CN101139389A

CN101139389A - 一种猪脂肪沉积相关蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101139389A
Application number: CNA2007101201991A
Authority: CN
Inventors: 李奎; 莫德林; 朱正茂; 唐中林; 李新云; 王恒; 杨述林
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2007-08-13
Filing date: 2007-08-13
Publication date: 2008-03-12
Anticipated expiration: 2027-08-13
Also published as: CN100591692C

Abstract

本发明公开了一种猪脂肪沉积相关蛋白及其编码基因与应用。该猪脂肪沉积相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中序列1；2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与猪脂肪沉积相关的蛋白质。本发明的猪脂肪沉积相关蛋白及其编码基因可用于检测猪的板油率、内脂率、6－7肋间背膘厚以及平均背膘厚等反映脂肪沉积能力的胴体性状，从而为猪的分子育种提供了一个新的遗传标记，并将在猪的育种中发挥重要作用。

Description

一种猪脂肪沉积相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种猪脂肪沉积相关蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种猪脂肪沉积相关蛋白及其编码基因以及利用该蛋白编码基因的单核苷酸多态性来检测猪脂肪沉积性能的方法。

背景技术

现代育种技术使猪的生产性能得到显著提高，然而随着人们生活水平的不断提高，猪肉消费已从以往的脂肪型转变为现在的瘦肉型。与之相适应的，规模化商品猪的生产也发生了从数量型到质量型的改变。在当今的猪肉市场，热胴体重和瘦肉产量决定猪胴体的商业价值。世界养猪发达国家的分级标准也是根据胴体瘦肉率(lean percentage in the carcass，CLP)的不同将猪胴体划分为不同的等级。因此提高瘦肉率减少脂肪含量一直是商品猪生产者、肉品经营者、育种学家们孜孜不倦的追求目标。

在实际工作中，人们试图寻找一种简便的活体评定胴体品质的方法，以减少屠宰带来的经济损失，因此大量研究致力于寻找胴体组成的最佳预测指标。活体性状与胴体瘦肉率的遗传相关分析结果表明，背膘厚与胴体瘦肉率存在极强的负相关(r_A＝-0.5～-0.7)，且活体背膘厚有较高的遗传力(h²＝0.4～0.6)(彭中镇等：《猪的遗传改良》，北京，农业出版社，1991)。而目前DNA分子标记技术的发展和应用，为胴体瘦肉率的直接选择以及胴体品质的快速评定开辟了新途径。

目前已研究的与猪的脂肪沉积或是与背膘厚相关的基因有：(1)Yu等(Yu T P，Tuggle C K，Schmitz C B，Rothschild M F.Association of PIT1 polymorphismswith growth and carcass traits in pigs.J Anim Sci，1995，73：1282-1288.)在一个含中国与美国猪品种“血液”的资源家系中检测到垂体转录因子(Pituitantranscription factor 1，PIT1)与平均背膘厚存在显著相关。(2)激素敏感脂酶(Hormone Lipase，HSL)，作为脂肪降解的限速酶，在脂肪动员过程中负责甘油三脂向甘油二脂的转换。随着它的活性增高，甘油三脂的分解速度增快，脂肪的沉积减少，从而降低胴体的脂肪含量。因此可把它作为标记基因对脂肪含量进行选择。现在已将HSL基因定位在猪6号染色体上6p1.1-1.2上。(3)Jeon等(Jeon J T，Carlborg O，Tornsten A，Giuffra E，Amarger V，Chardon P，Andersson-EklundL，Andersson K，HanssonI，Lundstrom K，Andersson L.A paternally expressedQTL affecting skeletal and muscle mass in pigs maps to the IGF2 locus.NatureGenetics，1992，21：157-158.)用建立的两个家系将类胰岛素生长因子2(Insulinlike growth factor II，IGF-II)定位于猪2号染色体上，并检测到该基因与背膘厚有显著相关。(4)黑素皮质激素受体4(Melanocortin-4 receptor，MC4R)，Kim及其同事将该基因定位于猪1号染色体上(Kim K S，Larsen N J，Rothschild M F.Linkage and physical mapping of the porcine melanocortin-4 receptor(MC4R)gene.J Anim Sci，2000a，78：791-792.)，并在5个猪商品系中检测到MC4R基因遗传变异与背膘厚显著相关(Kim K S，Larsen N，Short T，Plastow G，RothschildM F.A missense variant of the porcine melanocortin-4 receptor(MC4R)geneis association with fatness，growth，and feed intake traits.Mamm Genome，2000b，11：13-135.)。(5)正在研究的与猪生长和胴体性状相关的候选基因还包括：与生长、胴体性状可能有关的瘦素基因(Leptin，LEP)即肥胖基因和生肌因子3(myf3)，与背膘厚有显著相关的组织蛋白酶B(Cathepsin B，CTSB)基因等(RussoV，Fontanesi L，Davoli R，Nanni C L，Cagnazzo M，Buttazzoni L，Virgili R，Yerle M.Investigation of candidate genes for meat quality in dry-curedham production：the porcine cathepsin B(CTSB)and cystatin B(CSTB)genes.Anim Genet，2002，33：123-131.)。(6)Dirk J.de Koning及其同事通过分布于猪18条常染色体及X染色体的共计127个微卫星标记进行全基因组扫描时发现，猪1、2、6、7号染色体上存在影响背膘厚等胴体性状的QTL(Dirk J.de Koning，Luc L.G.Janss，Annemieke P.Rattink，Pieter A.M.van Oers et al.，1999，Detection of quantitative trait loci for backfat thinkness and intramuscularfat content in pigs(sus scrofa).Genetics，152：1679-1690)。另外Andersson等人的研究表明，在4号染色体上也存在影响脂肪沉积的QTL(Andersson L.，C.S.Haley，H.Ellegren，S.A.Knott，M.Johansson et al.，1994，Genetic mappingof quantitative trait loci for growth and fatness in pigs.Science 263：1771-1774)。

尽管影响猪脂肪沉积性能的侯选基因的研究取得了一些重要进展，但仍然存在不足：

(1)猪的重要经济性状通常是数量性状，涉及到的生理生化过程相当复杂，即使同一个数量性状，尽管已揭示其1-2个受控基因，但仍有其它具有大效应的新基因有待发现。(2)利用标记进行全基因组扫描也只能反映部分影响性状的基因的区域分布情况，并不能找出影响某一数量性状的所有QTLs，并且目前还没有达到利用QTL进行位置克隆，以获得目的基因的要求。(3)目前有关数量性状基因的研究，基本上是选用单一候选基因进行分析，忽略了基因间的相互作用。现代分子育种的内容之一是基因组育种，即根据个体所有性状的基因和基因型的组织结构及功能效应进行整体或全基因组选择、选配、保种和杂种优势分析利用等，其基础是有完整的高密度的基因图，并充分了解所有基因的组织结构、功能、表达调控机理以及与性状的关联，然而目前在猪中已经遗传定位和物理定位的基因和标记仍十分有限，这方面的工作还需要进一步的加强。(4)寻找具有重要生理功能基因的方法不够全面，检测基因的数量有限，效率不高，需要创新，进一步寻找与猪重要经济性状相关新基因的工作迫在眉睫。

等位基因与性状间的关联可以找出许多与该性状具有关联的分子标记，从而为标记辅助选择(MAS)乃至分子育种提供理论依据。因此当前各国动物育种学家包括人类疾病研究者都渴望通过这种简短而有效的方法找到“放之世界而皆准”的分子遗传标记。加之猪的胴体性状除背膘厚能够直接在活体上测量外，其它指标如：屠宰率、腿臀肉骨率、内脂率、眼肌面积等均需要在屠宰后测定，从而延迟了选育进展。而分子遗传标记则可能克服这一缺点而较早地对种猪进行选择，因此合适的遗传标记对于开展标记辅助选择，加快遗传进展，并最终实现分子育种是极其重要的。另外，研究突变位点在群体中的多态性，并进行性状关联分析是研究基因功能的一个强有力的手段。在群体中通过性状关联分析寻找与猪重要经济性状相关的基因，进行分子育种始终是育种工作者的一项重要而艰巨的任务。

人的PNAS-4基因位于人的1号染色体1q44，基因组全长56,098bp，编码着一个含194个氨基酸的蛋白，属于UPF0326蛋白家族。经过BlastP(NCBI ConservedDomain Search)分析表明该蛋白质序列存在一个真核生物都具有的未知功能结构域DUF862。在GenBank中大多以apoptosis-related来描述该基因(GenBank收录号：AF229834)，并且在一些文献中也提及该基因可能与细胞凋亡或疾病有关。例如，为了检测当人体长期暴露于苯酚环境中其外周血单核细胞中基因的表达情况时，Forrest及其同事通过基因芯片及real-time PCR方法研究发现，PNAS-4基因呈上调表达(Forrest M S等，Discovery of novel biomarkers by microarray analysisof peripheral blood mononuclear cell gene expression in benzene-exposedworkers.Environ Health Perspect，2005，113：801-807.)。同年，Cobbe等在研究人类疾病发生过程中基因的表达情况时，通过Microarray技术对T淋巴细胞及白细胞进行基因组扫描并发现，T淋巴细胞中的CGI-146百分含量要比总的白细胞要高(Cobb J P等，Application of genome-wide expression analysis to human healthand disease.Proc Natl Acad Sci U S A 2005，102：4801-4806.)，且与PNAS-1(apoptosis-related)基因相似。另外有研究者发现PNAS-4是抑癌基因p53的一个靶基因，并且相关系数高达0.85(Daniel S.B.，2006，Modelling the p53Gene Regulatory Network，Ph.D.Dissertation，University of London)。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪脂肪沉积相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的猪脂肪沉积相关蛋白，名称为CGI-146，来源于猪，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有抗病相关功能的由(a)衍生的蛋白质。

为了使(a)中的CGI-146分泌到细胞周质或培养基中或使其功能稳定，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端连接上信号肽序列，为了(a)中的CGI-146便于纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
标签	残基	序列	Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH	Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH	FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagII	8	WSHPQFEK	FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tagII	8	WSHPQFEK	c-myc	11	EQKLISEEDL

上述(b)中的CGI-146可人工合成，也可先合成其编码基因，再按照下述方法进行生物表达得到。上述(b)中的CGI-146的编码基因可通过将序列表中序列2或序列3的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端连上信号肽的编码序列，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

其中，序列表中的序列1由194个氨基酸残基组成。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述猪脂肪沉积相关蛋白的编码基因(猪PNAS-4)也属于本发明的保护范围。

上述猪脂肪沉积相关蛋白的编码基因包括猪脂肪沉积相关蛋白的cDNA基因和猪脂肪沉积相关蛋白的基因组基因的第二个内含子序列。其基因组基因的第二个内含子序列具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中序列3的自5′端的第74-3097位核苷酸；

2)在高严谨条件下可与序列表中的序列3第74-3097位核苷酸限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

猪脂肪沉积相关蛋白的基因组基因的第二个外显子具有下述核苷酸序列之一：

1)自序列表中的序列3的5′端的第1-73位核苷酸；

2)在高严谨条件下可与序列表中的序列3第1-73位核苷酸限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

猪脂肪沉积相关蛋白的基因组基因的第三个外显子具有下述核苷酸序列之一：

1)自序列表中的序列3的5′端的第3098-3191位核苷酸；

2)在高严谨条件下可与序列表中的序列3的5′端的第3098-3191位核苷酸限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

序列表中的序列3由3191个脱氧核苷酸组成，其中，自序列表中序列3的5′端第1407位为多态位点，序列表中序列3的5′端第1407位为T或C。

其cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中序列2的多核苷酸；

2)编码序列表中序列1蛋白质序列的DNA；

3)在高严谨条件下可与序列表中序列2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。

序列表中的序列2由4059个脱氧核苷酸组成，自5’端第1-168位核苷酸序列为5’非翻译区(UTR)，自5’端第754-4059位核苷酸序列为3’UTR，自5’端第821-826bp以及第2307-2312bp处的核苷酸序列为AATAAA加尾信号，自5’端第4038-4059bp处的核苷酸序列为PolyA尾巴。自序列表中序列2的第1812位核苷酸为多态性位点，为A或C。

含有上述的猪脂肪沉积相关蛋白编码基因的重组载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明的第二个目的是提供一种检测猪脂肪沉积性状的方法。

本发明所提供的一种检测猪脂肪沉积性状的方法，是检测自序列表中序列3的5′端第1407位核苷酸或自序列表中序列4的5′端第212位核苷酸为C还是T，或者检测自序列表中序列2的5′端第1812位核苷酸或自序列表中序列5的5′端第181位核苷酸为C还是A，确定猪的基因型，然后通过基因型确定脂肪沉积性状。

如果自序列表中序列3的5′端第1407位核苷酸或自序列表中序列4的5′端第212位核苷酸为C时，其纯合体的基因型为BB；自序列表中序列3的5′端第1407位核苷酸或自序列表中序列4的5′端第212位核苷酸为T时，其纯合体的基因型为AA；它们的杂合体基因型为AB；如果自序列表中序列2的5′端第1812位核苷酸或自序列表中序列5的5′端第181位核苷酸为C时，其纯合体的基因型为BB；自序列表中序列2的5′端第1812位核苷酸或自序列表中序列5的5′端第181位核苷酸为A时，其纯合体的基因型为AA；它们的杂合体基因型为AB。

所述方法中，所述检测自序列表中序列3的5′端第1407位核苷酸或自序列表中序列4的5′端第212位核苷酸为C还是T的方法包括先PCR扩增含有自序列表中序列3的5′端第1407位核苷酸的基因组片段，然后对扩增产物进行测序或者用Sty I酶切扩增产物；所述检测自序列表中序列2的5′端第1812位核苷酸或自序列表中序列5的5′端第181位核苷酸为C还是A的方法包括先PCR扩增含有自序列表中序列5的5′端第181位核苷酸的基因组片段，然后对扩增产物进行测序或者用MspI酶切扩增产物。

所述含有自序列表中序列3的5′端第1407位核苷酸(T/C)的基因组片段PCR扩增产物可为自序列表中序列4所述762bp的核苷酸片段；StyI酶切所述762bpPCR扩增产物，若得到762bp一个片段，其基因型为AA纯合体；当若得到550bp及212bp两个片段，其基因型为BB纯合体；若得到550bp、212bp和762 bp三个片段，其基因型为AB杂合体。

所述含有自序列表中序列5的5′端第181位核苷酸(A/C)的基因组片段PCR扩增产物可为自序列表中序列5所述789bp的核苷酸片段；MspI酶切所述789bp PCR扩增产物，若得到789bp单一片段，其基因型为AA纯合体；若得到789bp，608bp及181bp三个酶切片段时，其基因型为AB杂合体；若得到608bp及181bp两个片段时，基因型为BB纯合体。

通过对通城群体(通城地方纯种猪、大长通、长大通)各基因型群体的脂肪沉积性能进行评估：结果表明基因型为BB的群体的板油率和内脂率与基因型为AB或AA的个体间存在显著性差异(P＜0.05)，个体脂肪沉积能力要高于后两者。另外基因型为BB的个体，其6-7肋间背膘厚也显著大于基因型为AB的个体(P＜0.05)。

通过对不同基因型的纯种大白猪的脂肪沉积性能进行评估时，基因型为AA的个体平均背膘厚与基因型为AB的个体存在显著(P＜0.05)甚至是极显著差异(P＜0.01)。

综上所述，本发明的猪脂肪沉积相关蛋白及其编码基因可用于检测猪的板油率、内脂率、6-7肋间背膘厚以及平均背膘厚等反映脂肪沉积能力的胴体性状，从而为猪的分子育种提供了一个新的遗传标记，并将在猪的育种中发挥重要作用。

附图说明

图1为本发明猪脂肪沉积相关基因(猪PNAS-4基因)制备及其定位和多态性分析的流程图

图2为本发明中猪脂肪沉积相关基因(猪PNAS-4基因)cDNA序列和氨基酸序列

图3为本发明中猪脂肪沉积相关基因(猪PNAS-4基因)部分DNA序列，图中分别用大写字母和小写字母表述外显子和内含子区域，StyI-RFLP检测所用引物用方框表注。

图4为本发明中猪PNAS-4基因第2内含子StyI-RFLP的三种基因型(AA，AB，BB)电泳结果。

图5为本发明中猪PNAS-4基因3’UTR的MspI-RFLP的三种基因型(AA，AB，BB)电泳结果。M：DNA分子量标准(100-3000bp ladder)

具体实施方式

下述实施例中提到的实验方法，如无特别说明均为常规方法。

本发明的猪脂肪沉积相关基因(猪PNAS-4基因)制备及其定位和多态性分析的流程图如图1所示，具体方法如下述实施例所述。

实施例1、猪脂肪沉积相关蛋白(CGI-146)及其全长cDNA基因和基因组基因(猪PNAS-4基因)的获得

1、猪脂肪沉积相关蛋白全长cDNA基因的获取

提取大白猪55天胚胎骨骼肌总RNA，经过mRNA的纯化、cDNA合成、蛋白酶K和SfiI消化以及cDNA分级分离后，将获得的cDNA与pBluescript II SK+载体连接，从而构建猪胎儿骨骼肌cDNA文库(朱正茂，博士论文，华中农业大学，2003)。随机挑取克隆子进行商业测序，将测序所获得的结果经美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)非冗余数据库(nr)检索并获得相应的序列生物信息。而其中有一个克隆子序列所对应的基因便是猪PNAS-4基因，该序列具有序列表中SEQ ID No.2的部分核苷酸序列。并以该序列及人的同源基因PNAS-4的cDNA(GenBank收录号：NM_016076)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为80％以上的ESTs(片段长度大于100bp)，将这些ESTs的收录号在NCBI中用ENTREZ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.html)查询相应序列，然后用软件DNAStar中的Seqman程序构建猪的EST重叠群，从而获得除5’UTR外cDNA序列。

以猪EST拼接序列为模板设计5’RACE的巢式引物，拼接猪PNAS-4基因全长cDNA序列，具体方法如下所述：

1)第一链cDNA的合成：利用TRIzoL试剂盒(美国Invitrogen公司)从成年香猪骨骼肌组织中提取总RNA，具体操作依照试剂盒说明书进行。总RNA溶于RACE试剂盒提供的超纯水，用NanoDrop ND-1000极微量核酸蛋白质浓度测定仪测定其浓度值，并通过1.2％的甲醛凝胶电泳检测其完整性。然后以检验合格的总RNA为模板，合成cDNA第一链，具体步骤为：反应总体积为50μL，首先将10ul(2μg)总RNA与5μL oligo d(T)₁₁(1μmol/L)混合于Ependorff管中，70℃温育5min以解除RNA的二级结构，立即置于冰上冷却以避免二级结构的重新生成，经短暂离心后，加入20μL DEPC H₂O，10μL 5×PCR buffer，500μmol/L dNTP，40U RNAsin，300UM-MLV，于37℃温育1h后将温度升至95℃灭活反转录酶，置于-20℃保存备用。

2)5’RACE扩增及猪PNAS-4基因全长cDNA序列的拼接：

以上述获得的第一链cDNA为模板，以猪EST拼接序列为模板设计5’RACE的巢式引物P4-5：5′GGAAGGGTATGCAGGAGCTGAAGTAGGC 3′和P4-5N：5′AGGTGTACTCGTTCATCCAG 3′为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系为：反应总体积为20μL，dd H₂O 13.2μL，10×PCR buffer 2μL 10×，MgCl₂ 1.5mmol/L，引物10μmol/L，dNTP 10mmol/L，TaqDNA聚合酶0.2μL(1U)，cDNA 1μL(200ng)。PCR扩增程序是94℃3min，94℃30s，58℃退火45s，72℃1min，循环35次，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明为PCR产物非特异的PCR产物。将PCR产物凝胶回收纯化后克隆测序，测序结果显示5’RACE产物长度为255bp。将上述所获得的EST重叠群以及此RACE扩增产物序列用DNAStar中的Seqman程序进行拼接，得到一条长度为4059bp的cDNA整合序列，即序列表中序列2的核苷酸序列，该序列即为本发明猪脂肪沉积相关蛋白全长cDNA基因序列。

为了验证拼接得到的cDNA为猪PNAS-4基因全长cDNA序列，设计一对引物P4L₂：5′CTCCAAAGTCACACGCTCAGAAC 3′和P4R₂：5′ATAGTCCTACCCCACGAAGAAGC 3′以上述获得的骨骼肌组织提取总RNA反转录合成的cDNA为模板，进行PCR扩增、测序验证。PCR反应体系为：反应总体积为20μL，dd H₂O 13.2μL，10×PCR buffer 2μL10×，MgCl₂ 1.5mmol/L，引物10μmol/L，dNTP 10mmol/L，TaqDNA聚合酶0.2μL(1U)，第一链cDNA 1μL(200ng)。PCR扩增程序是94℃3min，94℃30s，62℃退火45s，72℃1min，循环35次，最后72℃延伸5min。扩增产物进行琼脂糖电泳分离，然后按照下述方法进行PCR扩增产物的纯化、克隆和测序，结果获得了863bp的片段，具有序列表中序列2自5′端第758-1620位核苷酸。将这段cDNA猪脂肪沉积相关基因序列在GenBank中与人PNAS-4基因进行同源性检测，结果同源性达93％，从而证实了通过上述实验已获得猪PNAS-4基因的cDNA全长序列(图2，图2中起始密码子和终止密码予用下划线标注，加尾信号用双下划线标注，推导的氨基酸用单字母符号写在密码子的下面，MspI-RFLP检测所用引物用方框标注)。

获得猪PNAS-4基因的cDNA全长序列之后，利用开放阅读框查找工具ORF Finder(http://www.ncbi.nih.gov/gorf/gorf.html)寻找该基因的开放阅读框，表明该猪的PNAS-4基因的cDNA全长序列的开放阅读框为自序列表中序列2的5′端第169-753位核苷酸，编码序列表中序列1的氨基酸残基序列(猪脂肪相关蛋白(CGI-146)序列)，自5’端第1-168位核苷酸序列为5’非翻译区(UTR)，自5’端第754-4059位核苷酸序列为3’UTR，自5’端第821-826bp以及第2307-2312bp处的核苷酸序列为AATAAA加尾信号，自5’端第4038-4059bp处的核苷酸序列为PolyA尾巴。自序列表中序列2的第1812位核苷酸为多态性位点，为A或C。

2、猪PNAS-4基因部分基因组序列的获得

与猪PNAS-4基因同源的人C1orf21基因组DNA(GenBank收录号：NC_000001)长约55.96kb，拥有5个外显子，4个内含子，其中第二内含子长约2.58kb。将猪的该基因cDNA全长序列与其进行比对，发现猪的该基因也具有5个外显子，于是根据序列表中SEQ ID NO：2的cDNA序列设计引物P4L₃/P4R₃，并分别位于该基因的第二外显子和第三外显子，其引物序列如下：

P4L₃ 5′-TGAACGAGTACACCTCATCCATC-3′(如序列表中序列12所示)

P4R₃ 5′-TCTCCTAGTTCAGAAGCATTTCCT-3′(如序列表中序列13所示)

然后以中国农业科学院畜牧研究所的五指山猪的基因组DNA为模板，并根据人的该同源基因的第二内含子长度(2.58kb)设计反应程序，进行PCR扩增：反应体系：2.0μL10×Buffer，1.6μLMgCl₂(2.5mmol/L)，1μL Former primer(10μmol/L)，1μL Reverse primer(10μmol/L)，0.4μLdNTPs(10mmol/L)，0.2μL Taqase，1μL DNA模板，ddH₂O定容至20μL。PCR扩增程序：95℃ 3min，30个循环(94℃ 30s，62.5℃ 50s，72℃ 3min)，最后在72℃延伸3min。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

最后得到一条长3169bp的序列，测序表明具有序列表中序列3的核苷酸序列(图3，图中分别用大写字母和小写字母表述外显子和内含子区域，StuI-RFLP检测所用引物用方框表注)，该序列包含本发明猪脂肪沉积相关蛋白CGI-146的编码基因PNAS-4第二内含子序列。序列表中序列3自5′端的第1-73位核苷酸为该基因组基因的第二个外显子，自5′端的第3098-3191位核苷酸为该基因组基因的第三个外显子，自5′端的第74-3097位核苷酸为该基因组基因的第二个内含子。

其中，自序列表中序列3的5′端第1407位为多态位点，序列表中序列3的5′端第1407位为T或C。

实施例2、猪PNAS-4基因物理定位：

1、用于物理定位的实验材料的获得

用猪×啮齿类体细胞杂种板(Pig×rodent somatic cell hybrid panel，SCHP)进行染色体区域定位，用美国Minnesota大学共同构建的猪辐射杂种板(INRA-Minnesota porcine radiation hybrid panel，IMpRH)进行染色体精确定位，两套体细胞杂种板的制备方法见参考文献(Yerle等，A somatic cell hybridpanel for pig regional gene mapping characterized by molecular cytogenetics.Cytogenet Cell Genet.1996，73：194-202；Yerle等，Construction of awhole-genome radiation hybrid panel for high-resolution gene mapping in pigs.Cytogenet Cell Genet.1998.82：182-188)。

其中SCHP包括27个体细胞杂种细胞系，1-19号是猪×仓鼠体细胞杂种细胞系，20-27号是猪×小鼠体细胞杂种细胞系，并以仓鼠、小鼠和猪基因组DNA作为阳性对照(Yerle等，A somatic cell hybrid panel for pig regional gene mappingcharacterized by molecular cytogenetics.Cytogenet Cell Genet.1996，73：194-202)。经细胞遗传学鉴定该杂种板保留了猪的除Y染色体外的全部18条常染色体以及X染色体，其中含有127个非重叠的染色体区域，各细胞系中所包含的猪染色体及染色体片段信息可从Web(http://www.toulouse.inra.fr/lgc/lgc.html/)获得。

IMpRH使用的辐射剂量是7,000-rad。IMpRH包括118个猪×仓鼠辐射杂种细胞系，以及仓鼠和猪基因组DNA阳性对照，用757个标记的鉴定结果表明IMpRH中的平均标记存留率为29：3％，包含有128个连锁群，覆盖了18对常染色体及X染色体，用于估计标记间距离的kb/cR比值是～70kb/cR(1Ray＝100cR)，理论分辨率是145kb。

2、猪PNAS-4基因的定位效果

分别以SCHP和IMpRH克隆板中的DNA为模板，进行PCR扩增反应，引物为P4L15′-TGGCAGAGCGGTCGTCACTTAGGC-3′(序列表序列6)P4R₁ 5′-GAGCAGAATCTCCTCCCACGCACCAT-3′(序列表序列7)，进行扩增的PCR反应总体积为15μL，其中模板DNA为20ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/L MgCl₂，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为10μmol/L，1U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是：94℃ 3min，循环35次94℃30s，61℃30s，然后72℃30s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

用PNAS-4定位引物在SCHP中分型结果表明，19个猪×中国仓鼠体细胞杂种细胞系(1-19号)中，1，3，7，8，10，11，18，19出现与猪基因组DNA阳性对照扩增一致的817bp的目的片段，而在8个猪×小鼠体细胞杂种细胞系(20-27号)中，20和21号杂种细胞系也扩增得到817bp的目的片段。将上述实际观测的PCR分型数据提交给HybWeb(http://www.toulouse.inra.fr/lgc/pig/pcr/pcr.htm)进行统计分析以获得区域定位信息，数据分析结果是PNAS-4基因定位于猪10号染色体上(P＝1.0)，进一步的区域定位结果为SSC10 p11-16(P＝0.9998，与该区域标记间的相关系数为0.8575，P＜0.1％)。

用PNAS-4定位引物在IMpRH的分型结果是0000010000 0110000100 00000001010000000001 0000000000 1000101010 1000000010 0000000000 00000000110000001110 0011001110 00010111(其中0和1分别表述扩增结果为阴性和阳性)。统计分析结果，PNAS-4基因与猪10号染色体上的SW497标记紧密连锁，LOD值为13.69，RH图距是0.28Ray。进一步证实该基因位于猪10号染色体上。

实施例3、猪PNAS-4的部分DNA序列的单核苷酸多态性和RFLP多态性检测

1.猪PNAS-4的部分DNA序列的单核苷酸多态性检测

1)猪PNAS-4基因的单核苷酸多态性分布

为了更准备地反映猪PNAS-4基因的单核苷酸多态性，在本实验中选用相距20kb的两个突变位点进行检测。

用于基因多态性检测的DNA样品来自7个猪群，见表2。采用常规方法提取其基因组DNA后于-20℃保存备用。

表2、SNPs检测的群体和样品数

品种组合	样品数	类型	产品出售单位
品种组合	样品数	类型	产品出售单位	五指山猪Wuzhishan	43	近交系小型猪	中国农业科学院畜牧研究所
香猪Xiang	42	近交系小型猪	贵州市畜禽良种场	五指山猪Wuzhishan	43	近交系小型猪	中国农业科学院畜牧研究所
香猪Xiang	42	近交系小型猪	贵州市畜禽良种场	巴马香猪Bamaxiangpig	45	近交系小型猪	广西大学巴马香猪近交繁育中心
大长通LW×(LD×T)	35	三元杂种	湖北通城县畜牧局	巴马香猪Bamaxiangpig	45	近交系小型猪	广西大学巴马香猪近交繁育中心
大长通LW×(LD×T)	35	三元杂种	湖北通城县畜牧局	长大通LD×(LW×T)	44	三元杂种	湖北通城县畜牧局
通城猪Tongcheng	44	地方纯种	湖北通城县畜牧局	长大通LD×(LW×T)	44	三元杂种	湖北通城县畜牧局
通城猪Tongcheng	44	地方纯种	湖北通城县畜牧局	大白猪(荷兰)Large White(Netherlands)	201	大白纯种	荷兰动物科学与卫生研究所

注：LD＝Landrace，LW＝Larege White，T＝Tongcheng

以表2所述材料的基因组为模板，利用下述引物扩增猪PNAS-4基因部分序列，测序检测猪PNAS-4基因的单核苷酸多态性。

①StyI-RFLP引物的DNA序列(图3，StyI-RFLP检测所用引物用方框表注)：

P4L4：5′-CTAGAACCACTCAAACCAAGCAGC-3′(序列表中序列8)

P4R5：5′-ATCAGGCAGGTAAAAGGATAACGG-3′(序列表中序列9)

该引物扩增片段长度均为762bp，位于第二内含子中，即序列表中序列3中自序列的5’端第1196-1957bp处的核苷酸片段，也即序列表中的序列4。

序列分析结果表明在这762bp的DNA片段中，在序列表中的序列4中的5’端第212位核苷酸(序列表中序列3的第1407位核苷酸)处存在T-C的突变。当序列表中的序列4中的5’端第212位核苷酸为T时，该基因假定为由A等位基因控制，当序列表中的序列4中的5’端第212位核苷酸为C时，该基因假定为由B等位基因控制，这两个等位基因可组成三种基因型：纯和体AA、AB，杂和体BB。

当序列表中的序列4中的5’端第212位核苷酸处为C时，存在1个StyI酶切位点(C↓CWWGG)，因此将上述扩增片段用StyI酶切鉴定其基因型。当基因型为AA时，扩增片段经StyI酶切后只有762bp一个片段；当基因型为BB时，扩增片段经StyI酶切后为550bp、212bp两个片段；当基因型为AB时，扩增片段经StyI酶切后为550bp、212bp、762bp三个片段；三种基因型的酶切鉴定凝胶电泳图如图4所示，图4中M：DNA分子量标准(100-1500bp ladder)。

②MspI-RFLP引物的DNA序列(图2，图2中MspI-RFLP检测所用引物用方框标注)：

P4L5：5′-GCCTTCTGAGTAGCAGTATGAGTTG-3′(序列表中序列10)

P4R5 5′-CCTGCGAGAACTGAGAATAATCC-3′(序列表中序列11)

该引物扩增片段长度789bp，位于猪PNAS-4基因的3’UTR(3’非翻译区)，即序列表中的序列2中自序列的5’端第1632-2420bp处的核苷酸片段，也即序列表中的序列5。

序列分析结果表明在这789bp的DNA片段中，在序列表序列5的自5’端第181位(自序列表中序列2的第1812位核苷酸)处存在A-C的突变。当序列表中的序列5中的自5’端第181位核苷酸为A时，该基因假定为由A等位基因控制，当序列表中的序列5中的自5’端第181位核苷酸为C时，该基因假定为由B等位基因控制，这两个等位基因可组成三种基因型：纯和体AA、AB，杂和体BB。

即当序列表中的序列5中的5’端第181位核苷酸为C时，存在1个MspI酶切位点(C↓CGG)，因此将上述扩增片段用MspI酶切鉴定其基因型。当基因型为AA时，扩增片段经MspI酶切后只有789bp一个片段；当基因型为BB时，扩增片段经MspI酶切后为608bp、181bp两个片段；当基因型为AB时，扩增片段经MspI酶切后为789bp、608bp、181bp bp三个片段；三种基因型的酶切鉴定凝胶电泳图如图5所示图5中M：DNA分子量标准(100-3000bp ladder)。

其中，上述两种PCR扩增的PCR反应总体积20μL，其中猪基因组DNA约100ng，含1×buffer(Promega)，1∶5mmol/L MgCl₂，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0∶2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是：94℃4min，循环5次94℃ 45s，62℃ 45s，72℃ 1min，然后再循环30次94℃ 45s，57℃ 45s，72℃ 1min，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。

上述两种PCR产物酶切反应体积是15μL，其中1×buffer 1.5μL，PCR产物3-5μL，限制性内切酶为0.5μL(5U)，用H₂O补足15μL，将样品混匀后离心，37℃水浴4h，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。

在分析的7个猪群中，利用两对引物针对不同突变位点(自序列表中序列3的第1407位核苷酸和自序列表中序列2的第1812位核苷酸)，通过上述PCR-RFLP检测，这两个突变位点的基因型及等位基因频率统计结果如表3所示。结果表明，对于这两个突变位点，在所检测的7个猪品种中，中国地方猪群(五指山猪、贵州香猪、巴马香猪、通城猪)都是B等位基因占优势，而国外猪群(大白猪)或混有国外猪血液杂种猪群(长大通、大长通)均是A等位基因占优势。另外值得注意的是，StyI-RFLP突变位点(自序列表中序列3的第1407位核苷酸)与MspI-RFLP突变位点(自序列表中序列2的第1812位核苷酸)的基因型在通城纯种猪、大长通、长大通以及荷兰纯种大白猪群中存在连锁关系。

表3、StyI(MspI)-RFLP多态性在7个猪群中的分布

品种组合	数量	突变位点T/C212(StyI)					突变位点A/C181(MspI)
		突变位点T/C212(StyI)					突变位点A/C181(MspI)					基因型			基区频率		基因型			基因频率
		AA	AB	BB	A	B	AA	AB	BB	A	B	基因型			基区频率		基因型			基因频率
		AA	AB	BB	A	B	AA	AB	BB	A	B	五指山猪Wuzhishan	43	0	0	43	0	1	7	18	18	0.372	0.628
贵州香猪Xiang	42	0	21	21	0.25	0.75	8	13	21	0.345	0.655	五指山猪Wuzhishan	43	0	0	43	0	1	7	18	18	0.372	0.628
贵州香猪Xiang	42	0	21	21	0.25	0.75	8	13	21	0.345	0.655	巴马香猪Bamaxiang	45	0	14	31	0.156	0.844	0	0	45	0	1
长大通LD×(LW×T)	44	16	20	8	0.591	0.409	16	20	8	0.591	0.409	巴马香猪Bamaxiang	45	0	14	31	0.156	0.844	0	0	45	0	1
长大通LD×(LW×T)	44	16	20	8	0.591	0.409	16	20	8	0.591	0.409	大长通LW×(LD×T)	35	21	14	0	0.8	0.2	21	14	0	0.8	0.2
通城猪Tongcheng	44	1	11	32	0.148	0.852	5	11	28	0.239	0.761	大长通LW×(LD×T)	35	21	14	0	0.8	0.2	21	14	0	0.8	0.2
通城猪Tongcheng	44	1	11	32	0.148	0.852	5	11	28	0.239	0.761	大白猪(荷兰)Large White	201	144	54	3	0.851	0.149	144	54	3	0.851	0.149

2)单核苷酸多态性在不同品种中的分布差异的T检验

对猪PNAS-4基因相隔20kb的两个多态位点StyI-RFLP及MspI-RFLP的基因频率在不同品种中的分布差异进行T检验，差异显著性结果见表4。结果表明这两个突变位点(自序列表中序列3的第1407位核苷酸和自序列表中序列2的第1812位核苷酸)各自在所检测的七个猪群之间均存在较大程度的分布差异。

表4、StyI(MspI)-RFLP多态性位点在不同品种中分布的差异性检验结果

品种组合	五指山猪	贵州香猪	巴马香猪	长大通LD×(LW×T)	大长通LW×(LD×T)	通城猪	大白猪
品种组合	五指山猪	贵州香猪	巴马香猪	长大通LD×(LW×T)	大长通LW×(LD×T)	通城猪	大白猪	五指山猪		4.953^**	3.812^**	8.513^**	10.360^* ^*	3.705^**	15.695^**
贵州香猪	0.365		1.553	4.522^**	6.797^**	1.684	11.579^**	五指山猪		4.953^**	3.812^**	8.513^**	10.360^* ^*	3.705^**	15.695^**
贵州香猪	0.365		1.553	4.522^**	6.797^**	1.684	11.579^**	巴马香猪	6.398^**	6.106^**		6.012^**	8.152^**	0.146	13.390^**
长大通LD×(LW×T)	2.888^**	3.227^**	8.668^**		2.807^**	6.091^**	5.625^**	巴马香猪	6.398^**	6.106^**		6.012^**	8.152^**	0.146	13.390^**
长大通LD×(LW×T)	2.888^**	3.227^**	8.668^**		2.807^**	6.091^**	5.625^**	大长通LW×(LD×T)	5.361^**	5.651^**	10.525^**	2.807^**		8.212^**	1.128
通城猪	1.913	1.539	4.93457^**	4.743^**	7.013^**		13.43^**	大长通LW×(LD×T)	5.361^**	5.651^**	10.525^**	2.807^**		8.212^**	1.128
通城猪	1.913	1.539	4.93457^**	4.743^**	7.013^**		13.43^**	大白猪Large White	9.584^**	9.977^**	15.9041^**	5.625^**	1.128	11.931^**

注：肩注*表述P＜0.05；肩注**表述P＜0.01。右上三角为MspI-RFLP(自序列表中序列2的第1812位核苷酸)的基因频率在不同品种中的分布差异的显著性检验结果，左下三角为StyI-RFLP(自序列表中序列3的第1407位核苷酸)在不同品种中的分布差异的显著性检验结果。

实施例3、通城猪群体中标记性状关联分析

用于性状关联分析的通城猪群体材料，包括通城地方纯种猪以及长大通、大长通，合计156个DNA样品。

首先建立如下的分析模型以消除性别、组合及屠宰批次对表型值的影响：

Y_ijk＝μ+BATCH_i+SEX_j+COMBINATION_k+(BS)_ij+(BC)_ik+(SC)_jk+ε_ijk，

其中，Y_ijk是性状观察值，μ为总体均数，BATCH_i为批次效应，SEX_j为性别效应，COMBINATION_k为组合效应，(BS)_ij为批次和性别的互作效应，(BC)_ik为批次和组合的互作效应，(SC)_jk为性别和组合的互作效应，ε_ijk为随机误差，假定服从N(0，σ²)分布。

应用该模型对每个性状进行分析并获得一个新的性状值，即标准化的残差值，然后将所获得残差值作为新的性状值，再建立如下的分析模型：

Y_ij＝μ+GENOTYPE_i+ε_ij

Y_ij是新的性状值，μ是新的性状值的总体均值，GENOTYPE_i为基因型效应，ε_ij为随机误差，假定服从N(0，σ¹)分布。

至此该模型已经消除了性别、组合及屠宰批次的系统误差。应用该模型就可以直接分析基因型的效应，同时进行基因型间的两两比较。

试验猪群基因型与经济性状关联分析是应用SPSS软件中的一般线性模型程序来完成的。利用之前我们获得的MspI-RFLP基因型检测结果，对具有部分经济性状的三个猪群(长大通、大长通和通城猪，共计156头份)进行了基因型与脂肪沉积相关性状(板油率、内脂率、6-7肋间背膘厚)间的关联分析(StyI-RFLP突变位点与MspI-RFLP突变位点基因型在这三个猪群中存在连锁关系，这里选择其中一个突变位点(MspI-RFLP突变位点，即自序列表中序列5的第181位核苷酸)进行分析)。在消除了品种、屠宰批次以及性别之间的差异后，基因型间脂肪沉积相关性状的简单均数和标准差分析结果总结于表5。结果表明，在板油率与内脂率方面，37个基因型为BB(自序列表中序列5的第181位为C的纯和体)的个体分别与67个基因型为AA(自序列表中序列5的第181位核苷酸均为T)的个体、52个基因型为AB(自序列表中序列5第181位核苷酸均为A和C的杂和体)的个体间均存在显著性差异(P＜0.05)，其中AA型与BB型的板油率值存在极显著差异(P＜0.01)。此外，BB与AB基因型的猪，它们的6-7肋间背膘厚之间也存在显著性差异(P＜0.05)。基因型为AA的猪脂肪沉积少，板油率、内脂率、6-7肋间背膘厚等脂肪沉积相关性状均比基因型为BB低很多。

表5、猪的PNAS-4基因MspI-RFLP突变位点基因型与通城群体脂肪沉积相关性状的关联分析

基因型	个体数	板油率	内脂率	6-7肋间背膘厚
基因型	个体数	板油率	内脂率	6-7肋间背膘厚	MspI-RFLP AAABBB	675237	2.794±1.313.259±1.175.261±1.44	5.010±2.295.928±2.6933±2.96	3.257±0.933.199±0.714.262±0.93
P-valueAA-ABAA-BBAB-BB		0.8470.008*0.017	0.8060.0120.028	0.1830.3240.039*	MspI-RFLP AAABBB	675237	2.794±1.313.259±1.175.261±1.44	5.010±2.295.928±2.6933±2.96	3.257±0.933.199±0.714.262±0.93

注：肩注*表述P＜0.05；肩注**表述P＜0.01。

实施例4、大白猪群中标记性状关联分析

用实施例3所述的基因诊断方法检测209头大白猪群(分为M和L两个品系，均购自荷兰动物科学与卫生研究所)，分析了猪PNAS-4在MspI-RFLP突变位点处基因型与断奶重、170日龄体重以及背膘厚之间的关联，其差异显著性结果列于表8。

在本例中，由于L系中只检测出1例BB型的猪，所以在做关联分析时，我们将L系中的BB型忽略不计，只对AA-AB型做了T检验。结果如表6所示，结果表明，AA(自序列表中序列5第181位核苷酸均为A的纯和体)和AB型猪(自序列表中序列5第181位核苷酸均为A和C的杂和体)的背膘厚呈显著差异，与前面得出的结果是一致的。

表6、猪的PNAS-4基因MspI-RFLP基因型与大白猪群体部分性状的关联分析

基因型	断奶重	170日龄体重	平均背膘厚
基因型	断奶重	170日龄体重	平均背膘厚	P-valueAA-AB	0.365	0.201	0.023*
M品系 AA-BBAB-BB	0.3470.496	0.2710.306	0.2910.343	P-valueAA-AB	0.365	0.201	0.023*
M品系 AA-BBAB-BB	0.3470.496	0.2710.306	0.2910.343	L品系 AA-AB	0.356	0.157	0.007**

注：肩注*表述P＜0.05；肩注**述P＜0.01。

序列表

<160>13

<210>1

<211>194

<212>PRT

<213>野猪属猪(Sus scrofa domestica Brisson)

<400>1

Met Gly Ala Asn Gln Leu Val Val Leu Asn Val Tyr Asp Met Tyr Trp

1 5 10 15

Met Asn Glu Tyr Thr Ser Ser Ile Gly Ile Gly Val Phe His Ser Gly

20 25 30

Ile Glu Val Tyr Gly Arg Glu Phe Ala Tyr Gly Gly His Pro Tyr Pro

35 40 45

Phe Ser Gly Ile Phe Glu Ile Ser Pro Gly Asn Ala Ser Glu Leu Gly

50 55 60

Glu Thr Phe Lys Phe Lys Glu Ala Val Val Leu Gly Ser Thr Asp Phe

65 70 75 80

Leu Glu Asp Asp Ile Glu Lys Ile Val Glu Glu Leu Gly Lys Glu Tyr

85 90 95

Lys Gly Asn Ala Tyr His Leu Met His Lys Asn Cys Asn His Phe Ser

100 105 110

Ser Ala Leu Ser Glu Ile Leu Cys Gly Lys Glu Ile Pro Arg Trp Ile

115 120 125

Asn Arg Leu Ala Tyr Phe Ser Ser Cys Ile Pro Phe Leu Gln Ser Cys

130 135 140

Leu Pro Lys Glu Trp Leu Thr Pro Ala Ala Leu Gln Ser Ser Val Ser

145 150 155 160

Gln Glu Leu Gln Asp Glu Leu Glu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Ala Ser

165 170 175

Ala Ser Met Gly Ser Ala Ser Ala Gly Ser Arg Pro Gly Arg His Thr

180 185 190

Lys Leu

<210>2

<211>4059

<212>DNA

<213>野猪属猪(Sus scrofa domestica Brisson)

<220>

<221>misc-feature

<222>(1812)

<223>n＝a或c

<400>2

cccgggagcg gctcggctgc ccgatgcttc cgccccggct gccgcgggcc gggctgtacg 60

cttagtgccc ggctcaggcc ccctgaagcg cccgcggggg tgagagcggc ctccggcccc 120

gcggagacgg agcggcttga ggacgaggcg gcggccgcgg ggaggaggat gggggctaac 180

caattagtgg tgctcaacgt gtacgacatg tactggatga acgagtacac ctcatccatc 240

ggaattggag tttttcattc aggaattgaa gtatatggca gagagtttgc ttatggtggc 300

catccttacc ccttttctgg aatatttgaa atttccccag gaaatgcttc tgaactagga 360

gaaacattta aatttaaaga agctgttgtt ttggggagca ctgacttcct agaagatgat 420

atagaaaaaa ttgtagaaga attgggaaaa gaatacaaag gcaatgccta tcatttgatg 480

cataaaaact gcaatcattt ttcttcggct ttatcagaga ttctttgtgg gaaggagatt 540

cctcgctgga tcaatcgact ggcctacttc agctcctgca tacccttcct ccagagctgc 600

ctcccgaagg agtggctgac tcccgcggcc ctgcagtcca gcgtcagcca ggagctccag 660

gacgaactgg aggaggcaga ggatgcggcg gcctccgcct ccatgggcag cgcttcagca 720

ggctccaggc ctgggcgcca caccaaactc taggggtctc caaagtcaca cgctcagaac 780

tggccctggc agttgactat ccctagagaa aaagtcaaag aataaatgcc ctttggatat 840

tttgtatgca aagatggctc tcccccaaat cccaggtttt cagctcagga ttatatttgt 900

aatcaaaaaa caaaaacaat cacttggcgc aggagggagg actttgtatg aaactgccct 960

ctgttttttt tacccacttg tacacctgga tttcctcctt ctgttttgta caagctctgt 1020

taagttatgt ttacagtatt tcgtatcgct gtttacaaat ctcgcatgga cttcctgcca 1080

ccatgaaaga agaaagcctt cccgtcttca gcagcgaggc caggcctctc tgtgcacttc 1140

cgacagcggc cccagctgcg gcctgagcag taggcccgcg aggaggtgct cacgcactta 1200

gagtcaccac cacctgcctc acggttgtct tttaggcgcg ctggtcttcc ttaacacgtt 1260

ggcaccaggg tgcacagagg tgaaggagca cacgcagccc tgagtccgtg gtccgagtga 1320

gggtggcccc accccaggct gccttcctcc tcgcccaccc ccccaccccg ggcagcacat 1380

ctccggaggt ccccacccag cggttacttt cttcccaaat gtgtgtccac cctctcgagg 1440

tggcacaccc tggtgtctgc caggctttag cgcctctgat gctgtaggta gatgtttttg 1500

gttacagatc ctcttgatag taacggatga tgtttttgca catgggttgg gggggcttcc 1560

tttttatctt aatacgtact gatctccctg cacaggagct tcttcgtggg gtaggactat 1620

cctaagcggt agccttctga gtagcagtat gagttgacat tcaactgctt ttaactattc 1680

aagctacctt ttctactaca ccttgaaaac tagagtcttc aagtaacact ctccagaaag 1740

tcaatacttt gataatgtaa acgttttatg caccatagca gaaagagtat gttggaattg 1800

gttagtttct tncggtagtt tcacctccca atagaaagcc tcgcctcact gacctcttgt 1860

tggaaaatca cacgtacgcg tcttacaggt catcttttcc gttctctcag atgtatgtct 1920

cttacttaac tgactctaag aatgaagctg tcaccacaga tgagtcctca ctagcaggga 1980

gcctgtctgc tcaagtctac tcccagtttg acccttggat gtcagagccc cgtcattaca 2040

tgtcacattc agtgtttctg ccttaagagc gaatgtccta cacagagttt tggatgcagt 2100

gtataaatta tccaaggcag tgacttcagc gttagagata ttgttagctt taaagtcgtc 2160

tacgtttctt taaacgtctt cattgggttg tttgctgctg ttctttgtaa ggacccatat 2220

ccttcagtaa actacatttt ttaacttttc cataagctga ttttgattga tttttatcaa 2280

attaagcaca acctgttcat aggggaaata aactttgggt ttgacctgag gaaaatgaac 2340

ccacttaacc taatttatgc ttttggcggt tttgtttctg gagaggaaag ccttggtgga 2400

ttattctcag ttctcgcagg ggagagtggg ggcaggggac agagcacttg ttttaagaga 2460

tgagagagga aggaatatat catctttacg gcaagttgac ttggttcagg tctaaaaatg 2520

agatttagaa caaaatgcta aaaagactct tgactgactt ggttcactcc aagaagagtc 2580

ttagcaccaa aacccaggtt agtgaaaaaa acgtttgatg aagtttgctt gggttctttt 2640

taaaataatg tggattccag ttttttctaa tccattcaca tgtacatgat tttaaatctg 2700

tgctcctgac gcgcatggca gagcggtcgt cacttaggcg cgtggcgggg gggccccagg 2760

accctcccgc agttctccga gcccagcata caaatgactt tcgtgttact gtgttgtatt 2820

gacgttcatc cgcagcattt agagtttaga aatgacgtta aggaccctgg taaaaagaaa 2880

tagtggccta aggccatgga tcatacagta agataaccat tgttggacat gagattgctc 2940

gcaatcttaa tcccgctcga ggtcgagagc ttaaagtgtc ttttgcttta gaaattcccg 3000

tttaagttag tttgctcatt gcagttcaaa gctgagaagg aattaactaa catttagcca 3060

cctttccctc gcccttagag gaggagaatc tcgctctcag cctgagctct gttaagaaaa 3120

atcctctatc acagatgctg tcattaagat acctgtgaca tgatggcgtc agatgctctc 3180

tttgtggttg taaccaagtg aaacgcgttt ctcatgtggc tgagacagtc ggagagcttt 3240

gagggagtca gaagctcctg gtttctcctc tttgtttttg gggccgttgg gtttgctttt 3300

ggttttgttt tcaaccctaa gaagggggca ccggctttgg aaagcggagc ctgcggagtt 3360

gcaggaggca gcgatgcggt acaggaagcc tccactcgat ccctgaaatc cagccaacgg 3420

ttgctctgac ccacagcaat agcgcaggtt ctcaccacca gcatttgtac agagcaggga 3480

atcctggttt taagccgatg gctagcatgg tgcgtgggag gagattctgc tctatggcag 3540

ctgcaggacc ccacatctac agcctctttc cactgcaaga cggtagaaac acattcactg 3600

cttcagggtt cgaatctgtg tgtcttcttg cggctccatt tctatccagt atgctgtaat 3660

tttgatacat gctgtatttt ctttccgtga ctcagtttaa aaggcttggg ttttttgttc 3720

agcaagctgg ccatcctgcc gctgaatctc cttcccttct gtgaggtttt agagcgcagc 3780

ccagtcatta gactccctct gtctactcag tccacacaca tcttcatcgt ttgcaaggtc 3840

ttacggctgt taaagaatct ttatgaaccc gaagatgatt tctcgtgaag ttgaatgcaa 3900

atgtactgtc attcatagtg tttatattaa aaaaaaaaaa aaataccagg aatcttcact 3960

tttgctacct tgatatagca ttgggctatc atgttaacat tgaaatacat caatttatta 4020

aaaaatactt ttctaagaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 4059

<210>3

<211>3191

<212>DNA

<213>野猪属猪(Sus scrofa domestica Brisson)

<220>

<221>misc-feature

<222>(1407)

<223>n＝t或c

<400>3

tactggatga acgagtacac ctcatccatc ggaattggag tttttcattc aggaattgaa 60

gtatatggca gaggtatgtg tacacacagt ctaaatgcat tttctgaaga tttttctcct 120

ttaaaaagag ttgtaaaatc atgaaaacag ctcttcctct tttttttaat gcactttcat 180

gctttattgt agaaagtaga tgaaaatctc cctgtatttg tttatatttg tatttcagaa 240

aaatgcccta aattaaatgt atttggggag agagtactca gagtacatgg gtatgcattg 300

atttggtttt cttttattct aaatactgtc ttaaaaaata ttttcctttt gagattgtta 360

taccatgacc atttcacttt tatatatatt gaccttccta agaaaccttg aacttcaaaa 420

aatagttccc gttgtggctc agcggaaacg aatctgacta gtatccacga ggacgtgggt 480

tcaatccctg gccttgctca gcgggttaag gatccacatt gccgtgagtt gtggtgtagg 540

tcgcagacgt ggctccgatg ctgtggctgt ggtgtaggcc ggcagctgca gttccaattc 600

cacccctagc ttgggaactt ccatatatca caggttcggc cctaaaaaag caaaaaataa 660

aaaataaaaa aaaagtaaag agttcccgtc atggctcagt ggttaacgaa tccgactagg 720

aaccatgagg ttgcaggttc aatccctggc cttgctcagt gggttaagga tccagcgatg 780

ccatgagctg ttgtgtaggt tgcagacacg gctcagatcc cgagttgctg tgtctctggc 840

ataggcctgt ggctacagct ccaattcgac ccctagcctg ggacctccgt atgctgcagg 900

agcagcccaa gaaatggcaa aaaaaaaaag agagagagaa atagtatgat aaaaacaatg 960

gttttggttg gaaaaggatt aatgctagag tgtcaaactt gtaataccaa tttcctgagg 1020

gaatttcagt aataaatttg tttttgtaga cctataagtg catagggata gttttaaaat 1080

atctctgagc aaatcctgcc tttgatgaca tctagctttt tgctcaggat tgatggccct 1140

tgtcattaac tcagcccttt ttattcttta ttacctttca ctatgataag cataactaga 1200

accactcaaa ccaagcagct gtgtttccac aacttttcct ttgttctcat tctctctcag 1260

tacaagataa tctgatcaag ttgtaggtag taatagtctg tgtaaaacag atgacatggc 1320

tcgtttcatc aaggttgtag taatatactc gtttgcatat aaactaccgt atagcaccaa 1380

tgcttctgtc tgcttcagct gggcagnctt ggtggcctct cagcctatgg cattgcacct 1440

tactcccagt tacccctgag gactacatac cagctttggc tgatacaaag aaaaggttca 1500

tttacttgaa tatgttagtg tggtgttttt ctatcccttt ttttataggc tgaattagct 1560

gcttctgggt gcagtgctgt aaagatctac catgttaagt tctgttgtac ttggaagact 1620

gcatctacca aataatcccc caaagcagtg aagttcccgc agaaagtttc agtggttaga 1680

gtattgatat gggtggcttt gctccctgtt tgacttggct tttgccacag ttggcgtata 1740

cattcctttt tacccgaatt tgtatgttgt gttacagttt ttaaaagtac caccaagttt 1800

tgtacgacat gaccatgccg gtctgaggta gatgggagca tttttcagat gaaactgaag 1860

ctcagacctg ctaaaagtgc tactgcgaat aattaacaga actaggacct gacccctagt 1920

gtcatatact aacccgttat ccttttacct gcctgatcat tgttcccatt cagaaaatga 1980

cttaggaata attagaaata tgtttcagaa cagcaaggcc agggccagat acattcctaa 2040

aagtgaattg tttctagaat agaagggcaa gtgggcctac actttccttg ctataattga 2100

gacattaaaa aatctaaata tgatcttgcc atggctatct aaccttatct acaatgtttt 2160

ataaaattct ccattaaaaa tttttaatgt atatttcaga atttaatgct gaacactttc 2220

ttattctaca ttttgcttct ttttctgaaa gatctgaatc agaagtaagg ttagaattgc 2280

cttattcttt cccatgtttt gttctaagac cttaaaagat tacatttaat aaattctaag 2340

tgatgagatt aatttaagca attgtttgga attctttaaa tctactaaga tttgccacct 2400

aaatatctaa gtatctcatg tcagaattgt agccagaaat tttagttcct tcctgatttg 2460

aaaccattct ccatttttgt gctggatgag agtttatatc tgatgagcct ggaaatacat 2520

tcactatagt tctcttctag cttaaagatg tgctgtggag tgtgtgtgtg tgtgttaatt 2580

ttgcagctta tcttttcttg aatgagagga attgaattca gtttttcagg tttgctaatg 2640

tttcactctt acccaaagat aagccaagaa tcttcatccc aggaaccatg aaaactcatg 2700

gttattaaac agtttttcca gtaaagttca agtttgaaat ttggtcattt gaagttagaa 2760

agtggcaaac cactgaagca cccacctact tacttgagca tgatcgataa acacgcggat 2820

ctttgagtgt tagtcactct cctccagcca gaataaataa atatacaaat caggatcacc 2880

tttgagtgtc ttttgttatt agagtttcaa gtctcttaca tcaactattc tattcaagta 2940

gtagaataaa atactaaatg aaatatttgt gaaagcatta aactgaaaaa tatttagatg 3000

gtatcattat tatcctcatc atttattaaa gctaattcag catactggtt aaattttatg 3060

tgataaatac taaaaatcat gagttttctc ttttcagagt ttgcttatgg tggccatcct 3120

tacccctttt ctggaatatt tgaaatttcc ccaggaaatg cttctgaact aggagaaaca 3180

tttaaattta a 3191

<210>4

<211>762

<212>DNA

<213>野猪属猪(Sus scrofa domestica Brisson)

<220>

<221>misc-feature

<222>(212)

<223>n＝t或c

<400> 4

ctagaaccac tcaaaccaag cagctgtgtt tccacaactt ttcctttgtt ctcattctct 60

ctcagtacaa gataatctga tcaagttgta ggtagtaata gtctgtgtaa aacagatgac 120

atggctcgtt tcatcaaggt tgtagtaata tactcgtttg catataaact accgtatagc 180

accaatgctt ctgtctgctt cagctgggca gncttggtgg cctctcagyc tatggcattg 240

caccttactc ccagttaccc ctgaggacta cataccagct ttggctgatr caaagaaaag 300

gytcatttac ttgaataygt tagtgtggtg tttttctatc ccttttttta taggctgaat 360

tagctgcttc tgggtgcagt gctgtaaaga tctaccatgt taagttctgt tgtacttgga 420

agactgcatc taccaaataa tcccccaaag cagtgaagtt cccgcagaaa gtttcagtgg 480

ttagagtatt gatatgggtg gctttgctcc ctgtttgact tggcttttgc cacagttggc 540

gtatacattc ctttttaccc gaatttgtat gttgtgttac agtttttaaa agtaccacca 600

agttttgtac gacatgacca tgccggtctg aggtagatgg gagcattttt cagatgaaac 660

tgaagctcag acctgctaaa agtgctactg cgaataatta acagaactag gacctgaccc 720

ctagtgtcat atactaaccc gttatccttt tacctgcctg at 762

<210>5

<211>789

<212>DNA

<213>野猪属猪(Sus scrofa domestica Brisson)

<220>

<221>misc-feature

<222>(181)

<223>n＝a或c

<400>5

gccttctgag tagcagtatg agttgacatt caactgcttt taactattca agctaccttt 60

tctactacac cttgaaaact agagtcttca agtaacactc tccagaaagt caatactttg 120

ataatgtaaa cgttttatgc accatagcag aaagagtatg ttggaattgg ttagtttctt 180

ncggtagttt cacctcccaa tagaaagcct cgcctcactg acctcttgtt ggaaaatcac 240

acgtacgcgt cttacaggtc atcttttccg ttctctcaga tgtatgtctc ttacttaact 300

gactctaaga atgaagctgt caccacagat gagtcctcac tagcagggag cctgtctgct 360

caagtctact cccagtttga cccttggatg tcagagcccc gtcattacat gtcacattca 420

gtgtttctgc cttaagagcg aatgtcctac acagagtttt ggatgcagtg tataaattat 480

ccaaggcagt gacttcagcg ttagagatat tgttagcttt aaagtcgtct acgtttcttt 540

aaacgtcttc attgggttgt ttgctgctgt tctttgtaag gacccatatc cttcagtaaa 600

ctacattttt taacttttcc ataagctgat tttgattgat ttttatcaaa ttaagcacaa 660

cctgttcata ggggaaataa actttgggtt tgacctgagg aaaatgaacc cacttaacct 720

aatttatgct tttggcggtt ttgtttctgg agaggaaagc cttggtggat tattctcagt 780

tctcgcagg 789

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

tggcagagcg gtcgtcactt aggc 24

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

gagcagaatc tcctcccacg caccat 26

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

ctagaaccac tcaaaccaag cagc 24

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

atcaggcagg taaaaggata acgg 24

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

gccttctgag tagcagtatg agttg 25

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

cctgcgagaa ctgagaataa tcc 23

<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

tgaacgagta cacctcatcc atc 23

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>13

tctcctagtt cagaagcatt tcct 24

Claims

1.一种猪脂肪沉积相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中序列1；

2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与猪脂肪沉积相关的蛋白质。

2.权利要求1所述的猪脂肪沉积相关蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述猪脂肪沉积相关蛋白的编码序列为自序列表中序列2的5′端第169-753位核苷酸。

4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述猪脂肪沉积相关蛋白的的cDNA基因具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中序列2的多核苷酸；

2)编码序列表中序列1蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中的序列2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

5.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述猪脂肪沉积相关蛋白的基因组基因的第二个外显子具有下述核苷酸序列之一：

1)自序列表中的序列3的5′端的第1-73位核苷酸；

2)在高严谨条件下可与序列表中的序列3第1-73位核苷酸限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

所述猪脂肪沉积相关蛋白的基因组基因的第三个外显子具有下述核苷酸序列之一：

1)自序列表中的序列3的5′端的第3098-3191位核苷酸；

2)在高严谨条件下可与序列表中的序列3的5′端的第3098-3191位核苷酸限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

所述猪生产性状相关蛋白的基因组基因其基因组基因的第二个内含子序列具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中序列3自5′端的第74-3097位核苷酸；

6.含有权利要求3或4或5所述编码基因的重组表达载体。

7.含有权利要求3或4或5所述编码基因的转基因细胞系或宿主菌。

8.一种检测猪脂肪沉积性状的方法，是检测自序列表中序列3的5′端第1407位核苷酸或自序列表中序列4的5′端第212位核苷酸为C还是T，或者检测自序列表中序列2的5′端第1812位核苷酸或自序列表中序列5的5′端第181位核苷酸为C还是A，确定猪的基因型，然后通过基因型确定脂肪沉积性状；

所述确定猪的基因型的方法为：如果自序列表中序列3的5′端第1407位核苷酸或自序列表中序列4的5′端第212位核苷酸为C时，其纯合体的基因型为BB；自序列表中序列3的5′端第1407位核苷酸或自序列表中序列4的5′端第212位核苷酸为T时，其纯合体的基因型为AA；它们的杂合体基因型为AB；如果自序列表中序列2的5′端第1812位核苷酸或自序列表中序列5的5′端第181位核苷酸为C时，其纯合体的基因型为BB；自序列表中序列2的5′端第1812位核苷酸或自序列表中序列5的5′端第181位核苷酸为A时，其纯合体的基因型为AA；它们的杂合体基因型为AB；

通过基因型确定脂肪沉积性状的方法为：所述AA基因型的猪脂肪沉积低于AB基因型，AB基因型的猪脂肪沉积低于BB基因型。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述检测自序列表中序列3的5′端第1407位核苷酸或自序列表中序列4的5′端第212位核苷酸为C还是T确定基因型的方法包括先PCR扩增含有自序列表中序列3的5′端第1407位核苷酸的基因组片段，然后对扩增产物进行测序或者用Sty I酶切扩增产物；所述检测自序列表中序列2的5′端第1812位核苷酸或自序列表中序列5的5′端第181位核苷酸为C还是A确定基因型的方法包括先PCR扩增含有自序列表中序列5的5′端第181位核苷酸的基因组片段，然后对扩增产物进行测序或者用Msp I酶切扩增产物；

所述含有自序列表中序列3的5′端第1407位核苷酸的基因组片段PCR扩增产物可为自序列表中序列4所述762bp的核苷酸片段；StyI酶切所述762bp PCR扩增产物，若得到762bp一个片段，其基因型为AA纯合体；当若得到550bp及212bp两个片段，其基因型为BB纯合体；若得到550bp、212bp和762 bp三个片段，其基因型为AB杂合体；

所述含有自序列表中序列3的5′端第1407位核苷酸(A/C)的基因组片段PCR扩增产物可为自序列表中序列5所述789bp的核苷酸片段；MspI酶切所述789bp PCR扩增产物，若得到789bp单一片段，其基因型为AA纯合体；若得到789bp，608bp及181bp三个酶切片段时，其基因型为AB杂合体；若得到608bp及181bp两个片段时，基因型为BB纯合体。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述猪脂肪沉积性状通过检测板油率和/或内脂率和/或背膘厚定量。