CN112626230A

CN112626230A - 一种利用dgkk基因中sv119分子标记区分大白猪和香猪的检测技术

Info

Publication number: CN112626230A
Application number: CN202011547777.1A
Authority: CN
Inventors: 冉雪琴; 黄世会; 李大鹏; 牛熙; 王嘉福
Original assignee: Guizhou University
Current assignee: Guizhou University
Priority date: 2020-12-24
Filing date: 2020-12-24
Publication date: 2021-04-09

Abstract

本发明公开了一种利用DGKK基因中SV119分子标记区分香猪和大白猪的技术，其特征在于：SV119位于猪参考基因组Sscrofa 11.1chrX:44048706‑44048824，共119bp，存在DGKK基因的第2内含子中，SV119缺失基因定为D，正常不缺失的基因定为I。应用本发明所述的检测技术，得出大白猪只有I基因，而香猪有约50％的D基因，应用分子标记SV119可以区分大白猪和香猪。

Description

一种利用DGKK基因中SV119分子标记区分大白猪和香猪的检测技术

技术领域

本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体来说，涉及一种区分香猪和大白猪的分子标记及其应用技术。

背景技术

香猪是我国特有的地方猪品种，贵州省从江县是其主产区，因肥猪开膛后腹腔内不臭以及双月断奶的仔猪宰食无乳腥味，而被称为“香猪”(刘培琼，2011)。香猪于1980年被列为中国八大地方猪种之一，国家农业部于1993年将其列为国家二级保护畜种，其主产区从江县于1995年被认定为“中国香猪之乡”，此外，香猪于1999年荣获“中国国际农业博览会名特优产品”称号，于2000年被农业部列入《国家畜禽品种资源保护名录》，其主产区在2004年获国家质监总局颁发“原产地标记注册证”，并在2009年获“中国地理名称保护产品”称号。香猪以“肉质香嫩、体型矮小、纯净无污染、基因纯合”等特点而著称，其优良的肉质备受消费者喜爱，但因该猪种生长发育缓慢、早熟易肥、体型矮小等因素限制了其产业化发展。

遗传和变异是生物界普遍的存在现象，若无变异，生物界则无前进发展的条件，而遗传则只是简单的重复；若无遗传，变异则无法积累，就失去其价值，生物也无法进化了。动植物基因组中存在多种多样的变异，主要包括基因组插入、缺失、易位、重复和单核苷酸多态性等，因为这些变异的存在，致使同一物种不同个体呈现出差异性状。伴随测序技术的发展与进步，越来越多结构变异受到人们的关注。海马体丰富转录本1(hippocampusabundant transcript 1,HIAT1)基因的内含1中纯合插入15bp“ACTAGTGGACTTCTT”序列(即II型)后，山羊的体长、胸围和胸部宽度/深度等指标测量值显著高于ID和DD型，提示该位点可作为潜在影响羊生长性状的分子标记(Gao et al.,2020)。

本发明所述的结构变异主要指DGKK基因第2内含子中的119bp序列发生缺失或不缺失的变异类型。甘油二脂激酶K(diacylglycerol kinase kappa,DGKK)基因编码的蛋白质可催化甘油二酯磷酸化并将其转化为磷脂酸，是一种膜蛋白质，可被过氧化氢抑制。对基因进行GO和KEGG分析发现DGKK基因富集到G蛋白偶联受体信号通路中，参与信号转导。Zanden等(2011)对DGKK基因进行关联分析，提示DGKK基因的两个SNP基因型与男性外生殖器常见的尿道下裂先天性畸形有关。通过UCSC网站对结构变异区域中所含的启动子功能单元进行预测，DGKK基因的SV119区域中检测到LTR重复元件，推测此重复元件可能与猪种繁殖器官的发育有联系。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种利用DGKK基因中SV119分子标记区分大白猪和香猪的检测技术。

本发明的技术方案是：一种区分香猪和大白猪的结构变异SV119，位于猪参考基因组Sscrofa 11.1中chrX:44048706-44048824，该区域存在缺失或不缺失两种类型，有三种基因型，分别命名为II、ID和DD型，其中II为正常基因型、DD为纯合的缺失型、ID为杂合缺失型。

本发明提供了用于检测猪品种SV119基因型的一组引物，所述的引物分别为：上游引物DGKK-F1：5’-CATTTATGCACTGAACAGAGGAGTAAC-3’，下游引物DGKK-R1：5’-CATTTCTTAGTCATTTAATTTGTTGGCA-3’，目的序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，SEQ IDNo.3为缺失区间序列。

本发明还提供猪群中检测所述结构变异SV119基因型的方法。

所述检测方法包括以下步骤：

(1)提取大白猪、香猪的基因组DNA；

(2)以上述2个猪品种的基因组DNA为模板，分别利用引物DGKK-F1、DGKK-R1，进行PCR检测；

(3)3.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶成像系统记录条带并判断SV119的基因型。

步骤(2)中进行PCR所使用的扩增体系为20μL

2×Taq PCR Master Mix	10.00μL
		DGKK-F1(10μmol/L)	0.30μL
DGKK-R1(10μmol/L)	0.30μL
		gDNA	1.00μL
ddH<sub>2</sub>O	8.40μL
		Total Volume	20.00μL

进行PCR采用的反应条件：

本发明进一步提供所述结构变异在区分香猪和大白猪中的应用技术。

前述的应用技术包括以下步骤：

(1)采用PCR技术检测结构变异SV119的基因型分布；

(2)应用SPSS v26.0进行卡方检验，分析大白猪和香猪在SV119等位基因分布频率是否有明显差异。

(3)根据结构变异SV119的基因型和等位基因频率的不同区分香猪和大白猪。

本发明所述结构变异SV119可作为区分大白猪和香猪的分子标记。

本发明的有益效果：(1)本发明提供的分子标记可不受猪的年龄、性别和饲养等因素的限制，可用于香猪和大白猪的个体选择。

(2)本发明所选的检测地方猪种的分子标记SV119方法准确可靠，操作简便，检测结果中，出现ID和DD两种基因型的样本为香猪。

附图说明

图1为本发明实施例1中SV119基因型分型结果；1、2泳道为II基因型；3、4泳道为ID基因型；5、6泳道为DD基因型；

图2为本发明实施例2中SV119在2个猪种间基因型和基因频率分布。

具体实施方式

以下实例对本发明做进一步的解释，但不限定本发明的范围，若无特别指明，实施例中所用的技术方法和条件均为本领域技术人员所熟知的技术方法和常规实验条件，或按照相关试剂厂商说明书建议的方法和条件。

实施例1 区分猪品种的分子标记SV119的检测技术，步骤如下：

1、基因组DNA的提取

本发明采用购自天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，用于从血液或组织中提取基因组DNA，具体方法如下：

1)处理材料

提取材料为血液时，可直接使用200μL新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，不足200μL可加缓冲液GA补足。

提取材料为动物组织时(脾组织用量应少于10mg)打碎处理为细胞悬浮液，然后10000rpm(11200×g)离心1min，倒尽上清，加200μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。

注意：去除RNA，可加入4μL RNaseA溶液，振荡15sec，室温放置5min。

2)提取血液基因组时，加入20μL蛋白酶K，混匀，即可继续进行下一步；提取组织基因组时，加入蛋白酶K并混匀后，于56.0℃水浴2-4h(每小时混匀样品2～3次)直至组织块完全溶解；

3)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70.0℃水浴10min，可见溶液变清亮；

4)加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀；

5)将步骤4)所得的溶液和沉淀都加入吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

8)重复操作步骤7)一次；

9)将吸附柱CB3放回收集管中12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；

10)将吸附柱CB3转入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附柱中部悬空滴加50-200μL洗脱液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；

11)为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的TE溶液再重复加入吸附柱CB3中，放置2min，12000rpm离心2min；

12)基因组DNA放于4.0℃备用或-20.0℃保存。

2、目标序列的扩增

本发明中SV119区间位于chrX:44048706-44048824，参考NCBI Genbank收录的相应序列，使用Premier 5.0软件在其两端外围设计两条特异性引物，上游引物为DGKK-F1：5’-CATTTATGCACTGAACAGAGGAGTAAC-3’，下游引物为DGKK-R1：5’-CATTTCTTAGTCATTTAATTTGTTGGCA-3’，二者组合进行PCR扩增，能获得906bp或787bp两种目的片段，测序后得到SEQ ID No.1和SEQ ID No.2序列，SEQ ID No.3为缺失区间序列。

PCR所使用的扩增体系为20μL：

进行PCR采用的反应条件：

3、PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测及基因型判断

PCR结束后，取4μL PCR产物经3.0％含有核酸染料Gelview的琼脂糖电泳检测，凝胶成像系统记录条带。

每个待测样品基因组以DGKK-F1、DGKK-R1为引物，进行PCR扩增。若扩增出单条带且大小为906bp，将基因型定义为II型；若扩增两条带，一条带大小为906bp而另一条带为787bp，则基因型定义为ID型；若扩增出单条带而且大小为787bp，将基因型定义为DD型(如图1所示)。

实施例2 SV119基因型与猪种类型的相关性与检测应用

按照实施例1所述的方法，以采自贵州从江县和清镇的香猪共154头和毕节市的大白猪34头为实验材料，以chrX:44048706-44048824为候选SV119缺失区间，利用PCR技术检测该SV119基因型在2个群体中的分布情况，应用SPSS v26.0软件中的卡方检验分析SV119等位基因分布频率的差异。结果显示，(表1，图2)该SV119在大白猪中值存在正常基因型II，而在香猪群体中II、ID和DD 3种基因型都有存在，频率在20.13％-43.51％之间；大白猪与香猪的D等位基因频率呈差异极显著(P<0.01)关系。

表1 2个猪品种DGKK-SV119位点基因分型

备注：P<0.01表示差异极显著。

序列表

<110>贵州大学

<120>一种利用DGKK基因中SV119分子标记区分大白猪和香猪的检测技术

<160>5

<210>1

<211>906

<212>DNA

<213>SV119正常基因型（不缺失）碱基序列

<400>1

CATTTATGCACTGAACAGAGGAGTAACTAAATATATAAAGTAAATATTAACAAAAATAAT60

TGAATAGGCAGAAATAAAATATTTGTAGGGAACTTTATATCCCTCTTAAATTAATGAATA120

GGTCATCCAGACCCCCCCCAAATCAATGAGGAAACACTGGCCTTAAAAACACATTAGAAA180

AGATTACTTTAATAGGTATATATAGAACATTCTATCAAAATTCAGTAGAATATATATTCT240

TTCCACGGGCATATGGAACATTCTCCAGATACATCACACGTTAGGCCACAAAAGAAGTCT300

CATTAAATATAAGAAGACTGAAATCATATTAAGTGTTTTTTTATGACAACAACACTATGA360

AACTAGAAATTAACTACAAGAAGAAAACTGGGGAAGAAATATTAACACGTGGAGACTAAA420

CAACATGCTGTGAAACAACCAATGAGTGAATGAAGAAACTGAAATATACCTTGAGACAAA480

TGAAAATGGAAACACAACTGTTCAAATTCTATGGGACACAGCAAAAGCGGACTTAAGAGG540

AAAATTCATACCAATACAGGCCTACCTCAAGGAACAAAAATCTCAATTAAAGAATCCAAA600

TGTACATTTAAAGGAACTATAAAAAGAAGAAGAATCAAAGCCCAAAGTTAGTAGAAGGAT660

AAAGTAATAGATCACACAGGAAATAAATGAAATAAAGACTAAAAATTACAAAATTTCAAT720

GAAAGTAAGAGTTGGTTCTTTGAAAGGATGAACAAAATCAATAATAGTTTAGCCGATTTC780

ATTAAGAAAAATAAATAGAATCAGAAATGAAAGAGCAAAATTTACAACTGATACAATAGA840

AATACAAAGGATCATAAGAAAATACTATAAAAATTATATGCCAACAAATTAAATGACTAA900

GAAATG906

<210>2

<211>787

<212>DNA

<213>SV119缺失基因型碱基序列

<400>2

CATTTATGCACTGAACAGAGGAGTAACTAAATATATAAAGTAAATATTAACAAAAATAAT60

TGAATAGGCAGAAATAAAATATTTGTAGGGAACTTTATATCCCTCTTAAATTAATGAATA120

GGTCATCCAGACCCCCCCCAAATCAATGAGGAAACACTGGCCTTAAAAACACATTAGAAA180

AGATTACTTTAATAGGTATATATAGAACATTCTATCAAAATTCAGTAGAATATATATTCT240

TTCCACGGGCATATGGAACATTCTCCAGATACATCACACGTTAGGCCACATGGAGACTAA300

ACAACATGCTGTGAAACAACCAATGAGTGAATGAAGAAACTGAAATATACCTTGAGACAA360

ATGAAAATGGAAACACAACTGTTCAAATTCTATGGGACACAGCAAAAGCGGACTTAAGAG420

GAAAATTCATACCAATACAGGCCTACCTCAAGGAACAAAAATCTCAATTAAAGAATCCAA480

ATGTACATTTAAAGGAACTATAAAAAGAAGAAGAATCAAAGCCCAAAGTTAGTAGAAGGA540

TAAAGTAATAGATCACACAGGAAATAAATGAAATAAAGACTAAAAATTACAAAATTTCAA600

TGAAAGTAAGAGTTGGTTCTTTGAAAGGATGAACAAAATCAATAATAGTTTAGCCGATTT660

CATTAAGAAAAATAAATAGAATCAGAAATGAAAGAGCAAAATTTACAACTGATACAATAG720

AAATACAAAGGATCATAAGAAAATACTATAAAAATTATATGCCAACAAATTAAATGACTA780

AGAAATG787

<210>3

<211>119

<212>DNA

<213>SV119缺失序列

<400>3

AAAGAAGTCTCATTAAATATAAGAAGACTGAAATCATATTAAGTGTTTTTTTATGACAAC60

AACACTATGAAACTAGAAATTAACTACAAGAAGAAAACTGGGGAAGAAATATTAACACG119

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

CATTTATGCACTGAACAGAGGAGTAAC

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

CATTTCTTAGTCATTTAATTTGTTGGCA

Claims

1.一种区分大白猪和香猪的SV119分子标记，其特征在于：分子标记SV119位于猪参考基因组Sscrofa 11.1chrX:4404870644048824，共119bp，包含在DGKK基因的第2内含子上，该区域存在缺失或不缺失两种类型，SV区间有I和D两种等位基因，II、ID和DD型三种基因型，其中II为正常基因型、DD为纯合缺失基因型、ID为杂合型。

2.根据权利要求1所述的一种区分大白猪和香猪的SV119分子标记，其特征在于：所述的SV119分子标记的一组引物，上游引物DGKK-F1：5’-CATTTATGCACTGAACAGAGGAGTAAC-3’，下游引物DGKK-R1：5’-CATTTCTTAGTCATTTAATTTGTTGGCA-3’，能特异性扩增出两种大小不一的目的条带，对应序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，缺失区间序列为SEQ ID No.3。

3.如权利要求1或2之一所述的一种区分大白猪和香猪的SV119分子标记的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)提取待测大白猪和香猪基因组DNA；(2)以2个待测猪种的基因组DNA为模板，分别利用上游引物DGKK-F1、下游引物DGKK-R1进行PCR扩增；(3)用3.0％含核酸染料的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶成像系统观察记录条带并判断待测样品SV119的基因型。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述的步骤(2)中进行PCR所使用的扩增体系为20μL，具体如下：

进行PCR采用的反应条件：

5.一种利用权利要求1或2所述的SV119分子标记区分大白猪和香猪的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)采用普通PCR技术检测SV119在大白猪和香猪群体中的基因型分布情况；(2)应用SPSS v26.0中的卡方检验进行双侧检验，分析大白猪与香猪该SV119区间等位基因分布频率的差异；(3)根据群体中SV119的等位基因频率不同来区分大白猪和香猪。