CN101157922A - 一种猪肌内脂肪含量基因Lpin1的克隆及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种猪肌内脂肪含量基因Lpin1的克隆及其作为分子标记的应用。本发明的特征是克隆得到如序列表SEQID NO：1和SEQID NO：3所示的猪肌内脂肪含量基因Lpin1部分cDNA序列和DNA序列，经过管理分析的应用发现序列表SEQID NO：3中C61－T61与肌内脂肪含量存在显著相关。本发明公开了猪Lpin1基因序列、影响肌内脂肪含量的基因变异位点以及获得该基因的制备方法及其应用。本发明为猪的标记辅助育种提供了新的分子标记。

Description

一种猪肌内脂肪含量基因Lpin1的克隆及其应用

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种猪肌内脂肪含量基因Lpin1的克隆以及作为猪肌内脂肪含量的分子标记的应用。

背景技术

随着人民生活水平的日益提高，猪肉品质越来越受到人们的重视。国外一些高度培育的瘦肉型品种和品系，虽然饲料转化率高，生长快和瘦肉产量多，但肉质不好，PSE肉出现的机率高，往往使养猪业蒙受巨大经济损失。肉质改良已成为目前猪育种工作的重点。肌内脂肪(Intramascular Fat，IMF)含量是评价肉质的一个非常重要的指标，IMF存在于肌肉内，主要位于肌外膜、肌束膜和肌内膜上。据研究，IMF含量与肉品质的嫩度、多汁性以及风味密切相关，是影响肉品质风味的重要因素(Gondret等，2002；Wood等，1988)。据研究IMF含量具有较高的遗传力(h＝0.50)(Hovenier，1993)，而IMF含量与瘦肉率的相关性较小(-0.25～0.30)，这说明在不牺牲瘦肉率的前提下进行IMF含量的选择是可能的。在现代猪禽育种中，要求降低胴体中的脂肪含量以满足消费者对于瘦肉的要求，这一般是通过背膘厚的减少来衡量的。然而伴随这一过程的是其他脂肪沉积部位的脂肪含量，如IMF含量也同样减少，但IMF含量与其他生产性状的遗传相关虽然不利却只是中度的，背膘厚的下降与IMF含量的下降并不完全一致，因此，两个性状有分别进行选择的可能。据报道，猪肉IMF含量在2～3％的范围内是较理想的(DeVol等，1988；Cameron等，1991)，对于肌肉IMF含量是否越高越好尚存在争议，但对于低IMF含量品种的改良、培育优质畜禽品种，高肌内脂肪猪种的存在必然有着十分重要的意义。由于IMF含量在活体动物上很难进行测定，只能在胴体上测量，常规的选择育种一般是基于同窝个体的屠宰性状记录，提高猪肌肉中IMF的含量是比较困难的。对于这一类胴体性状，为了加快选择反应的速度，额外的标记或基因辅助育种是非常有前途的(Meuwissen等，1996)，使用分子遗传标记技术能极大地推动育种进程。

目前已研究的与猪肌内脂肪含量相关的基因有：(1)MI基因：MI基因是在对19头梅山公猪和126头荷兰母猪杂交产生的850头F2代猪进行肉质性状数据分离分析时发现的，是影响IMF含量的主效基因，并作用于剪切力和失水率。统计分析结果表明，MI基因双携带者将具有3.9％的IMF含量，而单携带者和非携带者IMF仅为1.8％，有极显著的差异(Janss等，1997)。该基因具体位于哪条染色体上目前还不清楚。(2)心脏脂肪酸结合蛋白(heart fatty acid binding protein，H-FABP)基因：H-FABP位于猪6号染色体上(Gerbens等，1997)，H-FABP对长链脂肪酸具有很强的亲和力，在多水的细胞浆液中含量很高，能承载脂肪酸并在细胞浆及浆液到亚细胞器间便利的通行，有转运长链脂肪酸和对脂肪酸代谢平衡调节的功能(Norbert等，2004)，其对脂肪酸的功能在小鼠上已经通过H-FABP基因的敲除实验得以证实(Schaap等，2003；Binas等，1999；Schaap等，1999)。可以结合长链脂肪酸及其CoA和肉毒碱酯(Paulussen等，1988)、亚铁血红素、胆红素、前列腺素和视黄醇类物质，H-FABP与脂肪酸的亲和力要高于比它与长链酰基CoA酯的亲和力。Gerbens等(1997)应用PCR-RFLP技术在猪H-FABP基因上发现了三个SNP，其中HinfI位点位于5′上游区域，而HaeIII和MspI位于第2内含子内，其中，MspI酶切位点有A和a等位基因，HaeIII有D和d等位基因，HinfI则有等位基因H和h，Gerbens等(1999)研究发现，aaddHH基因型猪比AADDhh基因型猪的IMF含量高约0.4％。林万华等(2003)对二花脸猪的研究也证实H-FABP基因与IMF含量间存在着一定的相关，并发现MspI和HaeIII位点具有明显的加性效应。(3)脂肪组织脂肪酸结合蛋白(adipocytefatty acid binding protein，A-FABP)基因：猪A-FABP位于4号染色体(Gerbens等，1998)，与H-FABP相同，A-FABP的主要配基也是长链脂肪酸，只不过A-FABP对游离脂肪酸水平变化的反应要更快一些。在猪A-FABP基因的研究中发现，在距离第二外显子69bp处的第一内含子上发现了一个[CA]21微卫星序列，在所检测的6个猪品种共检测到9个等位基因，等位基因频率在猪种问有较大差异。在杜洛克群体中，此位点有3个等位基因22(A1)、33(A2)和19(A3)，共组成6种基因型。统计分析表明在杜洛克群体中具有A1A3基因型的个体其IMF含量显著地高于A1A1型个体，IMF相差达1％，因此等位基因A3似乎对IMF含量的提高有利(Gerbens等，1998)。尽管猪肌内脂肪含量侯选基因的研究取得了一些重要进展，已揭述了几个候选基因，但猪的肌内脂肪含量涉及到的生理生化过程相当复杂，可能受多个基因的调控，仍有其它具有大效应的新基因有待发现。

Lpin1(lipin1)基因最先是通过位置克隆方法从fld(fatty liver dystrophy)小鼠中分离得到，研究发现fld小鼠中Lpin1基因的无义突变造成脂肪营养障碍(lipodystrophy)，表现为严重的脂肪组织缺失，胰岛素抵抗和周围神经病变(Péterfy等，2001)。

小鼠中的研究表明，Lpin1基因缺失能阻止饮食造成的和遗传性的肥胖；在转基因小鼠中研究发现，在肌肉组织或者脂肪组织中增加Lpin1的表达均能促进肥胖；仅在脂肪组织中增加Lpin1的表达，增加脂肪生成基因的表达；而在肌肉中分别抑制和促进Lpin1的表达对脂肪酸代谢的基因的表达有相反的作用。脂肪组织中lipin1蛋白影响脂肪细胞储存脂肪的能力，小鼠脂肪组织中含多余的lipin1会因为它们细胞存储过多的脂肪而使体重增加；而肌肉组织中lipin1蛋白决定全身的能量消耗和脂肪的利用，肌肉中含过量lipin1的小鼠则因抑制脂肪代谢的基因使得它们比正常小鼠燃烧的脂肪少而变肥胖(Phan等，2005)。lipin1蛋白在脂肪细胞中呈现双向性表达模式，在脂肪形成中有2个表达峰，进一步的研究发现小鼠中Lipin1经mRNA不同选择性剪切有多个转录本，其中，Lipinα定位于3T3-L1的细胞核表达峰值在3T3-L1细胞分化的第二天，此后水平逐渐下降；Lipinβ定位于细胞质，其表达在分化的10h短暂的升高，20h时降低到背景水平，在第2天至第6天时逐渐升高；在小鼠的胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)中超表达Lipinα，导致脂肪细胞分化必须的转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisomeproliferators activated receptor，PPARγ)和CCAAT/增强子结合蛋白(CAAT/enhancer binding protein，C/EBP)的上调表达；Lipinβ蛋白定位于细胞核，起诱导脂肪合成基因表达的作用，在MEFs中超表达Lipinβ，导致脂肪酸合成过程中的关键酶乙酰辅酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase 1，ACC1)，脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)，硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl CoA desaturase 1，SCD1)，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK))和二酰基甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase，DGAT)等基因的上调表达(Péterfy等，2005)。

Lpin1基因在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的同源基因为PAH1，PAH1基因编码一种Mg²⁺依赖的磷脂酸磷脂酶——催化磷脂酸的脱磷酸作用，产生甘油二酯和磷酸。该酶在甘油三酯，磷酸卵磷酯和脑磷酯的生物合成中起重要作用。酿酒酵母中超表达PAH1基因直接导致Mg²⁺依赖的磷脂酸磷脂酶活性的提高；PAH1基因在大肠杆菌中的异源表达证实了其编码产物为Mg²⁺依赖的磷脂酸磷脂酶，且酶的属性与从酵母中纯化的酶的属性相似。缺少PAH1基因的突变体将会使细胞积累磷脂酸，而甘油二酯及其衍生物甘油三酯的含量降低。在大肠杆菌中异源表达人的Lpin1基因也证实了Lpin1基因编码产物为一种Mg²⁺依赖的磷脂酸磷脂酶(Han等，2006)。

此外，在小鼠和人上的研究发现脂肪组织中Lpin1 mRNA水平与血清中的葡萄糖，胰岛素和甘油三酯含量存在很强的负相关(r＝-0.81，P＝0.001；r＝-0.74；P＝0.001；r＝-0.64，P＝0.001)。人上的研究发现，Lpin1mRNA水平与GLUT4mRNA含量存在显著相关(r＝069，p＜0.0001)(Suviolahti等，2006；vanHarmelen等，2007)。

发明内容

本发明的目的在于克隆一种猪肌内脂肪含量基因Lpin1，利用该基因的一个多态性位点作为猪肌内脂肪含量的分子标记的应用，为猪的育种提供一种标记辅助选择。

本发明通过以下技术实现：

本申请人克隆得到一种猪肌内脂肪含量基因Lpin1，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO：1所述。所获得的cDNA序列长度为5559bp，序列中包含2685bp的开放阅读框，111bp的5’非翻译区和2763bp的3’非翻译区，即在该序列中。第1-111bp处为5′UTR，第112-2796位CDS，第2797-5559位为3′UTR。

在此基础上，本申请人获得了一种猪肌内脂肪含量基因Lpin1的部分DNA序列如序列表SEQ ID NO：3所述。该DNA片段长度为316bp，其中第1-162位为第二外显子序列，第163-316位为第二内含子序列。在序列表SEQ ID NO：3的第61bp处有一个C61-T61的碱基突变，导致TaqI-RFLP多态性。

本发明设计了一对检测序列表SEQ IDNO；3中C61-T61碱基处突变的正、反向引物，该引物的序列如下所示：

正向引物：5′GTTTGTCACCGTGAAGGA 3′，

反向引物：5′AAGCCACAGTAATCAGAACA 3′。

一种筛选适用于猪肌内脂肪含量性状的分子标记的方法，按照以下步骤：

第一步：

用人Lpin1基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得相似性80％以上的EST；然后构建猪EST-重叠群，设计引物扩增cDNA片段，PCR产物纯化、克隆和测序；设计3’RACE引物；提取猪肌肉组织总RNA并做cDNA第一链反转录；RACE的PCR扩增和RACE产物的纯化、克隆和测序；通过序列分析获得如序列表SEQ IDNO：1所述的cDNA序列。

第二步：

根据序列表SEQ ID NO：1所述的cDNA序列与人Lpin1的基因组全长DNA序列的比对结果大致得出外显子的拼接位点，并根据猪Lpin1基因cDNA筛选猪DNA序列，设计引物进行PCR扩增，PCR产物纯化、克隆和测序，获得如序列表SEQ ID NO：3所述的DNA序列。

更详细的技术方案清参见《具体实施方式》的实施例部分。

申请人应用上述PCR-RFLP方法对猪内脂肪含量基因Lpin1第61位碱基突变进行了检测的应用。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3是本发明克隆的猪肌内脂肪含量基因Lpin1的cDNA和DNA序列；

图1：是本发明Lpin1基因的制备的流程图；

图2：是本发明中猪Lpin1基因C61-T61碱基处TaqI-RFLPs的三种基因型(TT CC TC)电泳结果。

具体实施方式

实施例1：Lpin1基因的克隆：

(1)引物设计：用人Lpin1基因cDNA(GenBank收录号：NM_145693)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在Nucleotide数据库猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列相似性为80％以上的ESTs(片段长度大于100bp)，将这些ESTs的收录号在NCBI中用ENTREZ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.html)查询相应序列，然后用DNAStat中的SeqMan程序构建猪EST-重叠群。根据EST拼接序列设计如表1所列的引物。

(2)建立3′RACE方法：以脂肪组织总RNA为模版，用引物anchor(见表1)进行反转录，以完成cDNA第一链的合成，然后进行两轮PCR：以cDNA为模版，以adaptor和lpn-3Routter(序列见表1)为引物进行PCR扩增；以第一轮PCR产物为模版，以adaptor和lpn-3Rinner为引物进行第二轮PCR扩增(引物见表1)。

表1：用于Lpin1基因cDNA克隆的引物序列

引物标号	引物序列(5，-3’)	预期PCR产物长度(bp)	退火温度(℃)
				lpn1S	5’CGCCGCCTGGTAAATC 3’	314bp	58
lpn1A	5’TCTATGTCCACCACCTTCTCT 3’
				lpn2S	5’TTGTCACCGTGAAGGAGCT 3’	2390bp	57
lpn2A	5’ATCAGCGGGTCGGTTTCC 3’
				lpn3S	5’AAGTGAGCCAAAACGGGTAT 3’	1622bp	54
lpn3A	5’AAAGAGGGTCAGTGTTGTGAGA 3’
				lpn4S	5’TTCTCACAACACTGACCCTC 3’	1225bp	56
lan4A	5’CAAATAGAGCATCCTGGC 3’
				lpn-3Rinner	5’GGAGGAACTTGGCTGATGGA 3’		58
lpn-3Routter	5’GAGGCTACATTCATTCTG 3’		58
				adaptor	5’GACCGTGACCGTAGTTCGTGATG 3’
anchor	5’GACCGTGACCGTAGTTCGTGATGTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3’

(3)PCR产物的纯化、克隆和测序：PCR产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml Ependorff管中，于70℃温育至凝胶完全融化，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自Promega公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是在每300μl融化的凝胶中加入1mlResin，混匀20s，将Resin/DNA混合物装入注射器，使浆液通过Minicolumn挤出。再在注射器中加入80％的异丙醇2ml，轻推活塞使异丙醇通过Minicolumn挤出，取下Minicolumn装入1.5ml Ependorff管中，10,000g离心2min以干燥Resin，将Minicolumn装入另一个干净的1.5ml Ependorff管中，加入30～50μl灭菌水，静置1min，10,000g离心20s，以洗脱DNA存于Ependorff管中。

连接反应：将纯化PCR产物与pMD18-T载体连接，连接反应总体积是5μl，其中包括2.5μl 2×buffer，0.5μl的T载体(购自TakaRa公司)，2μl的纯化PCR产物，置16℃水浴过夜。

感受态细胞的制备：从37℃培养了16～20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2ml LB中，于37℃振荡培养3h，转接1ml菌液于含有30ml LB的盐水瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待OD600达到0.3～0.4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10～15min，然后将菌液转入离心管中于4℃ 4,000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬沉淀，冰浴30min，重复4℃ 4,000g离心10min一次，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬沉淀，置4℃保存备用。

转化：无菌状态下取100～120μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3～4min，加入400μl无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，中文名称为异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。

质粒的小量制备：挑取平板上的单菌落，接种于2-3ml LB中，37℃300r/min培养过夜。用1.5ml EP管12000r/min离心数秒收集菌体。每管加入100μl用冰预冷的溶液I[50mM葡萄糖，25mM Tris.Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0)]，涡旋振荡至菌体充分悬浮。加入新配制的溶液II[0.2M NaOH，1％SDS]200μl，快速颠倒混匀，冰浴5min，然后加入预冷的溶液III[5M乙酸钾，冰乙酸11.5ml，H₂O28.5ml]150μl，混匀后冰浴5min，12000r/min离心5min，将上清转至另一EP管中，加入苯酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)500μl，涡旋振荡，离心后小心吸取上层水相，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r/min离心5min，沉淀用70％乙醇洗涤2次，抽干，加入含有RNA酶的TE 20μl。

重组质粒的酶切鉴定：取3μl质粒DNA与适量的双蒸水混匀，使其总体积为15μl，加入2-3U限制性内切酶EcoR I及2μl相应的10X限制性内切酶反应缓冲液，轻弹管壁混匀并离心，置37℃水浴1-2小时，取2-3μl反应液于琼脂糖凝胶电泳检测，酶切结果与预计完全相同者，即为目的重组质粒。重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序，序列测定由北京奥科生物技术有限公司完成。

(4)序列的同源性检索鉴定：通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center forBiotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local Alignment SearchTool)软件，将测序后获得的序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该序列的功能信息。

(5)Lpin1基因DNA序列的扩增：根据猪cDNA序列与人Lpin1基因的基因组全长DNA序列的比对结果大致得出外显子的拼接位点，并根据猪Lpin1基因cDNA筛选猪DNA序列，设计引物P-S1F和P-S1R进行PCR扩增，按照(3)所示的方法进行PCR产物纯化、克隆和测序。

Lpin1  P-S1F  5′GTTTGTCACCGTGAAGGA3′，

       P-S1R  5′AAGCCACAGTAATCAGAACA3′。

猪Lpin1基因的克隆结果：从中国地方猪种通城猪的成年猪的脂肪组织提取总RNA反转录合成的cDNA为模板，分别用表1所示的引物进行PCR扩增，扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR产物。将PCR产物回收纯化后克隆测序，并用DNAStar软件中的SeqMan程序进行拼接，得到一条长度为5559bp的cDNA序列(如序列表SEQ ID NO：1所示)。将这段cDNA序列在GenBank中进行同源性检索，检索结果该序列与人Lpin1基因cDNA(GenBank收录号：NM_145693)的相似性为82％以上，序列分析表明该cDNA序列具有2685bp(nt 112-2796)的开放阅读框，编码一个由894个氨基酸组成的蛋白质。然后从猪血液基因组中提取DNA，用引物P-S1F和P-S1R扩增得到长度为316bp特异扩增片段(如序列表SEQIDNO：3所示)，序列分析表明该序列包含部分第2外显子科部分第2内含子(参见序列表SEQ IDNO：3)。

实施例2：Lpin1基因C61-T61TaqI-RFLP基因型与部分胴体性状和肉质性状的关联分析的应用PCR-RFLP诊断方法建立

(1)PCR扩增条件：以P-S1F和P-S1R为引物进行PCR扩增，PCR反应总体积20μl，其中猪基因组DNA约100ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/L MgCl₂，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.4μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是：94℃ 3min，循环35次94℃ 30s，58℃ 30s，然后72℃ 25s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。

(2)RFLP检测条件：PCR产物酶切反应体积是10μl，其中1×buffer 1μl，PCR产物4μl，限制性内切酶TaqI为0.3μl(10U/μl)，用H₂O补足10μl，将样品混匀后离心，65℃酶切4h，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在凝胶成像系统下拍照。

Lpin1基因的C61-T61能被Taq I限制性内切酶(酶切位点为T↓CGA)识别，若基因型为CC，酶切后产生60bp和256bp两种大小的片段；若基因型为TT，酶切后长度仍为316bp；若基因型为TC，则产生316bp、256bp和60bp三种大小的片段，三种基因型CC，TC，TT如图2所述。

标记性状关联分析：申请人利用所在的动物分子生物学与育种实验室组建的“通城猪”(该品种属于一种公开饲养的中国地方猪品种)和其他血缘的猪群做性状关联分析，检测的个体数共188头，其中通城猪42头，英国大白猪25头，瑞典长白猪26头，大长通猪47头，长大通猪48头，所分析的性状有部分胴体性状和肉质性状(内脂率，板油率，3点平均背膘厚，肩部最厚处背膘厚，胸腰椎间背膘厚，臀中肌中点处背膘厚，6、7肋间背膘厚，10肋背膘厚和肌内脂肪含量)。分析方法使用SAS(视窗V8版)软件中的一般线性模型(General Linear Model，GLM)程序进行性状关联分析，建立的最小二乘模型如下：

y_ijk＝μ+GENOTYPE_i+PICI_j+COMBINATION_k+ε_ijk，

其中，y_ijk是性状观察值，μ为总体均数，GENOTYPE_i为基因型效应，PICI_j为批次效应，COMBINATION_k为组合的效应，ε_ijk为随机误差，假定服从N(0，σ²)分布。

基因型检测结果表明：在所检测的188个个体中，CC基因型有149个，TC基因型有35个，TT基因型有4个。基因型间性状的简单均数和标准差分析结果总结于表2，关联分析结果表明，TC基因型猪的肌内脂肪含量比CC基因型猪的高，且差异达到显著水平(p＜0.05)。

表2：不同Lpin1基因TaqI-RFLP基因型与部公生产性状的关联分析

基因型	个体数目	肌内脂肪含量(％)
			CC	149	2.52±0.09
TC	35	3.04±0.15
			TT	4	2.58±0.43
		P-value
			CC-TC		0.0036
CC-TT		0.8805
			TC-TT		0.2976

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种猪肌内脂肪含量基因Lpin1的克隆及其应用

<130>

<141>2007-09-18

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>5559

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>CDS

<222>(112)..(2796)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(204)..(204)

<223>

<220>

<221>gene

<222>(1)..(5559)

<223>

<220>

<221>5’UTR

<222>(1)..(111)

<223>

<220>

<221>3’UTR

<222>(2797)..(5559)

<223>

<400>1

cgccgcctgg taaatcggat ccacctcgcc tcccgcctcc cgcctcccgc ctccggagtc    60

gagtccccgc cgagccccgg ccgagccccg gccgccgcag aggctcaaac c atg gac    117

                                                         Met Asn

                                                         1

tac gtc ggg cag ctg gcg ggc cag gtg ttt gtc acc gtg aag gag ctc    165

Tyr Val Gly Gln Leu Ala Gly Gln Val Phe Val Thr Val Lys Glu Leu

        5                   10                  15

tac aag ggg ctg aat ccc gcc acc ctg tcc ggc tgc atc gac atc atc    213

Tyr Lys Gly Leu Asn Pro Ala Thr Leu Ser Gly Cys Ile Asp Ile Ile

    20                  25                  30

gtg gtg cgg cag ccc aac ggg agc ctg cag tgc tcc ccc ttc cac gtg    261

Val Val Arg Gln Pro Asn Gly Ser Leu Gln Cys Ser Pro Phe His Val

35                  40                  45                  50

cgc ttc ggg aag atg ggg gtc ctg cgc tcc cga gag aag gtg gtg gac    309

Arg Phe Gly Lys Met Gly Val Leu Arg Ser Arg Glu Lys Val Val Asp

                55                  60                  65

ata gag atc aac gga gag tca gtg gat ctg cac atg aaa ctg gga gac    357

Ile Glu Ile Asn Gly Glu Ser Val Asp Leu His Met Lys Leu Gly Asp

            70                  75                  80

aat gga gag gca ttt ttt gtt caa gag acg gat aat gat cag gag gtg    405

Asn Gly Glu Ala Phe Phe Val Gln Glu Thr Asp Asn Asp Gln Glu Val

        85                  90                  95

atc ccc acg cac ctg gcc acc tcc cca atc ctg tcg gaa ggc gcc tcg    453

Ile Pro Thr His Leu Ala Thr Ser Pro Ile Leu Ser Glu Gly Ala Ser

    100                 105                 110

cgg atg gag tcc cag ctg aaa agg aac tcc ctg gat cgg ctg cgg agc    501

Arg Met Glu Ser Gln Leu Lys Arg Asn Ser Leu Asp Arg Leu Arg Ser

115                 120                 125                 130

ctg gac ccc agc acg tca gcc cag gtc ctg ccc ccc ggc gag agc cct    549

Leu Asp Pro Ser Thr Ser Ala Gln Val Leu Pro Pro Gly Glu Ser Pro

                135                 140                 145

tcc agt ggc tct ttg gtg aag aag aga cgg aag agg agg agg aag tcc    597

Ser Ser Gly Ser Leu Val Lys Lys Arg Arg Lys Arg Arg Arg Lys Ser

            150                 155                 160

cag ctg gac agc ctg aaa agg gac gac aac acg aac acg tcg gag gat    645

Gln Leu Asp Ser Leu Lys Arg Asp Asp Asn Thr Asn Thr Ser Glu Asp

        165                 170                 175

gag gac atg ttt ccc ata gag atg agc tcg gac gag gag gct gag ccc    693

Glu Asp Met Phe Pro Ile Glu Met Ser Ser Asp Glu Glu Ala Glu Pro

    180                 185                 190

ctg gac agc agt aga act ctt tct agt gag atc cct cca ttc cag gaa    741

Leu Asp Ser Ser Arg Thr Leu Ser Ser Glu Ile Pro Pro Phe Gln Glu

195                  200                205                 210

gac gtc cct aaa gaa aac ctg tcc cca gtc gtg act tac ccg cag tcg    789

Asp Val Pro Lys Glu Asn Leu Ser Pro Val Val Thr Tyr Pro Gln Ser

                215                 220                 225

gcc tcg tac cct aat tcc gac aga gag tgg tca ccc agc gcc agt cct     837

Ala Ser Tyr Pro Asn Ser Asp Arg Glu Trp Ser Pro Ser Ala Ser Pro

            230                 235                 240

tca gtt tcc cgg cct tcc aca cct aaa agt gat tca gaa ttg gtc agt     885

Ser Val Ser Arg Pro Ser Thr Pro Lys Ser Asp Ser Glu Leu Val Ser

        245                 250                 255

aag tcc gcg gac agg aca atg cag aag aac aac ctt gaa atg ctg tgg     933

Lys Ser Ala Asp Arg Thr Met Gln Lys Asn Asn Leu Glu Met Leu Trp

    260                 265                 270

ctc tgg ggg gag ctg ccg caa gcc aca aag tca tct cca ctc aag ctg     981

Leu Trp Gly Glu Leu Pro Gln Ala Thr Lys Ser Ser Pro Leu Lys Leu

275                 280                 285                 290

aaa gac tcc agc ccg ttg aac agc agg aaa atc tat gat aaa atg cac    1029

Lys Asp Ser Ser Pro Leu Asn Ser Arg Lys Ile Tyr Asp Lys Met His

                295                 300                 305

ttt caa gcc att cac agt gaa tct tcg gac gcg ttc agc gac cag tca    1077

Phe Gln Ala Ile His Ser Glu Ser Ser Asp Ala Phe Ser Asp Gln Ser

            310                 315                 320

ccg acg ggg gcc cgg gag tcc ccg gtg ccg ccg ctc ttg gag cag agc    1125

Pro Thr Gly Ala Arg Glu Ser Pro Val Pro Pro Leu Leu Glu Gln Ser

        325                 330                 335

aag ccc cag gcc gag atg ccg ttc gcg aac gaa gaa gac gtt gag gcc    1173

Lys Pro Gln Ala Glu Met Pro Phe Ala Asn Glu Glu Asp Val Glu Ala

    340             345                     350

tta ggg gct gcg gcc ccg cct cta ccc acc atc gaa gag ccc aag ccc    1221

Leu Gly Ala Ala Ala Pro Pro Leu Pro Thr Ile Glu Glu Pro Lys Pro

355                 360                 365                 370

ctc tct gcc agc act gcc caa tct gcg agc aag aca gac tcg cct tca    1269

Leu Ser Ala Ser Thr Ala Gln Ser Ala Ser Lys Thr Asp Ser Pro Ser

                375                 380                 385

agg aaa aag gac aaa cga agc aga cac ctc ggg gcc gac ggc gtc tac    1317

Arg Lys Lys Asp Lys Arg Ser Arg His Leu Gly Ala Asp Gly Val Tyr

            390                 395                 400

ctg gat gac ctc aca gac atg gat ccc gaa gtc gcc gcc ctg tat ttc    1365

Leu Asp Asp Leu Thr Asp Met Asp Pro Glu Val Ala Ala Leu Tyr Phe

        405                 410                 415

ccc aaa aac gga gat ccg tct ggg ctc aca aaa cag gcc agc gac aac    1413

Pro Lys Asn Gly Asp Pro Ser Gly Leu Thr Lys Gln Ala Ser Asp Asn

    420                 425                 430

ggc gcc cgc tcg gcc aac cag tcc cca cag tcc gcg ggc agc tct ggc    1461

Gly Ala Arg Ser Ala Asn Gln Ser Pro Gln Ser Ala Gly Ser Ser Gly

435                 440                 445                 450

gtc gac agc ggc gtg gag agc acc tcc gac ggc ctg agg gac ctg ccg    1509

Val Asp Ser Gly Val Glu Ser Thr Ser Asp Gly Leu Arg Asp Leu Pro

                455                 460                 465

tcc atc gcc atc tcc ctg tgc ggg ggc ctc agc gac aac agg gaa atc    1557

Ser Ile Ala Ile Ser Leu Cys Gly Gly Leu Ser Asp Asn Arg Glu Ile

            470                 475                 480

acc aaa gat gtg ttt ttg gaa caa gcc gtg tcg tat caa cag ttt gtg    1605

Thr Lys Asp Val Phe Leu Glu Gln Ala Val Ser Tyr Gln Gln Phe Val

        485                 490                 495

gac aac cct gcc ctc atc gac gac ccc aat ctc gtg gtg aag atc ggg    1653

Asp Asn Pro Ala Leu Ile Asp Asp Pro Asn Leu Val Val Lys Ile Gly

    500                 505                 510

aat aaa tac tat aac tgg aca aca gcc gca cct ctg ctc ctg gcg atg    1701

Asn Lys Tyr Tyr Asn Trp Thr Thr Ala Ala Pro Leu Leu Leu Ala Met

515                 520                 525                 530

cag gcc ttc cag aaa cct ttg cca aag gcc acg gtg gaa tct atc atg    1749

Gln Ala Phe Gln Lys Pro Leu Pro Lys Ala Thr Val Glu Ser Ile Met

                535                 540                 545

agg gat aag atg ccc aga aag gga gga aga tgg tgg ttt tcg tgg cgg    1797

Arg Asp Lys Met Pro Arg Lys Gly Gly Arg Trp Trp Phe Ser Trp Arg

            550                 555                 560

gga aga aac acc gcg atc aaa gag gaa agc aag cca gag cag tgc ttg    1845

Gly Arg Asn Thr Ala Ile Lys Glu Glu Ser Lys Pro Glu Gln Cys Leu

        565                 570                 575

gca gga aag agc cac agt act ggg gag cag ccg tca cag ctt ggc atg    1893

Ala Gly Lys Ser His Ser Thr Gly Glu Gln Pro Ser Gln Leu Gly Met

    580                 585                 590

gcc acc aga atg aag cac gaa tca tcc tcc agt gat gag gag cac gca    1941

Ala Thr Arg Met Lys His Glu Ser Ser Ser Ser Asp Glu Glu His Ala

595                 600                 605                 610

gct gcc aag ccg tcc ggc aca agc cac ctc ccc ctg ttg tcc agc gtc    1989

Ala Ala Lys Pro Ser Gly Thr Ser His Leu Pro Leu Leu Ser Ser Val

                615                 620                 625

agc tac agg aag acc ctg cgg ctc acg tcg gag cag ctg aaa agc ctc    2037

Ser Tyr Arg Lys Thr Leu Arg Leu Thr Ser Glu Gln Leu Lys Ser Leu

            630                 635                 640

aag ttg aag aac ggc ccc aac gac gtg gta ttc agc gtc acc acg cag    2085

Lys Leu Lys Asn Gly Pro Asn Asp Val Val Phe Ser Val Thr Thr Gln

        645                 650                 655

tat cag ggc acg tgt cgc tgc gag ggc aac atc tac ctg tgg aac tgg    2133

Tyr Gln Gly Thr Cys Arg Cys Glu Gly Asn Ile Tyr Leu Trp Asn Trp

    660                 665                 670

gac gat aag gtg atc atc tcc gac att gac gga acc atc acc agg tcg    2181

Asp Asp Lys Val Ile Ile Ser Asp Ile Asp Gly Thr Ile Thr Arg Ser

675                 680                 685                 690

ggc act ctt ggc cac att ttg ccc acc ctt ggg aag gac tgg acc cac    2229

Gly Thr Leu Gly His Ile Leu Pro Thr Leu Gly Lys Asp Trp Thr His

                695                 700                 705

cag ggc ata gcc aag ctg tac cat aaa gtg agc caa aac ggg tat aag    2277

Gln Gly Ile Ala Lys Leu Tyr His Lys Val Ser Gln Asn Gly Tyr Lys

            710                 715                 720

ttc ctc tac tgc tcg gct cgt gcc atc ggg atg gcg gac atg acg cgg    2325

Phe Leu Tyr Cys Ser Ala Arg Ala Ile Gly Met Ala Asp Met Thr Arg

        725                 730                 735

ggc tac ctg cac tgg gtc aac gag cgt ggc acg gtg ctg ccc cag ggc    2373

Gly Tyr Leu His Trp Val Asn Glu Arg Gly Thr Val Leu Pro Gln Gly

    740                 745                 750

ccg ctg ctc ctg agc ccc agc agc ctc ttc tcc gcc ctg cac aga gaa    2421

Pro Leu Leu Leu Ser Pro Ser Ser Leu Phe Ser Ala Leu His Arg Glu

755                 760                 765                 770

gtg att gaa aag aag cca gag aag ttt aaa gtc cag tgt ttg aca gac    2469

Val Ile Glu Lys Lys Pro Glu Lys Phe Lys Val Gln Cys Leu Thr Asp

                775                 780                 785

atc aaa aac ctg ttt ttc cca aac aca gaa cct ttt tat gct gct ttt    2517

Ile Lys Asn Leu Phe Phe Pro Asn Thr Glu Pro Phe Tyr Ala Ala Phe

            790                 795                 800

gga aac cga ccc gct gat gtg tac tcg tac aag caa gtg gga gtg tcc    2565

Gly Asn Arg Pro Ala Asp Val Tyr Ser Tyr Lys Gln Val Gly Val Ser

        805                 810                 815

ctg aac aga ata ttc act gtc aac ccc aaa ggg gag ctg gtg cag gaa    2613

Leu Asn Arg Ile Phe Thr Val Asn Pro Lys Gly Glu Leu Val Gln Glu

    820                 825                 830

cac gcc aag acc aac atc tcc tcg tac gtg agg ctc tgc gag gtg gtc    2661

His Ala Lys Thr Asn Ile Ser Ser Tyr Val Arg Leu Cys Glu Val Val

835                 840                 845                 850

gac cac gtt ttc cca ttg ctg aaa aga agc cac tct tct gac ttc ccc      2709

Asp His Val Phe Pro Leu Leu Lys Arg Ser His Ser Ser Asp Phe Pro

                855                 860                 865

tgc tca gac acg ttc agt aac ttc acc ttt tgg agg gag cca ccg cca      2757

Cys Ser Asp Thr Phe Ser Asn Phe Thr Phe Trp Arg Glu Pro Pro Pro

            870                 875                 880

cct ttt gaa aac cag gac gtt cat tct gca tcg gcg tag actgttccag       2806

Pro Phe Glu Asn Gln Asp Val His Ser Ala Ser Ala

        885                 890

gcaaactcct gacatcctgc gaagacctgg cacccccatt aaaggagagg tttggggacg    2866

tgcagtcatg tgcttaagag cagagagcat ccaggagcct ttctctcccc gtcccccctc    2926

gccggggggg acatttccaa gtgacccgtg aagggtgtac ttcctaggtc ctaggggagt    2986

tgggggcctc cctggtgtgg aggctgcgcc ttgtgtggcc caagcccgtc accgcgctgc    3046

cctccccggc cccgctccag tcctggagcc tctataatgt gtgcagggtg ggccgggaaa    3106

cctggggtcc ccaggatgac gggtcccggg aggggcgcca ggcccccacg acttctggga    3166

gagtcagggg cacgtttcca catggcacgt ggtgccactt ctgctgcgcc tggcgggagg    3226

cggtgcaggg cctggtgacc tgaatccgag gtctcggaag ggactccaag cctcccggtg    3286

ctcggccttg accgcgtggc tgtcccccgg caggatttgc tccctgcccc cccccccatt    3346

taggagataa gttcttaaat tcctttggtt aaagatcacc tctgtagctg gcgtatttcc    3406

ccccattttt gtggcgcaag gctggaatgt ttatgcctta tgcatctgcg gcaggcattt    3466

gatttcgaat gtgctttgcc cggctccctg ccactttgca atgccttaag ttcagacgag    3526

aggagatatt cctaaggcag tattttgaat cacttcctta ctctgccagc aacctgccta    3586

gcaaggcggt gctgaaaatg tgggctccag cagagtttat gcccaacggt gatgatggca    3646

gtgtccgttg ggggctctca agggagactg gtcggtttta agaaaatagt tggaagaagt    3706

taaattatat tctttgtaga tcgtattatt tattccttta ctctgggttg ctgttataag    3766

cattttagcc atattcgtcc tattacaact gtcattaata cattaaaaag atacctatta    3826

gaccatccaa aaagccttat tctgtacttc tcacaacact gaccctcttt ggggttttgt    3886

gagtaatgct tttcctttcc cttagccccg cacccgcccc aggttcaggg caagtgggga    3946

agtagccatt tgagtgacat tctttgacct ggtagaagat aattcttttc cttgtttatt    4006

aaattggctg ctggagagaa taatgtgaaa agcgaaaaca ttattttggt aaaaaaaaaa    4066

aaaaaaaaaa aaaaagtgct gcttgactgt acgaagtgtt tttttttttt tttaagcgtt    4126

ttgctccagt gactgaaatg ccctcctact taaatctcgt ggttagagtc ggagggccca    4186

ggcagtggga tggctgatgg cagctttact ctttctgtga aagaaaatcc agaggtggca    4246

ttgccttctt tgttgtcagg gggctctgct gcctgtgggc gccttcaccg agcggtctgt    4306

ggggttacac agataagagc aaacatccct gtgcagctga gtgtaggcct gcattcaagc    4366

acgaactgca tgtacagatg ccctttggga ggcattaaaa attttaaatt tttataattt    4426

aaaataggga gttccctggt ggcccagtgg gttaagaatc tggcatcacc acagtgactt    4486

gggttgctgc tggagtgccg gtttgatccc agacacggga acttctgcag gccaagggtg 4546

tggctaaagg aaaaaaagta atttaaatag tcctgcttta gcttgggctt gcttattagt 4606

tttagaggct acattcattc tgtcacaagg gtatcttagg gtgaatttta agtattgtga 4666

actacgtgga agcaagctca cgagcctgca cagaccagcc cggtttctcc ctcgcgctgg 4726

gaggaacttg gctgatggat ctcgtgtccc ttgtggggtt tgccttgcag cgggacaacc 4786

agctgtcgtc ctctctcctg agagtatgca tctttggacc ccaaatttca atgtccccta 4846

agctctctcc tcagcacccc ctgaaacggc acaccatccg gaaagcagca ctctcagatc 4906

tgtgtcgggt tcagagcgtg agccctggag aggctgtacc attcacacct gcccatggct 4966

tcgggaacga ctagtgcatg ggcagccctc aggcctctgt gggttggttt agctgtggtc 5026

acacatccct aactcagtga ccccacagcc gtgggccagg atgctctatt tggaccacac 5086

atatcgaagt cgccctctgg atgatcgaat cacgaagtga caagtcatcg aatgttcatc 5146

acatgtggtg aaggaaaata gaaaataatt ccaccttcaa agagaattcc cttttccatt 5206

ttaggtttgg atcgctgctt gaacgtattt tatttccaac ccttggtctg tgtttgtaga 5266

tgccgggaca atgataaaaa tcactgtaat acttccttgt gctgggctgg atgcaaagct 5326

agaaaatact gtaataaatg agaccaatga aagacctccc tgaacctcag ccgtgtgcat 5386

tttaaatagt tgttggtaag ttgctgattt cctactctgt gatctcaagc atattatttt 5446

ctactcagaa aacaaaaatg aaagcaaaaa cccttaaggc tatgatctgt tcagtatttg 5506

gaataaaaga gccagtcttt tctgatgcct ttggtgaaaa aaaaaaaaaa aaa        5559

<210>2

<211>894

<212>PRT

<213>猪(Sus scrofa)

<400>2

Met Asn Tyr Val Gly Gln Leu Ala Gly Gln Val Phe Val Thr Val Lys

1               5                   10                  15

Glu Leu Tyr Lys Gly Leu Asn Pro Ala Thr Leu Ser Gly Cys Ile Asp

            20                  25                  30

Ile Ile Val Val Arg Gln Pro Asn Gly Ser Leu Gln Cys Ser Pro Phe

        35                  40                  45

His Val Arg Phe Gly Lys Met Gly Val Leu Arg Ser Arg Glu Lys Val

    50                  55                  60

Val Asp Ile Glu Ile Asn Gly Glu Ser Val Asp Leu His Met Lys Leu

65                  70                  75                  80

Gly Asp Asn Gly Glu Ala Phe Phe Val Gln Glu Thr Asp Asn Asp Gln

                85                  90                  95

Glu Val Ile Pro Thr His Leu Ala Thr Ser Pro Ile Leu Ser Glu Gly

            100                 105                 110

Ala Ser Arg Met Glu Ser Gln Leu Lys Arg Asn Ser Leu Asp Arg Leu

        115                 120                 125

Arg Ser Leu Asp Pro Ser Thr Ser Ala Gln Val Leu Pro Pro Gly Glu

    130                 135                 140

Ser Pro Ser Ser Gly Ser Leu Val Lys Lys Arg Arg Lys Arg Arg Arg

145                 150                 155                 160

Lys Ser Gln Leu Asp Ser Leu Lys Arg Asp Asp Asn Thr Asn Thr Ser

                165                 170                 175

Glu Asp Glu Asp Met Phe Pro Ile Glu Met Ser Ser Asp Glu Glu Ala

            180                 185                 190

Glu Pro Leu Asp Ser Ser Arg Thr Leu Ser Ser Glu Ile Pro Pro Phe

        195                 200                 205

Gln Glu Asp Val Pro Lys Glu Asn Leu Ser Pro Val Val Thr Tyr Pro

    210                 215                 220

Gln Ser Ala Ser Tyr Pro Asn Ser Asp Arg Glu Trp Ser Pro Ser Ala

225                 230                 235                 240

Ser Pro Ser Val Ser Arg Pro Ser Thr Pro Lys Ser Asp Ser Glu Leu

                245                 250                 255

Val Ser Lys Ser Ala Asp Arg Thr Met Gln Lys Asn Asn Leu Glu Met

            260                 265                 270

Leu Trp Leu Trp Gly Glu Leu Pro Gln Ala Thr Lys Ser Ser Pro Leu

        275                 280                 285

Lys Leu Lys Asp Ser Ser Pro Leu Asn Ser Arg Lys Ile Tyr Asp Lys

    290                 295                 300

Met His Phe Gln Ala Ile His Ser Glu Ser Ser Asp Ala Phe Ser Asp

305                 310                 315                 320

Gln Ser Pro Thr Gly Ala Arg Glu Ser Pro Val Pro Pro Leu Leu Glu

                325                 330                 335

Gln Ser Lys Pro Gln Ala Glu Met Pro Phe Ala Asn Glu Glu Asp Val

            340                 345                 350

Glu Ala Leu Gly Ala Ala Ala Pro Pro Leu Pro Thr Ile Glu Glu Pro

        355                 360                 365

Lys Pro Leu Ser Ala Ser Thr Ala Gln Ser Ala Ser Lys Thr Asp Ser

    370                 375                 380

Pro Ser Arg Lys Lys Asp Lys Arg Ser Arg His Leu Gly Ala Asp Gly

385                 390                 395                 400

Val Tyr Leu Asp Asp Leu Thr Asp Met Asp Pro Glu Val Ala Ala Leu

                405                 410                 415

Tyr Phe Pro Lys Asn Gly Asp Pro Ser Gly Leu Thr Lys Gln Ala Ser

            420                 425                 430

Asp Asn Gly Ala Arg Ser Ala Asn Gln Ser Pro Gln Ser Ala Gly Ser

        435                 440                 445

Ser Gly Val Asp Ser Gly Val Glu Ser Thr Ser Asp Gly Leu Arg Asp

    450                 455                 460

Leu Pro Ser Ile Ala Ile Ser Leu Cys Gly Gly Leu Ser Asp Asn Arg

465                 470                 475                 480

Glu Ile Thr Lys Asp Val Phe Leu Glu Gln Ala Val Ser Tyr Gln Gln

                485                 490                  495

Phe Val Asp Asn Pro Ala Leu Ile Asp Asp Pro Asn Leu Val Val Lys

            500                 505                 510

Ile Gly Asn Lys Tyr Tyr Asn Trp Thr Thr Ala Ala Pro Leu Leu Leu

        515                 520                 525

Ala Met Gln Ala Phe Gln Lys Pro Leu Pro Lys Ala Thr Val Glu Ser

    530                 535                 540

Ile Met Arg Asp Lys Met Pro Arg Lys Gly Gly Arg Trp Trp Phe Ser

545                 550                 555                 560

Trp Arg Gly Arg Asn Thr Ala Ile Lys Glu Glu Ser Lys Pro Glu Gln

                565                 570                 575

Cys Leu Ala Gly Lys Ser His Ser Thr Gly Glu Gln Pro Ser Gln Leu

            580                 585                 590

Gly Met Ala Thr Arg Met Lys His Glu Ser Ser Ser Ser Asp Glu Glu

        595                 600                 605

His Ala Ala Ala Lys Pro Ser Gly Thr Ser His Leu Pro Leu Leu Ser

    610                 615                 620

Ser Val Ser Tyr Arg Lys Thr Leu Arg Leu Thr Ser Glu Gln Leu Lys

625                 630                 635                 640

Ser Leu Lys Leu Lys Asn Gly Pro Asn Asp Val Val Phe Ser Val Thr

                645                 650                 655

Thr Gln Tyr Gln Gly Thr Cys Arg Cys Glu Gly Asn Ile Tyr Leu Trp

            660                 665                 670

Asn Trp Asp Asp Lys Val Ile Ile Ser Asp Ile Asp Gly Thr Ile Thr

        675                 680                 685

Arg Ser Gly Thr Leu Gly His Ile Leu Pro Thr Leu Gly Lys Asp Trp

    690                 695                 700

Thr His Gln Gly Ile Ala Lys Leu Tyr His Lys Val Ser Gln Asn Gly

705                 710                 715                 720

Tyr Lys Phe Leu Tyr Cys Ser Ala Arg Ala Ile Gly Met Ala Asp Met

                725                 730                 735

Thr Arg Gly Tyr Leu His Trp Val Asn Glu Arg Gly Thr Val Leu Pro

            740                 745                 750

Gln Gly Pro Leu Leu Leu Ser Pro Ser Ser Leu Phe Ser Ala Leu His

        755                 760                 765

Arg Glu Val Ile Glu Lys Lys Pro Glu Lys Phe Lys Val Gln Cys Leu

    770                 775                 780

Thr Asp Ile Lys Asn Leu Phe Phe Pro Asn Thr Glu Pro Phe Tyr Ala

785                 790                 795                 800

Ala Phe Gly Asn Arg Pro Ala Asp Val Tyr Ser Tyr Lys Gln Val Gly

                805                 810                 815

Val Ser Leu Asn Arg Ile Phe Thr Val Asn Pro Lys Gly Glu Leu Val

            820                 825                 830

Gln Glu His Ala Lys Thr Asn Ile Ser Ser Tyr Val Arg Leu Cys Glu

        835                 840                 845

Val Val Asp His Val Phe Pro Leu Leu Lys Arg Ser His Ser Ser Asp

    850                 855                 860

Phe Pro Cys Ser Asp Thr Phe Ser Asn Phe Thr Phe Trp Arg Glu Pro

865                 870                 875                 880

Pro Pro Pro Phe Glu Asn Gln Asp Val His Ser Ala Ser Ala

                885                 890

<210>3

<211>316

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(316)

<223>

<220>

<221>Intron

<222>(163)..(316)

<223>

<220>

<221>exon

<222>(1)..(162)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(61)..(61)

<223>

<400>3

gtt tgt cac cgt gaa gga gct cta caa ggg gct gaa tcc cgc cac cct     48

Val Cys His Arg Glu Gly Ala Leu Gln Gly Ala Glu Ser Arg His Pro

1               5                   10                  15

gtc cgg ctg cat cga cat cat cgt ggt gcg gca gcc caa cgg gag cct     96

Val Arg Leu His Arg His His Arg Gly Ala Ala Ala Gln Arg Glu Pro

            20                  25                  30

gca gtg ctc ccc ctt cca cgt gcg ctt cgg gaa gat ggg ggt cct gcg    144

Ala Val Leu Pro Leu Pro Arg Ala Leu Arg Glu Asp Gly Gly Pro Ala

        35                  40                  45

ctc ccg aga gaa ggt ggt aagtgacctg gcggccggct tctctcccgg           192

Leu Pro Arg Glu Gly Gly

    50

gaaggtcatc acgtttctgc ggcctcgcgg agcgccttgc cgcctcccag ggtgtagccc  252

tcgggtggcc cctgaattgc cgattactaa ctcagattgt agattgttct gattactgtg  312

gctt                                                               316

Claims (7)

1.一种猪肌内脂肪含量基因Lpin1，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO：1所述。

2.根据权利要求1所述的cDNA序列，其特征在于：所获得的基因Lpin1序列长度为5559bp，序列中包含2685bp的开放阅读框，111bp的5’非翻译区和2763bp的3’非翻译区。

3.一种猪肌内脂肪含量基因Lpin1，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO：3所述。

4.根据权利要求3所述的DNA序列，其特征在于：序列表SEQ ID NO：3的第61bp处有一个C61-T61的碱基突变，导致Taq1-RFLP多态性。

5.根据权利要求3所述的DNA序列，其中检测C61-T61碱基处突变的正、反向引物的DNA序列如下所示：

正向引物：5′GTTTGTCACCGTGAAGGA 3′，

反向引物：5′AAGCCACAGTAATCAGAACA 3′。

6.权利要求1-5所述的基因在猪分子标记辅助选择中的应用。

7.一种筛选适用于猪肌内脂肪含量性状的分子标记的方法，按照以下步骤：

第一步：

用人Lpin1基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得相似性80％以上的EST；然后构建猪EST-重叠群，设计引物扩增cDNA片段，PCR产物纯化、克隆和测序；设计3’RACE引物；提取猪肌肉组织总RNA并做cDNA第一链反转录；RACE的PCR扩增和RACE产物的纯化、克隆和测序；通过序列分析获得如序列表SEQ ID NO：1所述的cDNA序列；

第二步：

根据序列表SEQ ID NO：1所述的cDNA序列与人Lpin1的基因组全长DNA序列的比对结果大致得出外显子的拼接位点，并根据猪Lpin1基因cDNA筛选猪DNA序列，设计引物进行PCR扩增，PCR产物纯化、克隆和测序，获得如序列表SEQ ID NO：3所述的DNA序列。

Images