CN101544979B - 猪肌内脂肪沉积的主效基因及其分子标记 - Google Patents

Abstract

本发明提供了猪肌内脂肪沉积的主效基因及其分子标记，并公开了其在猪育种、制备与猪肌内脂肪沉积的基因诊断相关的产品中的应用。以本发明为基础开发猪肌内脂肪沉积性状的基因诊断技术，建立肌内脂肪超级沉积的核心猪群，将使猪育种工作者能够在短时间内培育出高瘦肉率、高肌内脂肪含量的猪种。

Description

猪肌内脂肪沉积的主效基因及其分子标记

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及猪肌内脂肪沉积的主效基因及其分子标记。

背景技术

随着人们生活水平提高，消费者对肉品质越来越关注。我国地方猪种因肉质良好而著名，广受消费者赞誉，但因瘦肉率低、生长速度慢、饲料报酬低的原因，被排斥在国内外猪肉生产系统的主流品种之外。近半个世纪当中，世界范围内猪的育种过于追求瘦肉率，导致猪肉生产中占主导地位的猪种均是瘦肉型猪，肌内脂肪含量普遍低于2％，猪肉肉质受到消费者的诸多诟病。

肌内脂肪是指肌纤维之间或肌纤维内部沉积的脂肪，它与肉质关系密切，是影响肉质的关键因素之一。肌内脂肪含量的增加可以显著改善肉的多汁性、色泽、风味、嫩度和持水力等指标，一般认为猪肉肌内脂肪含量为3.0％的肉质较好。由于对肌内脂肪沉积的分子机理了解很少，猪肌内脂肪这一性状还没有有效的遗传标记(或分子标记)，鉴于肌内脂肪沉积这一性状的遗传复杂性，目前在选育中还无法对肌内脂肪含量这一性状进行有效地选择。只能利用肌内脂肪含量高的地方猪种与瘦肉型猪杂交，来提高商品猪的肌内脂肪含量。

目前肌内脂肪沉积的遗传基础和调控机制还不清楚，猪选育中肌内脂肪含量缺乏可行的选择指标，通常只能通过个体的B超和后裔的屠宰试验测定来评估肌内脂肪含量。虽然B超法较超声波法有较大改进，但由于不了解肌内脂肪沉积的遗传学规律，所以在选育中效果一直不理想，达不到预期目标。另一方面，我国地方猪种的选育程度较低，同一猪种内部也包涵丰富的遗传多样性，因此利用我国地方猪种与瘦肉型猪杂交来提高商品猪肌内脂肪含量、改善肉品质的效果参差不齐，无法稳定有效地发挥我国地方猪种肉质优良的遗传潜力。由于缺乏有效的选育手段，目前利用杂交选育方法在肌内脂肪沉积上难以获得突破，地方猪种与瘦肉型猪的杂交优势也难以在随后的继代选育中得到保持和固定。总之，就目前的选育和饲养手段而言，增加肌内脂肪含量即意味着增加皮下脂肪的沉积，降低瘦肉率，因此如何在保持较少的皮下脂肪的同时增加肌内脂肪含量，是目前肉质调控所面临的难题。

鉴于肌内脂肪含量这一性状的遗传复杂性，单纯利用后裔测定和个体性能测定等方法很难显著提高肌内脂肪的含量。现代动物育种发展趋势表明，获得目标性状的真实遗传(分子)标记，是对复杂性状进行有效选育的关键。就现代农业生物技术领域而言，每一个涉及重要经济性状的功能基因或其等位突变的发现，都带来了相关领域研究的重要突破，而由此衍生的基因诊断技术，都给农业发展带来巨大的经济效益和社会效益。1991年Fujii首次克隆了猪高温应激综合征(MHS)基因，发现这种猪的猪骨骼肌浆网(SR)钙离子通道蛋白(CRC)基因(又称兰尼定受体基因)RYR1/CRC序列发生等位突变，即1843位的C→T突变，这种隐性遗传的疾病基因每年造成世界养猪业高达20亿美元的损失。随后在世界范围内的猪选育中，利用基因诊断技术，淘汰该突变基因的携带者，大大降低了养猪业由此引起的损失。而猪高产仔数基因(ESR)的基因诊断技术，使得在猪育种中大大加快了母猪产仔数提高的进程。

因此，筛选肌内脂肪沉积的功能基因或主效基因、获得有关肌内脂肪沉积的功能基因或主效基因的分子标记是解决目前肌内脂肪选育的核心问题和终极对策。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的是提供有关猪肌内脂肪沉积的主效基因及其分子标记

(二)技术方案

本发明的发明人在研究中发现，肌内脂肪沉积与猪肌肉组织中氯离子通道5基因(CLIC5A)的转录表达有着直接的联系。基于这一发现，建立了肌内脂肪沉积的分子标记。这是迄今为止发现的猪肌内脂肪沉积的唯一的分子标记，是建立在遗传学规律和基因表达基础的分子标记，与先前利用B超等方法测定个体肌内脂肪含量进行选育的方法有着本质的区别。

一般而言，荣昌猪肌内脂肪含量约为4.0％-5.0％，是瘦肉型猪的2倍左右。在重庆荣昌进行日粮赖氨酸/消化能比值对荣昌猪肌内脂肪沉积影响的饲养试验和屠宰试验中发现有个别荣昌猪肌内脂肪超级沉积，这些特殊荣昌猪肌内脂肪含量可以达到8.8％-9.1％，几乎是普通荣昌猪的1倍。在随后的研究中，利用猪的Affymetrix(Affymetrix，Inc.，USA)寡核苷酸芯片，对60kg和90kg的瘦肉型猪(PIC猪)、普通荣昌猪和肌内脂肪超级沉积的荣昌猪的背最长肌组织的基因转录表达谱进行了扫描。筛选出了与不同猪表型性状(肌内脂肪沉积)倍增表达关系一致(正调控)或相反(负调控)的20余个基因或表达序列标签(EST)。对这些基因或EST进行克隆，获得cDNA全长，利用克隆测序的方法，在猪群中对不同样本的候选基因进行测序比较。实验结果如下：

在氯离子通道5基因的3′UTR区首次克隆到猪肌内脂肪沉积的调控序列，它由长度为20bp的DNA分子S1和长度为18bp的DNA分子S2组成，其中，S1的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，S2的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。S1和S2的表达导致肌内脂肪沉积显著增加。

根据调控序列S1和S2的表达与否，通过序列分析得到猪肌内脂肪沉积的主效基因，它由A、B、C三个等位基因组成(位于氯离子通道5基因上)，其中，等位基因A的碱基序列如SEQ ID NO：3所示(调控序列S1和S2均表达)，等位基因B的碱基序列如SEQ ID NO：4所示(调控序列S1缺失，S2表达)，等位基因C的碱基序列如SEQ ID NO：5所示(调控序列S1和S2均缺失)。

在此基础上，通过进一步的序列分析，得到A、B、C三个等位基因的分子标记，具体如下：

1、等位基因A的分子标记，它包括如下7种形式：

(1)、166位为G；

(2)、168、169位为GG；

(3)、172位为C；

(4)、176位多一个A；

(5)、180位为C；

(6)、191位为G；

(7)、调控序列S1和S2均表达；且

以上7种情况均连锁。

2、等位基因B的分子标记，它包括如下7种形式：

(1)、166位为A；

(2)、168、169位为AA；

(3)、172位为G；

(4)、176位少一个A；

(5)、180位为T；

(6)、191位为C；

(7)、调控序列S1缺失，S2表达；且

以上7种情况均连锁。

3、等位基因C的分子标记，它包括如下2种形式：

(1)、215位的C替换T；

(2)、调控序列S1和S2均缺失；且

以上2种情况连锁。

本发明公开了上述主效基因(即A、B、C三个等位基因)以及其对应的分子标记在牛、羊、猪等大型家畜的育种、制备与猪肌内脂肪沉积的基因诊断相关的产品中的应用。

优选地，所述大型家畜为猪。更优选地，所述大型家畜为荣昌猪。

(三)有益效果

肌内脂肪是影响肉质风味的重要因素，然而不能区别并独立地选育瘦肉率和肌内脂肪含量这两个性状，成为长期困扰猪育种界的世界性难题。以本发明为基础开发猪肌内脂肪沉积性状的基因诊断技术，建立肌内脂肪超级沉积的核心猪群，将使猪育种工作者能够在短时间内培育出高瘦肉率、高肌内脂肪含量的猪种。目前，世界年出栏12多亿头猪，本发明的应用将为全球的养猪业和猪育种领域带来巨大的经济效益，同时也将对我国地方品种猪优良基因资源的保护和开发起到重要的作用。

附图说明

图1是等位基因A、B、C序列比较图，其中1-1表示等位基因A，2-2表示等位基因B，5-2表示等位基因C；

图2是60kg荣昌猪CLIC5A不同基因型的背最长肌肌内脂肪含量图；

图3是90kg荣昌猪CLIC5A不同基因型的背最长肌肌内脂肪含量图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

实施例1猪肌内脂肪沉积的调控基因、主效基因及其分子标记的序列克隆与分析

1、扩增引物：

PCR扩增条件：(1)94℃，4min；(2)94℃，30s；(3)54.2℃，30s；(4)72℃，40s；(5)Goto(2)35cycles；72℃，8min。

2、序列测定与分析：

①PCR产物切胶、纯化回收：100μL PCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶呈像仪(Vilber Lourmat，Tex-20LM，France)下，切胶，利用胶回收试剂盒(北京盈信阳光生物技术有限公司，北京)回收纯化。

②与T载体连接，反应体系如下：

T-vector        1μL

cDNA            4μL

Ligation mix    5μL

合计            10μL

16℃水浴过夜，16h。

③转化：用100μL感受态细胞，加10μL连接产物，冰浴30min，42℃水浴，热激90s，冰浴2-5min，每管加800μL LB液体培养基，37℃培养1h，100-150μL培养液涂板，37℃培养12h。挑20个单个菌落划线，37℃培养12h。菌落PCR鉴定，每个猪样本取4-5个菌斑，用灭菌牙签挑起，投入含5ml LB液体培养基+10μL抗生素的灭菌试管中，封好塞子，放入摇床，37℃，255r/min过夜，分装菌液，送测序公司(三博远志科技有限公司，北京)测序。

④序列分析：结果如附图1所示，其中1-1表示等位基因A，2-2表示等位基因B，5-2表示等位基因C；图中虚线表示缺失序列，第一段缺失S1序列(20bp)，第二段缺失S2序列(18bp)。

由此得到猪肌内脂肪沉积的调控序列S1和S2、主效基因(即等位基因A、B、C)及对应的分子标记(见说明书的技术方案部分)。

实施例2不同基因型猪肌内脂肪含量检测实验：

分别在荣昌猪(脂肪型猪)和PIC猪(瘦肉型猪)群体中测定了60kg、90kg体重CLIC5A不同基因型的背最长肌肌内脂肪含量，发现该基因的基因型与肌内脂肪密切相关。

荣昌猪中检测到AA型、AB型、BB型、BC型四种基因型，分别在群体中占8.3％，33.3％，50％和8.3％，未检测到AC型和CC型。

图1表示60kg荣昌猪CLIC-5不同基因型肌内脂肪含量，其中AA型肌内脂肪含量最高，达到8.15％；其次为AB型，肌内脂肪含量达到4.5％左右；而BB型最低，平均为2.9％。

在90kg荣昌猪中，AA型猪的肌内脂肪含量最高，AB型猪其次，其它两种基因型(BB型和BC型)猪的肌内脂肪含量较低，且差异不显著，如图2和表1所示。

表190kg不同基因型荣昌猪肌内脂肪的含量(％)

对于瘦肉型PIC猪(90kg体重)，群体中BB型猪的比例35.7％，BC基因型猪的比例为64.3％，未发现CC型猪。BB型猪为肌内脂肪含量显著高于BC型猪(见表1)，肌内脂肪含量提高了49.6％。

表290kg不同基因型PIC猪肌内脂肪含量(％)

结果分析：同一基因型的荣昌猪与PIC猪肌内脂肪含量差异较大，这表明CLIC5的基因型不是导致荣昌猪和PIC猪肌内脂肪沉积种间差异的全部原因，但鉴于不同基因型的荣昌猪的肌内脂肪含量差异显著的情况，该基因不同基因型却是导致我国地方猪(荣昌猪)肌内脂肪沉积呈多样性的主要原因，也是进一步增加了肌内脂肪沉积的种间差异的重要因素。因而在牛、羊、猪等大型家畜的育种、制备与猪肌内脂肪沉积的基因诊断相关的产品中有巨大的应用潜力。

序列表

<110>北京德宝群兴科技有限公司

<120>猪肌内脂肪沉积的主效基因及其分子标记

<130>P08001

<160>5

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>猪(sus)

<400>1

actccacctg ggggagctaa    20

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>猪(sus)

<400>2

ggagctattc cacctggg      18

<210>3

<211>355

<212>DNA

<213>猪(sus)

<400>3

cagaaagaac atccaggacc aataatattg atttggtttg gcttgtttgc ttttaaaggc     60

tgtgtttaaa gacttgccaa ttgctgaatt ctgaatatca aatcagcatg ttagtgtcca    120

aaaactcctc tggggagcta ttccacccgg gggagctact ctacctgggg gacctaactc    180

cacctggggg agctaactcc acctggggga gctaactcca cctgggggag ctattccacc    240

tgggcatcct cttttctctg tcgctggctg tgtttctcag gtatacttca agaacagcac    300

ctctgtgggt ctcaggaaag taaactgcct cttagatcgt catgcctgtg ctaag         355

<210>4

<211>334

<212>DNA

<213>猪(sus)

<400>4

cagaaagaac atccaggacc aataatattg atttggtttg gcttgtttgc ttttaaaggc     60

tgtgtttaaa gacttgccaa ttgctgaatt ctgaatatca aatcagcatg ttagtgtcca    120

aaaactcctc tggggagcta ttccacccgg gggagctact ctacctagaa gagctactct    180

acctggggga cctactccac ctgggggagc tattccacct gggcatcctc ttttctctgt    240

cgctggctgt gtttctcagg tatacttcaa gaacagcacc tctgtgggtc tcaggaaagt    300

aaactgcctc ttagatcgtc atgcctgt gctaag                                334

<210>5

<211>316

<212>DNA

<213>猪(sus)

<400>5

cagaaagaac atccaggacc aataatattg atttggtttg gcttgtttgc ttttaaaggc     60

tgtgtttaaa gacttgccaa ttgctgaatt ctgaatatca aatcggcatg ttagtgtcca    120

aaaactcctc tggggagcta ttccacccgg gggagctact ctacctagaa gagctactct    180

acctggggga cctattccgc ctgggcatcc tcttttctct gtcgctggct gtgtttctca    240

ggtatacttc aagaacagca cctctgtggg tctcaggaaa gtaaactgcc tcttagatcg    300

tcatgcctgt gctaag                                                    316

Claims (7)

1.猪肌内脂肪沉积的主效基因，它由A、B、C三个等位基因组成，其中，等位基因A的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，等位基因B的碱基序列如SEQ ID NO：4所示，等位基因C的碱基序列如SEQ ID NO：5所示。

2.根据权利要求1所述的等位基因A的分子标记，它包括如下7种形式：

(1)、166位为G；

(2)、168、169位为GG；

(3)、172位为C；

(4)、176位多一个A；

(5)、180位为C；

(6)、191位为G；

(7)、调控序列S1和S2均表达，S1的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，S2的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；且

以上7种情况均连锁。

3.根据权利要求1所述的等位基因B的分子标记，它包括如下7种形式：

(1)、166位为A；

(2)、168、169位为AA；

(3)、172位为G；

(4)、176位少一个A；

(5)、180位为T；

(6)、191位为C；

(7)、调控序列S1缺失，S2表达，S1的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，S2的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；且

以上7种情况均连锁。

4.根据权利要求1所述的等位基因C的分子标记，它包括如下2种形式：

(1)、215位的C替换T；

(2)、调控序列S1和S2均缺失，S1的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，S2的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；且

以上2种情况连锁。

5.根据权利要求1所述的主效基因在猪的育种、制备与其肌内脂肪沉积的基因诊断相关的产品中的应用。

6.根据权利要求2-4之任一所述的分子标记在猪的育种、制备与其肌内脂肪沉积的基因诊断相关的产品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述猪为荣昌猪。

Images