960
GGGAACTCCAAGGACAGTCTTTTTAAAATCCGTATTTCTGTTTTTCTTTGACAGAAATGA1020
CAGCAGATGTACCATCACTGGGTCCAGCCATTACCTCTGGAAACCCTGGGCCTGGGATTC1080
AAGGTGGAGGAGCCATTGTTCAGAGGGCTATTAAGCGGCGACCAGGGTATGTTTAACCAG1140
GGTGGTGTCATGAATGTCTCTCCTTTGTACCAGACTGATTTTGTTAGTTGCTGGACCCTC1200
TATTCTAACTCTGTCACCTTTTCTGGCTATTTACTACACTGCTGTTAGATAACTTTCTTA1260
AGTCCCTGGATTTTTCTTGTTTGGAATTGATGTTTTTATCTAAGTTTCTTATAAGCATTT1320
TTTTTTTAAACCAAAAATCTCTGCAGTGTAAAGGAATATGGCTAAGCCTAAAGATTTCAC1380
TGCTGCTGAAAATTTGCTGCTTTCATTAAACTTTATATCTGCATTCTCAAAATCTTTTTG1440
GGAGGCTTCTTACTTTTCTGG1461
SEQIDNo.2：
<210>2
<211>1138
<212>DNA
<213>SV323缺失基因型碱基序列
<400>2
CCACATTGGCAACTGCTCGATTTTTTTTTTTTTTTTTGAGTTTTGAAATATAGGTGATTT60
TATATGTTGAGGTTTTTTTGTATTTTCCAAATAAAATAAATCAGAGGAGATGAGTTATAT120
GTATCTGTTGCATGAGTGGAATATGTAAACCAATTTGTGTTTTAGATTAATATTATGTTA180
CTATTACAAGCTTTTAAAAGTGAAGACTGCAGACTATAGTATCTCTTCAAACCTGTATGA240
CGTCGGGGGAACTGAAGTTTAGGACAATCTTTTTTCAGTCTAAGAATTCAAGAAAAGCAA300
TCTGGACATGAGCATTTGGGTTTTCTAGCAAACTATTGAGATCTTATCCCCAGCTTGAGC360
CTTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTCTTTGTTGTTGTTGCTATTTCTTGGGCCG420
CTCCCGCGGTATATGGAGGTTCCCAGGCTAGGGGTCGAATCGGAGCTGTAGCCACCGGCC480
TACGCCAGAGCCACAGCAACTCGGGATCCGAGCCGCGGCTGTGACCTACACCACAGCTCA540
CGGCAACGCTGGGATCGTTAACCCACTGAGCAAGGGCAGGGACCGAACCCGCAACCTCAT600
GGTTCCTAGTCGGATTCGTTAACCACTGTGCCATGACGGGAACTCCAAGGACAGTCTTTT660
TAAAATCCGTATTTCTGTTTTTCTTTGACAGAAATGACAGCAGATGTACCATCACTGGGT720
CCAGCCATTACCTCTGGAAACCCTGGGCCTGGGATTCAAGGTGGAGGAGCCATTGTTCAG780
AGGGCTATTAAGCGGCGACCAGGGTATGTTTAACCAGGGTGGTGTCATGAATGTCTCTCC840
TTTGTACCAGACTGATTTTGTTAGTTGCTGGACCCTCTATTCTAACTCTGTCACCTTTTC900
TGGCTATTTACTACACTGCTGTTAGATAACTTTCTTAAGTCCCTGGATTTTTCTTGTTTG960
GAATTGATGTTTTTATCTAAGTTTCTTATAAGCATTTTTTTTTTAAACCAAAAATCTCTG1020
CAGTGTAAAGGAATATGGCTAAGCCTAAAGATTTCACTGCTGCTGAAAATTTGCTGCTTT1080
CATTAAACTTTATATCTGCATTCTCAAAATCTTTTTGGGAGGCTTCTTACTTTTCTGG1138
SEQIDNo.3：
<210>3
<211>323
<212>DNA
<213>SV323缺失序列
<400>3
CGCCACGACGGGAACTCTGAGCCTTCCTTTTCTAGTCAATTTGATGATGATGATAAGCAA60
GGACAGTCTTTTTATTTATTTATTTATTTATTTATTTATGCTATTTCTTGGGCTGCTCCC120
ATGGCATATGGAAGTTCCCAGGCTAGGGGTCGAATCGGAGCTGTAGCCACCGGCCTACGC180
CAGAGCCACAGCAACTCGGGATCTGAGCCGAGTCTGCAACCTACACCACAGCTCACGGCA240
ACGCTGGGATCGTTAACCCACTGAGCAAGGGCAGGGACCGAACCCGCAACCTCATGGTTC300
CTAGTCGGATTCGTTAACCACTG323
SEQIDNo.4：
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>4
CCACATTGGCAACTGCTCG
SEQIDNo.5：
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成
<400>5
CCAGAAAAGTAAGAAGCCTCCCA

Claims (6)

1.一种区分大白猪和贵州地方猪品种的SV323分子标记，其特征在于：SV323分子标记在ARNT基因的第一内含中，位于猪参考基因组Sscrofa 11.1chr4:98349210-98349532，长度为323bp，该SV区间存在缺失或不缺失两种情况，分别命名为D和I两种等位基因，对应三种基因型，即正常基因型II、纯合缺失基因型DD、杂合型ID。
2.根据权利要求1所述的一种区分大白猪和贵州地方猪品种的SV323分子标记，其特征在于：检测SV323分子标记的上游引物SV323F：5’-CCACATTGGCAACTGCTCG-3’，下游引物SV323R：5’-CCAGAAAAGTAAGAAGCCTCCCA-3’，该组引物经特异性扩增后能得到2种大小不同的目的片段，其中正常型的序列为SEQ ID No.1，缺失型的序列为SEQ ID No.2，SEQ IDNo.3为缺失区间所对应的序列。
3.根据权利要求1所述的一种区分大白猪和贵州地方猪品种的SV323分子标记，其特征在于：所述的贵州地方猪品种为糯谷猪、江口萝卜猪、柯乐猪和香猪。
4.如权利要求1、2和3之一所述的一种区分大白猪和贵州地方猪品种的SV323分子标记的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)提取待测大白猪、香猪、江口萝卜猪、柯乐猪和糯谷猪的组织或血液基因组DNA；(2)以上述所提5个待测猪品种的基因组DNA为模板，分别利用引物SV323F和SV323R进行PCR扩增；(3)用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，于凝胶成像系统中成像并记录条带，根据条带数量和大小判断相应模板的基因型。
5.根据权利要求3所述的一种区分大白猪和贵州地方猪品种的SV323分子标记的检测方法，其特征在于：步骤(2)中进行PCR所使用的扩增体系为20μL，即：2×Taq PCR MasterMix 10μL，10μmol/L的上游引物SV323F 0.3μL，10μmol/L的下游引物SV323R 0.3μL，10ng/μL基因组DNA 1μL，ddH2O 8.4μL；PCR反应条件：①预变性：94.0℃ 5min；②变性：94.0℃30sec；③退火：66.0℃ 30sec；④延伸：72.0℃ 45sec；⑤步骤②-④共32个循环；⑥72.0℃10min；⑦4℃保存。
6.一种利用权利要求1或2所述的SV323分子标记区分大白猪和贵州地方猪品种的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)采用PCR技术检测SV323在各猪群体中的基因型分布情况，并统计每个猪品种中I/D等位基因频率；(2)应用SPSS v26.0中的卡方检验，分析大白猪与贵州地方猪品种该SV323区间的等位基因频率是否有差异；(3)根据各群体中SV323的等位基因频率不同区分大白猪和贵州地方猪品种。
CN202011547922.6A 2020-12-24 2020-12-24 一种依据arnt基因中结构变异sv323区分大白猪和贵州地方猪品种的检测技术 Pending CN112646896A (zh)

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