CN101418298A - 一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的MuRF2基因片段克隆及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种作为猪分子标记的与猪胴体性状相关的MuRF2基因片段的克隆及应用。所述的分子标记由猪MuRF2基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，在序列表SEQ ID NO：1的第112位碱基处有一个A112－G112的碱基突变，导致HinfI－RFLP多态性。本发明还公开了获得上述分子标记的制备方法和多态性检测的应用，为猪的标记辅助选择的关联分析提供了一个新的分子标记。

Description

一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的MuRF2基因片段克隆及应用

技术领域

本发明属于动物分子标记制备技术领域，具体涉及一种与猪胴体性状相关的分子标记的克隆及制备方法与应用。

背景技术

自古以来，猪在我国一直是六畜之首。养猪业的起伏，更是牵动着人民的生活水平的提高。猪肉在全世界的消费量占红色肉类消费总量的43％，并且猪是人类身体的重要模式系统同时也是未来器官移植的重要来源(Rothschild，2003)。因此对猪的研究不管是从国民经济角度出发还是从人类健康角度出发，都有着重要的实际意义。

我国是世界上养猪最早的国家之一，养猪的历史达几千年之久，经过祖先辛勤的饲养和选育，形成了许许多多的各具特色的地方品种。长期以来，猪的育种以提高生长速度、减少饲料消耗、增加瘦肉率为主要目标，并已取得显著成绩。但伴随着片面追求生产效益和利益的是大量优良品种面临着灭绝的危险，有的品种甚至已经灭绝。在猪的瘦肉率和生长速度大幅度提高的同时，传统的育种手段也遭遇到发展的瓶颈，已经很难象过去那样大幅度地提高猪的生产水平和抗病能力了。猪生产水平的提高实际上降低了猪的体质和适应性，并影响到猪的肌肉品质。随着我国社会经济的发展，人民生活水平与消费水平的提高，带来了人们膳食结构与饮食观念的变化，消费者对猪肉品质的要求也越来越高。这些出现的一系列的新矛盾和新问题，迫切需要用新的手段和对策解决猪的育种问题。

分子生物学的飞速发展使得猪的育种工作出现了新的曙光。利用遗传学或分子生物学手段对传统育种工作的不足之处进行了强有力的补充，也使得猪的育种能够突破传统育种工作面临的瓶颈问题，大大地促进了猪育种工作的发展。目前，标记辅助选择(MAS)、影响猪重要数量性状的基因组区域定位(QTL)、用基因组扫描(genome scanning)法和候选基因法(Candidate gene approach)研究影响猪重要经济性状的主效基因(Economic traits loci，ETLs)已经成功地应用到国内外的猪育种实践当中，取得了巨大的经济效益和社会效益。随着分子遗传学技术在动物育种中的应用，世界各国猪的育种技术已迈入分子育种阶段。

目前通过候选基因法与标记辅助选择(MAS)，已经找到了一些影响猪的生产性状的基因。Casas-Carrillo等(1995)在以6头公猪与18头无相关的母猪杂交群体中，发现在一个公猪家系中位于猪5号染色体上的类胰岛素样生长因子1(Insulin like growth factor1，IGF-1)基因型与断奶后日增重存在连锁(LOD＝2.3)；Nezer等(1999)以大约克与皮特兰杂交的677头后代作为试验对象，研究了影响体脂与肌肉性状的QTL，同样发现了位于2号染色体短臂的QTL，同时筛选到2个候选基因：MYODI和IGF-II；位于猪9号染色体上的肌细胞生成素(Myogenin)是MyoD基因家族的成员，Te Pas等(1999)在两个大白猪群中检测了该基因的多态性，分析发现不同基因型的个体在出生重、生长速度和瘦肉量等性状上有显著差异。对两个选择系肌肉的MyoD基因家族成员mRNA表达水平比较发现F-系(选择生长速度)中myogenin、myf-5、MyoD1的mRNA表达水平比L-系(选择瘦肉率)高，在F-系中，背膘厚与成肌细胞的表达成负相关(Te PasM F等，Influences of myogenin genotypes on birth weight，growth rate，carcass weight，backfatthickness，and lean weight of pigs.J Anim Sci，1999，77：2352-2356)；Fujii等(1991)发现氟烷基因(Hal)是导致猪产生灰白水样肉(Pale，soft，exudative pork，PSE肉)的主效基因，该基因的编码产物为钙释放通道蛋白(calcium release channel，CRC)或兰尼定受体1(ryanodine receptor 1，RYR1)。如果猪只携带两个隐性突变基因(nn)就发生猪应激综合征(Porcine stress syndrome，PSS)，严重影响到猪的存活率和猪肉品质，导致猪的应激死亡和产生劣质肉(PSE肉)，但隐性基因却对胴体性状具有正效应(Hamilton，etal.，2000)。进一步的研究也证明，RYR1位点的突变虽然对肉质性状具有负效应，但对几乎所有的胴体组成性状均具有正效应，有商业价值的RYR1位点基因型的简化DNA检测法已成为专利并得到广泛应用(彭中镇等，1999)；RN(Rendement Napole)基因又称酸肉基因，Le Roy等(1990)首先在汉普夏猪及其杂种中发现不利等位基因RN^-可使肌肉中肌糖原含量升高，终端pH值降低，造成酸肉和烹调损失，猪肉工艺学品质下降，影响火腿的产量。Milan等(2000)通过对候选区域进行大规模的测序分析，发现单磷酸腺苷活化酶γ3亚基基因(AMP-activated protein kinase(AMPK)，γ-subunit 3，PRKAG3)编码第200位氨基酸的密码子的错义突变与汉普夏猪的酸肉表型直接相关，RN^-猪的该位点均为不利的等位基因Q(即谷氨酰胺)。Ciobanu等(2001)在1800个商品猪群中对该基因进行分型，结果发现了新的等位基因与肌糖原含量相关并进一步影响肉质性状。与Milan等发现的位点不同的是，这个位点的不同等位基因不仅仅在汉普夏猪中分离，它在典型的商品猪群中多态性也比较丰富，对育种具有更广泛的适用价值；猪FOS原癌基因(proto-oncogene)被认为是骨骼肌肌纤维特性的候选基因，位于猪7号染色体上影响肌纤维的QTL区域内(Reiner，et al.，2002)。Reiner等(2002)报道了FOS染色体区域与骨骼肌纤维特性的关系，发现代表欧洲猪种的BB基因型个体比AA基因型梅山猪的白肌纤维多10.9％。

MuRF2是MuRF(Muscle-specific RING finger，MuRFs)蛋白家族的成员之一，该家族包括有三个成员，分别是MuRF1、MuRF2及MuRF3，它们只特异性的在心肌和骨骼肌中表达。该家族三个蛋白在结构上具有较高的保守性，它们都包含有一个N末端的高保守的环指结构，以及紧随其后的锌结合B-box结构域和富亮氨酸的卷曲螺旋结构(Spencer JA等.Regulation of microtubule dynamics and myogenic differentiation by MURF，a striated muscle RING-finger protein.J Cell Biol，2000，150：771-784；Centner T等.Identification of musclespecific ring finger proteins as potential regulators of the titin kinase domain.J Mol Biol，2001，306：717-726.)。由于这种结构上的共性，MuRF家族蛋白又被认为是RBCC(RING-B-box-coiled-coiled)蛋白家族的成员。目前研究表明，RBCC蛋白家族的成员在信号转导、基因转录、细胞分化生长以及组织形成过程中发挥重要作用(Freemont PS.RING for destruction？.Curr Biol，2000，10：R84-R87)。MuRF2通过与肌纤维，微管以及细胞核因子的结合来发挥其作为细胞骨架接头及信号转导因子的作用(Pizon V等.Transient association oftitin and myosin with microtubules in nascent myofibrils directed by the MURF2 RING-finger protein.J Cell Sci，2002，115：4469-4482)，在原代培养的鸡胚胎骨骼肌细胞中利用反义RNA技术抑制MuRF2的表达，可明显观察到成肌细胞融合和肌原纤维生长延迟，使得肌纤维的伸缩性受到影响(McElhinny AS等，Muscle-specificRING finger-2(MURF-2)is important for microtubule，intermediate filament and sarcomeric M-line maintenancein striated muscle development.J Cell Sci，2004 117：3175-3188)。

鉴于MuRF2基因对成肌细胞的作用，我们认为它很可能在猪的肌纤维发育过程中起到重要作用，进而影响猪的重要经济性状—生产性状。研究突变位点在群体中的多态性，并进行性状关联分析是研究基因功能的一个非常有力的手段。所以申请人对这个基因进行了多态研究和关联分析，以期能够发现它对生产性状的影响。

发明内容

本发明的目的在于克隆一种作为分子标记应用的与猪胴体性状相关的MuRF2基因片段，寻找突变位点，筛选一种与猪胴体性状相关的分子标记，利用该分子标记进行猪胴体性状的标记辅助选择及应用。

本发明通过以下技术实现：

一种作为分子标记应用的与猪胴体性状相关的MuRF2基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。在序列表SEQ ID NO：1所述的的第112bp处有1个A112-G112的碱基突变，导致HinfI-RFLP多态性。申请人设计了一种检测基因片段突变的引物对，所述引物对的正向引物为：5′CCCAAGGCTATCACACTTTACAC3′；反向引物为：5′GGTTGACTGTGAAGTCATTCAGATT3′。

一种制备所述的与猪胴体性状相关的MuRF2基因片段的方法，按照以下步骤：

(1)以鼠MuRF2基因的mRNA为信息探针，做同源序列筛选，获得猪四号染色体上部分核苷酸序列，用该核苷酸序列与鼠cDNA序列比对，预测猪MuRF2cDNA序列，以该预测的cDNA序列作模板设计引物，以成年中国地方猪品种通城猪的肌肉组织总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，PCR产物纯化和克隆测序，通过序列拼接获得猪MuRF2基因cDNA序列；

(2)提取猪基因组DNA，设计引物，PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得猪MuRF2基因片段核苷酸序列，以该基因片段的核苷酸序列为模板设计突变引物，获得如序列表SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列。

在本发明的实施例中申请人已将制备的与猪生产性状相关分子标记应用在猪分子标记辅助育种的关联分析中的应用。

更详细的技术方案请参见《具体实施方式》中的实施例。

本发明的效果是：发现了一个与猪胴体性状相关的分子标记，为猪的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的与猪胴体性状相关的MuRF2基因片段的核苷酸序列；

图1：是本发明技术流程图；

图2：是本发明中猪MuRF2基因cDNA序列(它包括全部CDS和部分5’-UTR、3’-UTR)，图中起始密码子

和终止密码子用标有下划线的加粗斜体显述；

图3：是本发明中猪MuRF2基因用于寻找SNP位点的部分DNA序列，图中有加粗下划线的为突变位点；

图4：是本发明中猪MuRF2基因用于性状关联分析的核苷酸序列，图中有加粗下划线的为突变位点；

图5：是本发明中猪MuRF2基因用于性状关联分析DNA序列扩增电泳结果，图中泳道M：DNA Marker1；

图6：是本发明中猪MuRF2基因测序发现的A-G突变；

图7：是本发明中猪MuRF2基因CDS区的HinfI-RFLP的三种基因型(AAAG GG)电泳结果，图中泳道M：DNAMarker1。

具体实施方式

实施例1：

(一)猪MuRF2基因的CDS克隆及部分DNA序列扩增

(1)引物设计：

用鼠MuRF2基因的mRNA序列(GenBank登录号：NM_001081281)为信息探针，利用NCBI的BLAST工具在Genomic Biology猪基因组数据库中做同源序列筛选，获得猪四号染色体上部分同源DNA序列，然后用此DNA序列与鼠CDS序列比对，预测出MuRF2完整的cDNA序列，以此预测序列作模板利用Primer Premier 5.0软件设计两对引物分段扩增MuRF2基因cDNA，对两序列进行拼接获得MuRF2 cDNA序列(包括全部CDS和部分5’-UTR、3’-UTR)；利用BLAST获得的MuRF2 DNA序列设计引物扩增猪MuRF2部分核苷酸序列，发现一个碱基突变位点(A779-G779)。

扩增MuRF2基因cDNA序列的引物对如下所示：

MuRF2CDS1正向引物：5’AGCCCAGCCTGAAACAATG3’，

反向引物：5’CTTTCTGATGAGAGCACGG3’；

MuRF2CDS2正向引物：5’TGAACTGCTAAGTCCCCACG3’

反向引物：5’GAGGTCCCTATCATCATCGG3’

扩增MuRF2基因部分核苷酸序列的引物对如下所示：

MuRF2 SNP正向引物：5’CCTAACCCACCTAACAGGAATG3’，

反向引物：5’CTACCCAGTGCTAAATGCCC3’。

(2)反转录PCR扩增反应：

利用TRIzoL试剂盒(购自美国GIBCO公司)从成年“通城猪”(一种具有中国地方猪血缘的地方猪种)肌肉组织中提取总RNA，具体操作方法参照TRIzoL试剂盒说明书进行。

cDNA第一链的的合成：反应总体积为50μl，首先将总RNA 2μg与oligo d(T)₁₁ 4μl，随机引物1μl，DEPC水9μl混合于一离心管中，70℃变性5min以解除RNA的二级结构，立即置于冰上冷却以避免二级结构的重新生成，经短暂离心后加入M-MLV 1.5μl，5×buffer 10μl，dNTP 2.5μl，RNASE抑制剂1μl和DEPC水20μl，于42℃温育1h后将温度升至95℃灭活反转录酶，置于-20℃保存备用。

PCR反应：反应总体积为10μl，其中猪cDNA模板0.5μl，双蒸水6.9μl，buffer 1μl，Mg²⁺ 0.6μl，10mM正向引物和反向引物各0.3μl，dNTP 0.2μl，Taq酶0.2μl(1U/μl)。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，循环35次94℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸25s，最后72℃延伸5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)PCR产物的纯化、克隆和测序

PCR产物的纯化：使用小量DNA回收试剂盒(购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司)。在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL Ependorff管中，按每100μg 1％凝胶加入700μL溶胶液的比例，加入溶胶液，于65℃温育至凝胶完全融化。将胶液上柱，体积过大可分几次上柱，9000rmp离心30s。倒掉收集管中液体，在吸附柱中加入500μL漂洗液，1200rmp离心30s，倒掉收集管中液体，重复此操作一次。将柱子1200rmp离心2min，除去乙醇。将吸附柱放入新的1.5mL Ependorff管中，往柱子中央加入30μL双蒸水，室温放置2分钟，1200rmp离心2min，得到回收产物。

连接反应：将纯化PCR产物与pMD18-T载体(购自宝生物工程(大连)有限公司)连接，连接反应总体积是5μl，其中包括Solution I 2.5μl，pMD18-T 0.5μl，纯化PCR产物2μl，4℃过夜。

感受态细胞的制备：从37℃培养了16-20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2ml LB中，于37℃振荡培养3h，转接1ml菌液于含有30ml LB的盐水瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待OD₆₀₀达到0.3-0.4时将盐水瓶从摇床取出，冰浴冷却10-15min，然后将菌液转入离心管中于4℃ 4000rpm离心10min，弃去培养液，用10ml冰预冷的0.1mol/l的CaCl₂重悬沉淀，冰浴30min，重复4℃ 4000rpm离心10min，用4ml冰预冷的0.1mol/l的CaCl₂重悬沉淀，置4℃保存备用。

转化：无菌状态下取100-120μl感受态细胞于1.5ml离心管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动离心管，取出后冰浴3-4min，加入400μl无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)和X-gal的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。

克隆测序是挑取单个阳性克隆子用于测序，序列测定由北京奥科生物技术有限责任公司完成，每个基因片段至少测两个克隆子。

(4)DNA序列同源性检索鉴定：

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。

(二)PCR-RFLP诊断方法建立

(1)引物序列

由于该A/G碱基突变未能引起限制性内切酶切割位点的改变，因此设计突变引物引入内切酶HinfI酶切位点(

)，PCR扩增包含此突变位点的DNA序列(137bp)，如序列表SEQ ID NO：1所示，突变位点位于其112bp处。

MuRF2pol正向引物：5′CCCAAGGCTATCACACTTTACAC3′

反向引物：5′GGTTGACTGTGAAGTCATTCAGATT3′

该引物扩增片段长度为137bp。

(2)PCR扩增条件

PCR反应总体积10μl，其中猪基因组DNA模板1μl，双蒸水7.1μl，10×buffer 1μl，10mM正向引物和反向引物各0.3μl，dNTP 0.2μl，Taq酶0.1μl(5U/μl)。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s、54℃退火30s、72℃延伸15s，循环35次，72℃延伸5min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)RFLP检测

PCR产物酶切反应体积是10μl，其中PCR产物5μl，双蒸水3.8μl，1×buffer Tango1μl，限制性内切酶HinfI为0.2μl(10U/μl)，将样品混匀后离心，37℃培养箱放置4h，用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。

用引物扩增猪基因组DNA得到了137bp特异性扩增片段，该片段的第112位是1个A-G碱基转换，通过设计突变引物使得该突变位点能导致HinfI酶切位点(

)的变化，其中第112bp-113bp处为HinfI酶的多态性酶切位点。酶切产生三种基因型，AA基因型只有137bp一条带，GG基因型有112bp和25bp两条带，杂合子AG基因型有137bp，112bp和25bp的三条带。其中25bp片段太小在琼脂糖凝胶电泳中难以分辨，但不影响判型，如图7所述。

实施例2：

利用PCR-HinfI-RFLP(参见：J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)检测了本申请人所在动物遗传育种实验室通城试验猪群，包括5个猪品种：其中通城猪为中国地方猪血缘品种，长白猪、大白猪为外来猪血缘，长大通、大长通为中国地方猪与外来猪杂交的品种。该突变位点在不同血缘猪种中的基因型和基因频率如表1所示，结果显示MuRF2基因各基因型在各猪种中均有分布，在通城猪、长白猪和长大通猪中G等位基因占优势，在大白猪和大长通猪中A等位基因占优势。

表1  不同血缘猪品种中MuRF2基因HinfI多态性的基因型和基因频率

五个血缘猪品种间基因型频率的卡方检验结果如表2所示。x²检验表明，通城猪与长白猪、大白猪及大长通猪之间存在极显著差异，与长大通猪之间存在显著差异；其他猪种间基因型频率差异不显著。

表2  不同血缘猪品种中MuRF2基因HinfI多态性基因频率的x²检验结果

注：肩注^*表述P<0.05；肩注^**表述P<0.01；df＝8，x² _0.05(8)＝15.50731，x² _0.01(8)＝20.09024

实施例3

用MuRF2基因检测了通城试验猪群159头猪，对MuRF2基因的该位点HinfI-RFLP多态检测的三种基因型与通城试验猪群部分生产性能进行了初步相关分析。所分析的性状有部分生长性状，部分胴体性状和部分肉质性状。对基因型资料用如下模型进行性状关联分析：

Y_ijklm＝μ+G_i+B_j+S_k+P_l+ε_ijklm

Y_ijklm表示观测值，μ表示均值，G_i表示基因型效应，B_j表示组合效应，S_k表示性别效应，P_l表示父系效应，ε_ijklm表示残差，假定服从N(0，Iσ²)分布，分析软件为SPSS13.0软件。

基因型检测结果表明在159个个体中AA基因型有26个，AG基因型有65个个体，GG基因型有68个。分析结果表明，该位点的基因型与胴体直长存在显著相关，AA型和GG型之间无显著差异，AG型胴体直长显著低于纯合基因型AA和GG型；

表3  猪MuRF2基因HinfI酶切基因型与部分生产性状的关联分析检测

注：^**表示P<0.01，^*表示P<0.05。

表4  猪MuRF2基因HinfI酶切基因型与胴体性状的关联分析

注：^*表示差异显著(p<0.05)。

<110>华中农业大学

<120>一种作为分子标记的与猪胴体性状相关的MuRF2基因片段克隆及应用

<130>

<141>2008-10-29

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>137

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(137)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(113)..(137)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(23)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(112)..(112)

<223>

<400>1

cccaaggcta tcacacttta cacagtgaca aaaagtggca actggtcttt gttgcagaat  60

ttctgaagca tcgaaggcat ttcagatgga gaaaatagaa catggttatg agaatatgaa  120

tcacttcaca gtcaacc                                                 137

Claims (5)

1、一种作为分子标记应用的与猪胴体性状相关的MuRF2基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。

2、根据权利要求1所述的基因片段，其特征在于：在序列表SEQ ID NO：1所述的的第112bp处有1个A112-G112的碱基突变，导致HinfI-RFLP多态性。

3、检测权利要求2所述的基因片段突变的引物对，所述引物对的正向引物为：5′CCCAAGGCTATCACACTTTACAC3′；反向引物为：5′GGTTGACTGTGAAGTCATTCAGATT3′。

4、制备如权利要求1或2所述的基因片段的方法，按照以下步骤：

(1)以鼠MuRF2基因的mRNA为信息探针，做同源序列筛选，获得猪四号染色体上部分核苷酸序列，用该核苷酸序列与鼠cDNA序列比对，预测猪MuRF2cDNA序列，以该测的cDNA序列作模板设计引物，以成年中国地方猪品种通城猪的肌肉组织中总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，PCR产物纯化和克隆测序，通过序列拼接获得猪MuRF2基因cDNA序列；

(2)提取猪基因组DNA，设计引物，PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得猪MuRF2基因片段核苷酸序列，以该基因片段的核苷酸序列为模板设计突变引物，获得如序列表SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列。

5、权利要求2所述的基因片段在猪标记辅助育种中的应用。

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