CN111826449A - 获得雌核发育鳙畸形性状相关分子标记的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种获得雌核发育鳙畸形性状相关分子标记的方法及其应用。所述的分子标记由雌核发育鳙的2b‑rad简化基因组中得到，位于rgs7a基因的3’UTR中，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，在该序列的531位碱基处存在一个等位基因突变(G/A)。利用本发明筛选的分子标记对雌核发育鳙畸形性状进行了关联分析。本发明筛选的分子标记可在雌核发育鳙畸形性状辅助选择和鳙体型育种中应用。
Description
技术领域
本发明涉及属于水产动物遗传及分子标记辅助选择育种技术领域，具体涉及一种获得雌核发育鳙畸形性状相关分子标记的方法及其应用。
背景技术
随着集约化水产养殖事业的蓬勃发展，鱼类的畸形问题受到了越来越多的关注。鱼类在生长过程中，骨骼畸形会导致鱼类抢食能力下降，摄食能力降低，从而影响生长，甚至死亡。而长成的畸形鱼，由于外观不佳，无法销售和进行有效的食品加工，所以畸形鱼的出现会极大影响养殖效益。骨骼畸形类型包括脊柱侧凸、脊柱前弯、鳃盖弯曲、尾椎畸形和颌畸形等(郑珂等.海水养殖鱼类仔、稚鱼骨骼发育与畸形发生.中国水产科学.2016,23(1):250-261)。相关研究表明，养殖鱼类苗种培育过程中骨骼畸形种类和畸形率受卵质以及养殖环境、营养、病害等多种因子的影响(Boglione et al.Skeletal anomalies inreared European fish larvae and juveniles.Part 2:main typologies,occurrencesand causative factors.Reviews in Aquaculture,2013,5(s1):S121-S167.)。此外，亲本基因突变、杂交育种、近交繁殖等也会影响子代的骨骼发育(Leclair et al.Craniofacialskeletal defects of adult zebrafish Glypican 4(knypek)mutants.DevelopmentalDynamics,2009,238(10):2550；Hayes et al.ptk7 mutant zebrafish models ofcongenital and idiopathic scoliosis implicate dysregulated Wnt signalling indisease.Nature Communications,2014,5(6):4777-4777.)；染色体倍性也会一定程度上影响骨骼发育(Babaheydari et al.Proteomic analysis of skeletal deformity indiploid and triploid rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)larvae.ComparativeBiochemistry&Physiology Part D Genomics&Proteomics,2016,19:1-7.)。尽管养殖过程中出现鱼类骨骼畸形问题已经是影响水产养殖业经济的众多问题之一，但是仔鱼阶段的畸形鱼不易用肉眼分辨出来，而幼鱼阶段的畸形问题表现最为明显。这不仅影响育苗生产管理，也会影响后期鱼的正常生长，如何快速识别畸形鱼是限制水产养殖业健康持续发展的瓶颈之一。
鳙鱼(Hypophthalmichthys nobilis)属硬骨鱼纲鲤形目鲤科鲢亚科，俗称胖头鱼、花鲢，是我国重要的大宗淡水鱼之一，也是中国淡水渔业的重要养殖对象。2017年，鳙产量为309.80万吨，在淡水养殖产量中，仅次于草鱼和鲢。随着我国居民生活水平的提高，对鱼肉等优质蛋白质的需求越来越大，这将进一步刺激国内鳙养殖业的发展。在仔鱼阶段快速区分畸形性状和正常性状的鳙，将极大促进鳙养殖业的发展，亟需开发鳙畸形性状的分子标记。
简化基因组是最近几年发展起来的将内切酶和高通量测序结合的一种技术。它可以通过不同的内切酶，在基因组在产物特异的切口片断，将这些片断富集之后作为模板，进行高通量测序文库的构建，然后借助高通量测序，获得大量的酶切片断的序列。这种方法既可以获得基因组中大量特定片断，又降低了测序成本，已经成为一种通用而高效的分型方法(Davey,J.W.et al.Genome-wide genetic marker discovery and genotyping usingnext-generation sequencing.Nat Rev Genet.2011.12,7499-510)。相比传统的分子标记(SSR、AFLP或RAPD等)，SNP作为第三代分子标记的代表，具有多态性好、广泛分布于全基因组的特点。SNP多态性已广泛应用于经济动物育种过程中，如在构建高密度遗传连锁图谱、目标性状与分子标记的关联分析、标记辅助选择育种、群体遗传结构及系统发育分析等方面都表现出良好的应用前景。
目前尚未见有关雌核发育鳙畸形性状相关SNP分子标记及其应用的报道。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的缺陷，筛选得到一种获得雌核发育鳙畸形性状相关分子标记的方法及其应用技术方案，从雌核发育鳙畸形个体和正常个体的简化基因组测序数据中筛选得到了rgs7a基因上的SNP分子标记与雌核发育鳙畸形性状相关，为雌核发育鳙畸形性状的选育提供有用的遗传标记。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明通过对雌核发育鳙群体中已知体型性状的6尾畸形个体和6尾正常个体提取基因组DNA，按照2b-RAD方法进行测序文库构建，测序文库检验合格之后上机进行测序，对测序数据分析后，得到一个与鳙畸形性状显著相关的短序列(FDR_BH＝0.001601)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，在该序列的第31位存在一个SNP位点：碱基为G或A。
SEQ ID NO:1(下划线所示的碱基“R”，即为SNP位点，碱基为G或A)：
TCTCTGATTTCGAAGAGGCTGCCTGCTGTCRT
本发明将SEQ ID NO:1短序列在本实验室鳙基因组序列中进行比对，获得一条1001bp的核苷酸序列，此序列为rgs7a基因上的一段序列(位于此基因3’UTR区域)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，在该序列的531位碱基处存在一个等位基因突变(G/A)。
第一方面，本发明筛选到一种获得雌核发育鳙畸形性状相关分子标记，其核苷酸序列如下SEQ ID NO:2所示：
TTTTAAAATATATTCAAATAGCAAACAGTTGTTTTAAATAGTAATACTATTTCACACTCATTTTTATTGTATTTTTTTATCAAATAAATGCAGCCTTGGTATGCATGAGACTTCTTTCAAAAACATTAGAAAAAGTTACTGATCCCAAACTTTTGAATGGTAGAGTATATTTAAATATGGAACAGAACAAAATGTAATATTTAATTTAATATATTTCCTATTCAATTTTTGAGAGCTACAGTAGAAAACAACTTTTAGTATAAAAGTAATAACAAATTACCTCACACTAGAAAGTTTGGAACAGTATGATGACGAGTAAATGATGGCAATTTTCTTTTCTTTTTTTGGGTGAACTATCCCTATAATATGATTTTACTGAAAGGAGTCATTTTATCTTAAGCATGCCTAAAGATTGTTTTGTCGGCTGTTGTCAATGCCCAATACCGTATAAAATCATTTGTCTTTCTTTTTGTTCTTTTTGTCTTGTGTTTCAGGGAAAATCTCTGATTTCGAAGAGGCTGCCT GCTGTCR(A/G)TCCAATCTTGCTGAGCCTCAAACAATCCACCGATGATGAGGACGCTGTCATCTTCATCTCTGTCGTCTGATTGGTCCAGATCCTAGATACCCTGGACAATTGACCAAATCACATGCATGTCCAAGAGACTGAATTTTTACATCAGTTTCTACTTGCTACTTGCTACTTTCAGTCTTTAAGACAGGTAGACATGGACTTCAAATATTTGGGAAGTGCAGCAATGTCTTTCAAAAGAGGAAAATGATCTTCTCCTCTCCTCTTTTGTCTGTCAGGACTGTCTCCAACTGTAGACTGATCAAATGATGTCAAAACCAGAAAATTTAAAGTCATAAAAAACACAGTTAAATATAACAGCGTAGGCACATTGTGTAAAATCGAAGAAGCTTTAGACACAGAGATGATCTCTTCCTACTCACCTTTCATCTCTTTTTGCATTGATTTTATTGCACTATAAAGGATTTAGCACACGT
所述SNP位点经简化基因组数据分析得到，AA基因型个体的体型正常率显著高于AG基因型和GG基因型个体的体型正常率，而GG基因型个体的体型畸形率显著高于AG基因型和AA基因型个体的体型畸形率。
第二方面，本发明设计了检测一种获得雌核发育鳙畸形性状相关分子标记以及检测rgs7a基因分型的引物对，其DNA序列如下所示：
正向引物F：TGTTGTCAATGCCCAATACC，如SEQ ID NO:3所示；
反向引物R：CACAATGTGCCTACGCTGTT，如SEQ ID NO:4所示。
本发明所述的SNP位点分型测序采用常用的Sanger法测序。
本发明的发明人经过实验验证发现，雌核发育鳙畸形个体在rgs7a基因的SNP位点的基因型是GG型的比率为100％，雌核发育鳙正常个体在rgs7a基因的SNP位点的基因型是AA型的比率为87.10％。
鉴于上述实验研究成果，上述SNP分子标记，可用于检测或辅助检测雌核发育鳙畸形体型和正常体型的筛选，在养殖育种过程中，鱼苗的早期阶段可筛选AA型的个体为培育对象，这对于雌核发育鳙优良体型性状的选育具有重要的指导意义。
第三方面，本发明提供了一种检测雌核发育鳙畸形性状的方法(检测上述SNP分子标记的方法)：提取待测雌核发育鳙鱼苗的基因组DNA(利用少量尾鳍即可提取)，PCR扩增(利用上述特异性引物)，检测SEQ ID NO:2序列第531位碱基处的SNP位点的基因型是AA、GG还是AG(利用Sanger测序法)。
进一步地，所述PCR扩增的反应体系为：DNA模板1μl(50ng/μl)，上下游引物5μM F和R混合物0.4μl，2.5mM dNTP 0.4μl，10X Buffer 1.25μl，5U/μl Taq酶0.075μl，补充水至12.5μl。
进一步地，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min后进入循环体系95℃变性35s，53℃退火35s，72℃延伸40s，30个循环，最后72℃延伸8min。将产物于1％的琼脂糖凝胶中电泳，成像保存。
第四方面，本发明提供一种如前述的获得雌核发育鳙畸形性状相关分子标记在检测或辅助检测雌核发育鳙的畸形性状中的应用，或/和在雌核发育鳙的辅助选择育种中的应用。
序列表SEQ ID NO:1是本发明从简化基因组中筛选的与鳙畸形性状显著相关的短序列，在该序列的第31位存在一个SNP位点：碱基为G或A。
序列表SEQ ID NO:2是本发明在鳙基因组中与序列表SEQ ID NO:1比对获得的与鳙畸形性状显著相关的长序列，在该序列的第531位碱基处存在一个等位基因突变(G/A)。
序列表SEQ ID NO:3是扩增雌核发育鳙rgs7a基因的SEQ ID NO:2序列的第531位碱基处的上游引物序列。
序列表SEQ ID NO:4是扩增雌核发育鳙rgs7a基因的SEQ ID NO:2序列的第531位碱基处的下游引物序列。
本发明的优点及有益效果如下：
本发明的与雌核发育鳙畸形性状相关的SNP分子标记，可用于快速鉴定或辅助鉴定体型性状，不受雌核发育鳙鱼的年龄、性别等限制，可用于雌核发育鳙的早期选育，鉴定结果准确可靠，操作简单，成本低，可显著促进雌核发育鳙的育种进程，解决鳙体型选育的盲目性。仅仅使用少量尾鳍即可进行优良体型性状的检测，为分子辅助育种提供科学工具。
附图说明
图1为本发明中部分畸形个体和正常个体在琼脂糖上的PCR扩增产物电泳检测图，M代表DL2000 marker，1-5为畸形个体，6-10为正常个体。
图2为本发明中AA基因型雌核发育鳙rgs7a基因的SEQ ID NO:2序列的第531位点部分峰图。
图3为本发明中GG基因型雌核发育鳙rgs7a基因的SEQ ID NO:2序列的第531位点部分峰图。
图4为本发明中AG基因型雌核发育鳙rgs7a基因的SEQ ID NO:2序列的第531位点部分峰图。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的仪器、试剂和材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂和材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特殊说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
下述实施例中的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司武汉分公司合成。本发明实验所用雌核发育鳙材料均来自武汉涨渡湖渔场。
实施例1
本发明的SNP标记来源于本实验室雌核发育鳙2b-rad方法构建的简化基因组数据，经过分析获得的与鳙畸形性状显著相关的位点。
(1)实验所用雌核发育鳙采自武汉新洲区涨渡湖渔场，所用的鳙为一月龄，选择6尾体型正常鳙和6尾体型畸形鳙，取其尾鳍提取基因组DNA，并采用2b-rad方法进行建库，主要分为酶切、连接、扩增和回收。
酶切：
对本实验室养殖的且已知畸形和正常体型的6尾畸形和6尾正常鳙进行2b-RAD建库，具体过程如下(以下为每个个体使用量)：
混匀之后37.0℃下酶切反应4小时,然后65℃保温20分钟使酶灭活。
连接：
测序接头连接。将上面的酶切产物与标准的IlluMina测序接头(slx-ad1和slx-ad2)分别进行连接反应，反应体系(27.0μl)：
混匀离心后置于16℃下连接反应过夜(8h)。
扩增：
PCR反应体系包含两对PCR引物(slx-1st-primer1&slx-1st-primer2,slx-2nd-primer&slx-barcode primer),其中In-RAD-barcode primer为带有特异性barcode的引物，使每个个体构建文库的barcode不同，用来后续数据分析区分个体。PCR反应体系如下：
每个样品按如上体系平行扩增2管。混匀离心后置于PCR仪中，反应条件为：98℃预变性30s，扩增16个循环，每个循环98℃变性20s，63℃退火50s，72℃延伸40s，最后在72℃下终延伸5min，4℃保存。
回收：
合并扩增产物通过8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测切胶回收片段大小约170bp的文库产物。使用OMEGA Poly-Gel DNA Extraction Kit(D2561-02)对回收产物进行纯化，具体操作流程参照试剂盒说明书，最终用30μl超纯水洗脱。使用荧光定量PCR对每个样品进行定量，然后根据测序量需求进行混样测序，测序平台为IlluMina HiSeq 2500 SE50(IllμMina,USA)。建库过程所使用的接头及引物序列详见表1。
表1 2b-RAD测序文库构建接头及引物序列
分析：
对12尾雌核发育鳙进行2b-RAD测序，一共得到15.26M reads的原始数据和过滤后的14.34M高质量reads，平均每个个体获得了1.19M高质量reads。对测序下机产生的FASTQ格式序列进行过滤之后，使用Stacks v1.31软件进行位点重建和畸形性状相关位点的鉴定。最后获得一个与雌核发育鳙畸形性状显著相关的短序列，其核酸序列为SEQ ID NO:1。
TCTCTGATTTCGAAGAGGCTGCCTGCTGTCRT
(2)将实施例1中鉴定到的与雌核发育鳙畸形性状相关短序列在全基因组中进行BLAST比对搜索，获得一条长1001bp的长序列，其核酸序列为SEQ ID NO:2。
TTTTAAAATATATTCAAATAGCAAACAGTTGTTTTAAATAGTAATACTATTTCACACTCATTTTTATTGTATTTTTTTATCAAATAAATGCAGCCTTGGTATGCATGAGACTTCTTTCAAAAACATTAGAAAAAGTTACTGATCCCAAACTTTTGAATGGTAGAGTATATTTAAATATGGAACAGAACAAAATGTAATATTTAATTTAATATATTTCCTATTCAATTTTTGAGAGCTACAGTAGAAAACAACTTTTAGTATAAAAGTAATAACAAATTACCTCACACTAGAAAGTTTGGAACAGTATGATGACGAGTAAATGATGGCAATTTTCTTTTCTTTTTTTGGGTGAACTATCCCTATAATATGATTTTACTGAAAGGAGTCATTTTATCTTAAGCATGCCTAAAGATTGTTTTGTCGGCTGTTGTCAATGCCCAATACCGTATAAAATCATTTGTCTTTCTTTTTGTTCTTTTTGTCTTGTGTTTCAGGGAAAATCTCTGATTTCGAAGAGGCTGCCT GCTGTCR(A/G)TCCAATCTTGCTGAGCCTCAAACAATCCACCGATGATGAGGACGCTGTCATCTTCATCTCTGTCGTCTGATTGGTCCAGATCCTAGATACCCTGGACAATTGACCAAATCACATGCATGTCCAAGAGACTGAATTTTTACATCAGTTTCTACTTGCTACTTGCTACTTTCAGTCTTTAAGACAGGTAGACATGGACTTCAAATATTTGGGAAGTGCAGCAATGTCTTTCAAAAGAGGAAAATGATCTTCTCCTCTCCTCTTTTGTCTGTCAGGACTGTCTCCAACTGTAGACTGATCAAATGATGTCAAAACCAGAAAATTTAAAGTCATAAAAAACACAGTTAAATATAACAGCGTAGGCACATTGTGTAAAATCGAAGAAGCTTTAGACACAGAGATGATCTCTTCCTACTCACCTTTCATCTCTTTTTGCATTGATTTTATTGCACTATAAAGGATTTAGCACACGT
实施例2
基于与雌核发育鳙畸形性状相关的长序列的引物设计及验证
(1)依据SEQ ID NO:2设计一对引物，其序列为：
正向引物F：TGTTGTCAATGCCCAATACC，如SEQ ID NO:3所示；
反向引物R：CACAATGTGCCTACGCTGTT，如SEQ ID NO:4所示；
(2)从本实验室养殖的同一批次的6月龄雌核发育鳙群体中选择65尾，包括34尾畸形个体和31尾正常个体，对其基因组DNA样品进行PCR验证，PCR反应程序如下：
PCR加样信息
PCR程序设置
(3)对扩增产物在琼脂糖上做电泳检测，结果如图1所示，可扩增出475bp条带，对扩增产物进行Sanger法测序，用DNAstar软件对测序结果进行分析，通过序列比对和峰图分析，查看SNP位点基因型。
(4)将利用上述方法检测到的雌核发育鳙基因型，与前期记录得到的畸形和正常体型鳙进行spass相关性分析，发现基因型与雌核发育鳙体型显著相关(Pearson相关性为0.948，p<0.01)，正常体型中AA基因型个体比率为87.1％，畸形体型中GG基因型个体比率为100％。因此，在雌核发育鳙的选择育种中，可以优先选择rgs7a基因中SEQ ID NO:2序列的第531位碱基的基因型是AA的个体作为培育对象，能够有效辅助早期实现短时间、低成本、高准确地选育体型正常的雌核发育鳙。
序列表
<110> 中国科学院水生生物研究所
<120> 获得雌核发育鳙畸形性状相关分子标记的方法及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 鳙(Hypophthalmichthys nobilis)
<400> 1
tctctgattt cgaagaggct gcctgctgtc rt 32
<210> 2
<211> 1001
<212> DNA
<213> 鳙(Hypophthalmichthys nobilis)
<400> 2
ttttaaaata tattcaaata gcaaacagtt gttttaaata gtaatactat ttcacactca 60
tttttattgt atttttttat caaataaatg cagccttggt atgcatgaga cttctttcaa 120
aaacattaga aaaagttact gatcccaaac ttttgaatgg tagagtatat ttaaatatgg 180
aacagaacaa aatgtaatat ttaatttaat atatttccta ttcaattttt gagagctaca 240
gtagaaaaca acttttagta taaaagtaat aacaaattac ctcacactag aaagtttgga 300
acagtatgat gacgagtaaa tgatggcaat tttcttttct ttttttgggt gaactatccc 360
tataatatga ttttactgaa aggagtcatt ttatcttaag catgcctaaa gattgttttg 420
tcggctgttg tcaatgccca ataccgtata aaatcatttg tctttctttt tgttcttttt 480
gtcttgtgtt tcagggaaaa tctctgattt cgaagaggct gcctgctgtc rtccaatctt 540
gctgagcctc aaacaatcca ccgatgatga ggacgctgtc atcttcatct ctgtcgtctg 600
attggtccag atcctagata ccctggacaa ttgaccaaat cacatgcatg tccaagagac 660
tgaattttta catcagtttc tacttgctac ttgctacttt cagtctttaa gacaggtaga 720
catggacttc aaatatttgg gaagtgcagc aatgtctttc aaaagaggaa aatgatcttc 780
tcctctcctc ttttgtctgt caggactgtc tccaactgta gactgatcaa atgatgtcaa 840
aaccagaaaa tttaaagtca taaaaaacac agttaaatat aacagcgtag gcacattgtg 900
taaaatcgaa gaagctttag acacagagat gatctcttcc tactcacctt tcatctcttt 960
ttgcattgat tttattgcac tataaaggat ttagcacacg t 1001
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 正向引物F(Hypophthalmichthys nobilis)
<400> 3
tgttgtcaat gcccaatacc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 反向引物R(Hypophthalmichthys nobilis)
<400> 4
cacaatgtgc ctacgctgtt 20
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> slx-接头1(Hypophthalmichthys nobilis)
<400> 5
cagacgtgtg ctcttccgat ctnnagatcg gaagagc 37
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> slx-接头2(Hypophthalmichthys nobilis)
<400> 6
ctacacgacg ctcttccgat ctnnagatcg gaagagc 37
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> slx-1轮-引物1(Hypophthalmichthys nobilis)
<400> 7
aatgatacgg cgaccaccga 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> slx-1轮-引物2(Hypophthalmichthys nobilis)
<400> 8
caagcagaag acggcatacg a 21
<210> 9
<211> 56
<212> DNA
<213> slx-2轮-引物(Hypophthalmichthys nobilis)
<400> 9
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgat 56
<210> 10
<211> 62
<212> DNA
<213> slx-标签引物(Hypophthalmichthys nobilis)
<400> 10
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
at 62
Claims (8)
1.一种获得雌核发育鳙畸形性状相关分子标记，其特征在于：所述的分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，在该序列的第531位存在一个SNP位点，碱基为G或A。
2.一种检测如权利要求1所述获得雌核发育鳙畸形性状相关分子标记的引物对，其特征在于：该引物对的序列如下所示：
正向引物F：TGTTGTCAATGCCCAATACC，如SEQ ID NO:3所示；
反向引物R：CACAATGTGCCTACGCTGTT，如SEQ ID NO:4所示。
3.一种检测雌核发育鳙畸形性状的方法，其特征在于：提取待测雌核发育鳙的基因组DNA，利用如权利要求2中所述的特异性引物进行PCR扩增，检测SNP位点的基因型是GG、AA还是AG；所述畸形性状为体型畸形和体型正常。
4.根据权利要求3所述的检测雌核发育鳙畸形性状的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为：DNA模板1μl、50ng/μl，上下游引物5μM F和R混合物0.4μl，2.5mM dNTP 0.4μl，10X Buffer 1.25μl，5U/μl Taq酶0.075μl，补充水至12.5μl。
5.根据权利要求3或4所述的检测雌核发育鳙畸形性状的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min后进入循环体系95℃变性35s，53℃退火35s，72℃延伸40s，30个循环，最后72℃延伸8min。
6.根据权利要求3或4所述的检测雌核发育鳙畸形性状的方法，其特征在于：将产物于1％的琼脂糖凝胶中电泳，成像保存，对产物采用Sanger法测序，使用DNAstar软件对测序结果进行分析，通过序列比对和峰图分析，查看SNP位点基因型。
7.根据权利要求5所述的检测雌核发育鳙畸形性状的方法，其特征在于：将产物于1％的琼脂糖凝胶中电泳，成像保存，对产物采用Sanger法测序，使用DNAstar软件对测序结果进行分析，通过序列比对和峰图分析，查看SNP位点基因型。
8.一种如权利要求1所述的获得雌核发育鳙畸形性状相关分子标记在检测或辅助检测雌核发育鳙的畸形性状中的应用，或/和在雌核发育鳙的辅助选择育种中的应用。
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Application publication date: 20201027 Assignee: Honghu Yingmeng Ecological Agriculture Co.,Ltd. Assignor: Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences Contract record no.: X2023980053452 Denomination of invention: Method and application of obtaining molecular markers related to the abnormal traits of gynogenetic bighead carp Granted publication date: 20210903 License type: Common License Record date: 20231222 |