CN101407844B - 一种检测猪6-7肋间膘厚性状的方法及其专用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测猪6-7肋间膘厚性状的方法及其专用试剂盒。本发明公开的方式是检测待测猪的基因组中的GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1779位核苷酸、第1781位核苷酸、第1782位核苷酸、第1783位核苷酸、第1784位核苷酸、第1785位核苷酸、第1786位核苷酸、第1787位核苷酸或第1788位核苷酸，确定猪的基因型，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚。与传统方法相比，应用本发明的方法对出生仔猪进行检测，可以实现早选，缩短选育时间，极大地减少选育费用。同时，本发明的方法提高了选育的准确性，减少了人力物力的浪费。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测猪6-7肋间膘厚性状的方法及其专用试剂盒。
背景技术
随着人们生活水平的不断提高，肉类的消费量日益增大，对品质的需求也在不断提高。瘦肉率是猪生产水平的重要标志。瘦肉率是一个复合性状，在育种工作中通常以肋间膘厚、眼肌面积等指标进行选育。猪6-7肋间膘厚与胴体瘦肉率的相关系数为-0.5～-0.9，因此，6-7肋间膘厚是反映猪胴体瘦肉率的一个重要指标，也是评定肉质等级最为直观和准确的指标之一。猪6-7肋间膘厚与瘦肉率具有很强的负相关，也就是肋间膘越薄，猪胴体瘦肉率越高。在猪的育种工作中使用分子标记预测猪的肋间膘厚，进而选育猪胴体瘦肉率指标将极大地提高猪的生产质量和生产水平。
解耦联蛋白(uncoupling protein，UCPs)是一类位于线粒体内膜的质子转运载体蛋白，在解离氧化磷酸化藕联、抗氧化和调控能量代谢中发挥重要功能。目前，在哺乳动物中发现的解耦联蛋白家族成员包括UCP1、UCP2、UCP3、UCP4和UCP5。UCP2和UCP3已经被证实与猪的增重、脂肪沉积、饲料转化效率、仔猪出生重等经济性状密切相关。
UCP3位于9号染色体上，其ORF长度为927bp，编码包含308个氨基酸的蛋白质，具有6个跨膜功能域和一个嘌呤核苷酸结合区。UCP3是解耦联蛋白家族中的重要成员，在骨骼肌、白色脂肪组织(WAT)、棕色脂肪组织(BAT)及心肌中均有表达。在骨骼肌中UCP3具备高效、专一性表达的特点，是骨骼肌线粒体内膜的重要转运蛋白。因此，UCP3基因的遗传变异可导致机体能量消耗程度的差异，从而导致个体间的体脂代谢、体脂含量乃至肉质和胴体性状的改变。寻找UCP3基因的多态性，研究其对胴体性状的遗传效应，可为猪的遗传品质改良提供重要的遗传学依据。
基因型分析基于生物个体间基因组DNA碱基的自然变异。目前已有很多成熟的技术进行基因型分析，如单链构象多态性(PCR-SSCP)、DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)、等位基因特异寡聚核苷酸杂交、DNA芯片及TaqMan等。PCR-SSCP方法最为常用，但存在的问题有：检测步骤较多；耗时较长(12-20小时)；易出现杂带，增加错判几率，结果的可信度较低。DNA测序、等位基因特异寡聚核苷酸杂交、DNA芯片和TaqMan方法虽然准确度都比较高，但检测费用高，运用到实际育种比较困难。PCR-RFLP采用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的DNA片段，然后将待检测的DNA片段用限制性内切酶酶切，限制性内切酶识别并切割特异的序列，然后将酶切后的产物进行电泳，再由限制酶图谱(restriction map)分析此段序列的特异酶切位点，即由片段长度的多样性来比对不同来源基因序列的差异性。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测猪6-7肋间膘厚性状的方法及其专用试剂盒。
本发明提供的检测猪6-7肋间膘厚性状的方法，包括如下1)-9)中任一技术方案：
1)检测待测猪的基因组中的GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1779位核苷酸为G还是为A，确定猪的基因型是GG、GA还是AA，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述GG基因型为GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1779位核苷酸为G的纯合体；所述AA基因型为GenBank AccessionNumber NM_214049自5’末端第1779位核苷酸为A的纯合体；所述GA基因型为它们的杂合体；
2)检测待测猪的基因组中的GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1781位核苷酸为G还是为A，确定猪的基因型是GG、GA还是AA，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述GG基因型为GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1781位核苷酸为G的纯合体；所述AA基因型为GenBank AccessionNumber NM_214049自5’末端第1781位核苷酸为A的纯合体；所述GA基因型为它们的杂合体；
3)检测待测猪的基因组中的GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1782位核苷酸为A还是为T，确定猪的基因型是AA、AT还是TT，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述AA基因型为GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1782位核苷酸为A的纯合体；所述TT基因型为GenBank AccessionNumber NM_214049自5’末端第1782位核苷酸为T的纯合体；所述AT基因型为它们的杂合体；
4)检测待测猪的基因组中的GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1783位核苷酸为T还是为G，确定猪的基因型是TT、TG还是GG，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述TT基因型为GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1783位核苷酸为T的纯合体；所述GG基因型为GenBank AccessionNumber NM_214049自5’末端第1783位核苷酸为G的纯合体；所述TG基因型为它们的杂合体；
5)检测待测猪的基因组中的GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1784位核苷酸为G还是为C，确定猪的基因型是GG、GC还是CC，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述GG基因型为GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1784位核苷酸为G的纯合体；所述CC基因型为GenBank AccessionNumber NM_214049自5’末端第1784位核苷酸为C的纯合体；所述GC基因型为它们的杂合体；
6)检测待测猪的基因组中的GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1785位核苷酸为C还是为T，确定猪的基因型是CC、CT还是TT，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述CC基因型为GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1785位核苷酸为C的纯合体；所述TT基因型为GenBank AccessionNumber NM_214049自5’末端第1785位核苷酸为T的纯合体；所述CT基因型为它们的杂合体；
7)检测待测猪的基因组中的GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1786位核苷酸为T还是为C，确定猪的基因型是TT、TC还是CC，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述TT基因型为GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1786位核苷酸为T的纯合体；所述CC基因型为GenBank AccessionNumber NM_214049自5’末端第1786位核苷酸为C的纯合体；所述TC基因型为它们的杂合体；
8)检测待测猪的基因组中的GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1787位核苷酸为C还是为G，确定猪的基因型是CC、CG还是GG，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述CC基因型为GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1787位核苷酸为C的纯合体；所述GG基因型为GenBank AccessionNumber NM_214049自5’末端第1787位核苷酸为G的纯合体；所述CG基因型为它们的杂合体；
9)检测待测猪的基因组中的GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1788位核苷酸为G还是为C，确定猪的基因型是GG、GC还是CC，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述GG基因型为GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1788位核苷酸为G的纯合体；所述CC基因型为GenBank AccessionNumber NM_214049自5’末端第1788位核苷酸为C的纯合体；所述GC基因型为它们的杂合体。
以上9个位点的突变位于UCP3基因的3’侧翼区(调控区)，为3’侧翼区序列多态。该3’侧翼区序列呈两种类型，一种类型为：GenBank Accession NumberNM_214049自5’末端第1779位核苷酸为G，自5’末端第1781位至第1788位核苷酸为GATGCTCG，将该型命名为C1；另一种类型为：GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1779位核苷酸为A，自5’末端第1781位至第1788位核苷酸为ATGCTCGC，将该型命名为C2。这说明，GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1779位核苷酸、自5’末端第1781位至第1788位核苷酸都是紧密连锁的，所以虽然存在9个位点的突变，但该序列只存在两个多态类型。
针对该3’侧翼区序列多态，将C1纯合体基因型命名为C1C1，将C2纯合体基因型命名为C2C2，它们的杂合体基因型为C1C2。
3’调控区序列多态：野生型：GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1779位核苷酸为G，自5’末端第1781位至第1788位核苷酸为GATGCTCG；不能被限制性内切酶AvaI识别；突变型：GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1779位核苷酸为A，自5’末端第1781位至第1788位核苷酸为ATGCTCGC；能被限制性内切酶AvaI识别。
所述确定猪的基因型的方法具体可为以待测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后将酶切后的PCR产物进行电泳。
确定3’侧翼区序列多态时，PCR扩增产物需包括GenBank Accession NumberNM_214049自5’末端第1779位核苷酸和自5’末端第1781位至第1788位核苷酸，长度为200bp-1000bp。
PCR的引物对具体可为序列表中的序列1所示的核苷酸序列和序列表中的序列2所示的核苷酸序列，酶切所用的酶具体可为限制性内切酶AvaI。C1C1型样本的PCR扩增产物不能被AvaI酶切，电泳后显示696bp的一条条带；C2C2型样本的PCR扩增产物被AvaI酶切后产生433bp和263bp两种片段，电泳后显示433bp和263bp的两条条带；C1C2型样本为杂合体，PCR扩增产物被AvaI酶切后产生696bp、433bp和263bp三种片段，电泳后显示696bp、433bp和263bp的三条条带。
C1C2基因型和C2C2基因型的6-7肋间膘厚小于C1C1基因型。
所述方法还包括如下a)步骤和如下b)步骤：
a)检测待测猪的基因组中的GenBank Accession Number AY739704自5’末端第1406位核苷酸为A还是为G(G1406A)，确定猪的基因型是AA、AG还是GG，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述AA基因型为GenBank Accession NumberAY739704自5’末端第1406位核苷酸为A的纯合体；所述GG基因型为GenBankAccession Number AY739704自5’末端第1406位核苷酸为G的纯合体；所述AG基因型为它们的杂合体；
b)检测待测猪的基因组中的GenBank Accession Number AY739704自5’末端第3602位核苷酸为T还是为C(T3602C)，确定猪的基因型是TT、TC还是CC，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述TT基因型为GenBank Accession NumberAY739704自5’末端第3602位核苷酸为T的纯合体；所述CC基因型为GenBankAccession Number AY739704自5’末端第3602位核苷酸为C的纯合体；所述TC基因型为它们的杂合体。
针对该G1406A多态，将A纯合体基因型命名为A1A1，将G纯合体基因型命名为A2A2，它们的杂合体基因型为A1A2。
针对该T3602C多态，将T纯合体基因型命名为B1B1，将C纯合体基因型命名为B2B2，它们的杂合体基因型为B1B2。
G1406A多态：野生型：GenBank Accession Number AY739704自5’末端第1406位核苷酸为G；能被限制性内切酶SmalI识别；突变型：GenBank Accession NumberAY739704自5’末端第1406位核苷酸为A；不能被限制性内切酶SmalI识别。
T3602C多态：野生型：GenBank Accession Number AY739704自5’末端第3602位核苷酸为T；用错配引物扩增后不能被限制性内切酶Tth111I识别；突变型：GenBank Accession Number AY739704自5’末端第3602位核苷酸为C；用错配引物扩增后能被限制性内切酶Tth111I识别。
所述确定猪的基因型的方法具体可为以待测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后将酶切后的PCR产物进行电泳。
确定G1406A多态时，PCR扩增产物需包括GenBank Accession Number AY739704自5’末端第1406位核苷酸，长度为200bp-1000bp。
PCR的引物对具体可为序列表中的序列3所示的核苷酸序列和序列表中的序列4所示的核苷酸序列，酶切所用的酶具体可为限制性内切酶SmalI。A1A1型样本的PCR扩增产物不能被SmalI酶切，电泳后显示453bp的一条条带；A2A2型样本的PCR扩增产物被SmalI酶切后产生399bp和54bp两种片段，54bp片段太小，在该电泳中不能显示，所以电泳后显示399bp的一条条带；A1A2型样本为杂合体，PCR扩增产物被SmalI酶切后产生453bp、399bp和54bp三种片段，54bp片段太小，在该电泳中不能显示，所以电泳后显示453bp和399bp的两条条带。
确定T3602C多态时，PCR扩增产物需包括GenBank Accession NumberAY739704自5’末端第3602位核苷酸，长度小于200bp。因为是引入错配位点，酶切位点在引物上，所以不管如何变换引物，酶切前后片段大小总是相差23bp，因此，扩增片段越长，酶切前后片段在琼脂糖凝胶上区分的越不明显，因此片段不易过长。
PCR的引物对具体可为序列表中的序列5所示的核苷酸序列和序列表中的序列6所示的核苷酸序列，酶切所用的酶具体可为限制性内切酶Tth111I。B1B1型样本的PCR扩增产物不能被Tth111I酶切，电泳后显示193bp的一条条带；B2B2型样本的PCR扩增产物被Tth111I酶切后产生170bp和23bp两种片段，23bp片段太小，在该电泳中不能显示，所以电泳后显示170bp的一条条带；B1B2型样本为杂合体，PCR扩增产物被Tth111I酶切后产生193bp、170bp和23bp三种片段，23bp片段太小，在该电泳中不能显示，所以电泳后显示193bp和170bp的两条条带。
联合基因型A2A2B1B2C1C2的6-7肋间膘厚最小。
本发明还提供了一种检测猪6-7肋间膘厚性状的试剂盒，包括满足如下条件的引物对I：以猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物含有GenBank AccessionNumber NM_214049自5’末端第1779位核苷酸和第1781位至第1788位核苷酸；扩增产物长度可为200bp-1000bp。
所述试剂盒还包括满足如下条件1)的引物对II和满足如下条件2)的引物对III：
1)以猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物含有GenBank AccessionNumber NM_AY739704自5’末端第1406位核苷酸；扩增产物长度可为200bp-1000bp；
2)以猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物含有GenBank AccessionNumber NM_AY739704自5’末端第3602位核苷酸；扩增产物的长度小于200bp。
所述引物对I具体可为序列表中的序列1所示的核苷酸序列和序列表中的序列2所示的核苷酸序列；所述引物对II具体可为序列表中的序列3所示的核苷酸序列和序列表中的序列4所示的核苷酸序列；所述引物对III具体可为序列表中的序列5所示的核苷酸序列和序列表中的序列6所示的核苷酸序列。
所述试剂盒还可包括限制性内切酶AvaI。
所述试剂盒还可包括限制性内切酶AvaI；
所述试剂盒还可包括限制性内切酶SmalI和限制性内切酶Tth111I。
与传统方法相比，应用本发明的方法对出生仔猪进行检测，可以实现早选，缩短选育时间，极大地减少选育费用。同时，本发明的方法是直接针对具有基因效应的功能基因进行选择，提高了选育的准确性，减少了人力物力的浪费。应用本发明的方法筛选优良性状的猪，基因型最高选择效应可达到14.33％，按照猪6-7肋间膘厚与胴体瘦肉率的相关系数-0.5～-0.9计算，可提高胴体瘦肉率在7.16％～％12.90。见表2，通过计算可知基因型C1C2和C2C2的6-7肋间膘厚明显低于基因型C1C1的为9.58％和12.46％，即基因型C1C2和C2C2的瘦肉率高于基因型C1C1的为9.58％和12.46％。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
附图说明
图1为C1C1、C2C2、C1C2三种基因型样本的电泳图。
图2为A1A1、A2A2、A1A2三种基因型样本的电泳图。
图3为B1B1、B1B2两种基因型样本的电泳图。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、检测猪6-7肋间膘厚性状的方法的建立
一、UCP3基因多态的发现
将293头金华×皮特兰F2代猪作为实验对象。猪21周龄屠宰时采集血样，放于冰盒，于-20℃保存。
1、3’调控区序列多态的发现
(1)PCR扩增
根据猪UCP3基因mRNA序列信息(GenBank Accession Number NM_214049)，用0ligo(6.02)软件设计PCR引物。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成，序列如下：
引物1(上游引物)：5’-CCTTCAGGACACGTTCGTGT-3’；(1353-1372)
引物2(下游引物)：5’-GCCCCTGGTTCCTTTGGTCTGA-3’。(2027-2048)
PCR反应体系：基因组DNA200ng，引物各10nmol，dNTPs200μmol/L，10×buffer(MgCl2)1.5mmo/L，Taq DNA聚合酶0.5u，加灭菌双蒸水至总体积20μl。PCR扩增条件：94℃预变性4min；94℃变性50s，63℃退火50s，72℃延伸50s，35个循环；最后72℃延伸10min。
(2)酶切鉴定
将步骤(1)得到的PCR产物37℃酶切3小时，2.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
酶切体系：buffer 0.7μl，限制性内切酶AvaI 3u，PCR产物3μl，加双蒸水至总体积10μl。
293个样本中，带型呈现3种情况。第一种，电泳显示一条条带(约700bp)；第二种，电泳显示两条条带(约450bp和约250bp)；第三种，电泳显示三条条带(约700bp、约450bp和约250bp)。
(3)测序鉴定
将步骤(1)得到的PCR产物进行测序，测序结果表明，步骤(2)中的三种带型是由UCP3基因的3’侧翼区(GenBank Accession Number NM214049自5’末端第1779位和1781-1788位)发生突变引起的。该3’侧翼区序列呈两种类型，一种类型为：GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1779位核苷酸为G，自5’末端第1781位至第1788位核苷酸为GATGCTCG，将该型命名为C1；另一种类型为：GenBankAccession Number NM_214049自5’末端第1779位核苷酸为A，自5’末端第1781位至第1788位核苷酸为ATGCTCGC，将该型命名为C2。这说明，GenBank Accession NumberNM_214049自5’末端第1779位核苷酸、自5’末端第1781位至第1788位核苷酸都是紧密连锁的，所以虽然存在9个位点的突变，但该序列只存在两个多态类型。
针对该突变位点，将UCP3基因分型如下：将C1纯合型的样本命名为C1C1，将C2纯合型的样本命名为C2C2，将杂合型的样本命名为C1C2。
(4)结果分析
C1C1型样本的PCR扩增产物不能被AvaI酶切，电泳后显示696bp的一条条带；C2C2型样本的PCR扩增产物被AvaI酶切后产生433bp和263bp两种片段，所以电泳后显示433bp和263bp的两条条带；C1C2型样本为杂合体，PCR扩增产物被AvaI酶切后产生696bp、433bp和263bp三种片段，所以电泳后显示696bp、433bp和263bp的三条条带。
C1C1、C2C2、C1C2三种基因型样本的电泳图见图1。图1中，M：100bp Laddermarker。293个样本中，3’调控区序列多态的等位基因频率和基因型频率见表1。
2、G1406A多态的发现
(1)PCR扩增
根据猪UCP3基因mRNA序列信息(GenBank Accession Number AY739704)，用0ligo(6.02)软件设计PCR引物。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成，序列如下：
引物3(上游引物)：5’-CCTCTACGCTCCGTCAAGC-3’；(1007-1026)
引物4(下游引物)：5’-CCCTGGCGATGGTTCTGT-3。(1443-1460)
PCR反应体系：基因组DNA 200ng，引物各10nmol，dNTPs200μmol/L，10×buffer(MgCl2)1.5mmo/L，Taq DNA聚合酶0.5u，加灭菌双蒸水至总体积20μl。PCR扩增条件：94℃预变性4min；94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s，35个循环；最后72℃延伸10min。
(2)酶切鉴定
将步骤(1)得到的PCR产物30℃酶切3小时，2.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
酶切体系：buffer 0.7μl，限制性内切酶SmalI3u，PCR产物3μl，加双蒸水至总体积10μl。
293个样本中，带型呈现3种情况。第一种，电泳显示一条条带(约450bp)；第二种，电泳显示一条条带(约400bp)；第三种，两条条带(约450bp和约400bp)。
(3)测序鉴定
将步骤(1)得到的PCR产物进行测序，测序结果表明，步骤(2)中的三种带型是由UCP3基因的Exon3中的一个点突变引起的，该点突变位于GenBank AccessionNumber AY739704自5’末端第1406位核苷酸，该位点上的核苷酸由G突变为A，造成第150位甘氨酸-精氨酸(Gly-Arg)的错义突变，将该点突变命名为G1406A。
针对该突变位点，将UCP3基因分型如下：将AA纯合型的样本命名为A1A1，将GG纯合型的样本命名为A2A2，将杂合型的样本命名为A1A2。
(4)结果分析
A1A1型样本的PCR扩增产物不能被SmalI酶切，电泳后显示453bp的一条条带；A2A2型样本的PCR扩增产物被SmalI酶切后产生399bp和54bp两种片段，54bp片段太小，在该电泳中不能显示，所以电泳后显示399bp的一条条带；A1A2型样本为杂合体，PCR扩增产物被SmalI酶切后产生453bp、399bp和54bp三种片段，54bp片段太小，在该电泳中不能显示，所以电泳后显示453bp和399bp的两条条带。
A1A1、A2A2、A1A2三种基因型样本的电泳图见图2。图2中，M：100bp Laddermarker。293个样本中，G1406A多态的等位基因频率和基因型频率见表1。
3、T3602C多态的发现
(1)PCR扩增
根据猪UCP3基因mRNA序列信息(GenBank Accession Number AY739704)，用0ligo(6.02)软件设计PCR引物。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成，序列如下：
引物5(上游引物)：5’-CCTCTTCCCCTCCCCCGATGCAGAC-3’；(3435-3459)
引物6(下游引物)：5’-GGCTGTGGGGCCCTCCTGGGACACC-3’。(3603-3627)
因为是错配引物，所以第3607个碱基由原来的A变为引物中的T。
PCR反应体系：基因组DNA200ng，引物各10nmol，dNTPs200μmol/L，10×buffer(MgCl2)1.5mmo/L，Taq DNA聚合酶0.5u，加灭菌双蒸水至总体积20μ1。PCR扩增条件：94℃预变性4min；94℃变性50s，54℃退火50s，72℃延伸50s，35个循环；最后72℃延伸10min。
(2)酶切鉴定
将步骤(1)得到的PCR产物65℃酶切3小时，2.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
酶切体系：buffer 0.7μl，限制性内切酶Tth111I3u，PCR产物3μl，加双蒸水至总体积10μl。
293个样本中，带型呈现3种情况。第一种，电泳显示一条条带(比200bp marker略大)；第二种，电泳显示一条条带(比200bp marker略小)；第三种，电泳显示两条条带，一条比200bp marker略大，另一条比200bp marker略小。
(3)测序鉴定
将步骤(1)得到的PCR产物进行测序，测序结果表明，步骤(2)中的三种带型是由UCP3基因的Exon5中的一个点突变引起的，该点突变位于GenBank AccessionNumber NM_AY739704自5’末端第3602位核苷酸，该位点上，核苷酸由T突变为C，造成第259位氨基酸甲硫氨酸(Met-Thr)的错义突变，将该点突变命名为T3602C。
针对该突变位点，将UCP3基因分型如下：将TT纯合型的样本命名为B1B1，将CC纯合型的样本命名为B2B2，将杂合型的样本命名为B1B2。
(4)结果分析
B1B1型样本的PCR扩增产物不能被Tth111I酶切，电泳后显示193bp的一条条带；B2B2型样本的PCR扩增产物被Tth111I酶切后产生170bp和23bp两种片段，23bp片段太小，在该电泳中不能显示，所以电泳后显示170bp的一条条带；B1B2型样本为杂合体，PCR扩增产物被Tth111I酶切后产生193bp、170bp和23bp三种片段，23bp片段太小，在该电泳中不能显示，所以电泳后显示193bp和170bp的两条条带。
B1B1、B2B2、B1B2三种基因型样本的电泳图见图3。图3中，M：100bp Laddermarker。293个样本中，T3602C多态的等位基因频率和基因型频率见表1。
表1 293头个样本UCP3基因的等位基因频率和基因型频率
二、UCP3基因多态和猪6-7肋间膘厚性状的相关性
步骤一中的293头金华×皮特兰F2代猪，屠宰时以游标卡尺测量6-7肋间膘厚。将猪的基因型和猪的6-7肋间膘厚性状进行相关性分析。
1、3’调控区序列多态和猪6-7肋间膘厚性状的相关性
建立单标记回归统计模型，采用SAS统计软件(SAS Institute Inc，Version8.0)glm程序进行单标记方差分析，并进行显著性检验，所采用模型为：
Yij＝μ+Gi+Sj+bijXij+eij
Yij为性状表型值，μ为平均值，Gi为基因型效应；Sj为性别效应，bij为屠宰体重的回归系数；Xij为屠宰体重；eij为残差效应。
结果见表2。
表2 基因型与6-7肋间膘厚性状的相关分析
注：含不同字母的两个基因型间差异极显著(P<0.01)。
结果表明：三种基因型(C1C1、C2C2、C1C2)与6-7肋间膘厚性状存在极显著的相关(P＝0.0062)，基因型C1C1极显著高于基因型C1C2(P＝0.0050)和基因型C2C2(P＝0.0037)，而基因型C1C2和基因型C2C2间的差异并不显著(P>0.05)，因此3’调控区的碱基突变，会造成6-7肋间背膘厚的显著下降。实践中，应选择突变后的，具有薄的6-7肋间膘厚的个体，即基因型C1C2和基因型C2C2的个体，从育种角度而言，最好选择基因型C2C2的个体，因为C2C2基因型是纯合型，有利于纯种后代的繁育。
2、G1406A多态和猪6-7肋间膘厚性状的相关性
方法同步骤1。
结果表明，G1406A多态和猪6-7肋间膘厚性状不相关。
3、T3602C多态和猪6-7肋间膘厚性状的相关性
方法同步骤1。
结果表明，T3602C多态多态和猪6-7肋间膘厚性状不相关。
4、UCP3基因的3个位点的多态的联合基因型和猪6-7肋间膘厚性状的相关性
方法同步骤1。
结果见表3。
表3 猪UCP3基因三个多态位点联合基因型与6-7肋间膘厚的相关分析
注：表中多态位点联合基因型的排列顺序为：G1406A(A1/A2)，T3602C(B1/B2)，3’-UTR(C1/C2)。
含不同字母的两个联合基因型间差异显著(0.01<P<0.05)
结果表明：6-7肋间膘厚与联合基因型显著相关(P＝0.0300)。G1406A-T3602C-3’侧翼区的联合基因型A2A2B1B2C1C2的6-7肋间膘厚最小，与联合基因型A1A1B1B1C1C1、A1A1B1B2C1C1、A2A2B1B1C1C1、A1A1B1B2C1C2和A1A1B1B1C2C2差异显著(0.01<P<0.05)；联合基因型A1A2B1B1C1C2与A1A1B1B1C1C1和A1A1B1B2C1C2差异显著(0.01<P<0.05)；联合基因型A2A2B1B1C1C2与A1A1B1B1C2C2差异显著(0.01<P<0.05)。
实施例2、检测猪6-7肋间膘厚性状的试剂盒的制备
一、检测猪6-7肋间膘厚性状的试剂盒的制备
试剂盒由以下组分组成：
序列表的序列1所示的核苷酸序列；
序列表的序列2所示的核苷酸序列；
限制性内切酶AvaI。
二、检测猪6-7肋间膘厚性状的试剂盒的制备
试剂盒由以下组分组成：
序列表的序列1所示的核苷酸序列；
序列表的序列2所示的核苷酸序列；
序列表的序列3所示的核苷酸序列；
序列表的序列4所示的核苷酸序列；
序列表的序列5所示的核苷酸序列；
序列表的序列6所示的核苷酸序列；
限制性内切酶AvaI；限制性内切酶SmalI；限制性内切酶Tth111I。
实施例3、检测猪6-7肋间膘厚性状的试剂盒的应用
使用实施例2的步骤一制备的试剂盒，检测200头长白猪。检测结果见表4。
表4 长白猪的3’调控区序列多态基因分型检测
实施例4、检测猪6-7肋间膘厚性状的试剂盒的应用
使用实施例2的步骤二制备的试剂盒，检测138头长白猪。检测结果见表5。
表5 长白猪的联合基因分型检测
| 联合基因型 | 头数 | 联合基因型 | 头数 |
| A1A1B1B1C1C1 | 14 | A1A2B1B1C1C2 | 23 |
| A1A1B1B2C1C1 | 20 | A1A2B1B2C1C2 | 10 |
| A2A2B1B1C1C1 | 15 | A2A2B1B1C1C2 | 12 |
| A1A1B1B1C1C2 | 15 | A2A2B1B2C1C2 | 9 |
| A1A1B1B2C1C2 | 9 | A1A1B1B1C2C2 | 11 |
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种检测猪6-7肋间膘厚性状的方法及其专用试剂盒
<130> CGGNARY81955
<160> 6
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
Claims (4)
1.检测猪6-7肋间膘厚性状的方法，包括如下1)-9)中任一技术方案：
1)检测待测猪的基因组中的GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1779位核苷酸为G还是为A，确定猪的基因型是GG、GA还是AA，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述GG基因型为GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1779位核苷酸为G的纯合体；所述AA基因型为GenBank Accession NumberNM_214049自5’末端第1779位核苷酸为A的纯合体；所述GA基因型为它们的杂合体；
2)检测待测猪的基因组中的GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1781位核苷酸为G还是为A，确定猪的基因型是GG、GA还是AA，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述GG基因型为GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1781位核苷酸为G的纯合体；所述AA基因型为GenBank Accession NumberNM_214049自5’末端第1781位核苷酸为A的纯合体；所述GA基因型为它们的杂合体；
3)检测待测猪的基因组中的GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1782位核苷酸为A还是为T，确定猪的基因型是AA、AT还是TT，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述AA基因型为GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1782位核苷酸为A的纯合体；所述TT基因型为GenBank Accession NumberNM_214049自5’末端第1782位核苷酸为T的纯合体；所述AT基因型为它们的杂合体；
4)检测待测猪的基因组中的GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1783位核苷酸为T还是为G，确定猪的基因型是TT、TG还是GG，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述TT基因型为GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1783位核苷酸为T的纯合体；所述GG基因型为GenBank Accession NumberNM_214049自5’末端第1783位核苷酸为G的纯合体；所述TG基因型为它们的杂合体；
5)检测待测猪的基因组中的GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1784位核苷酸为G还是为C，确定猪的基因型是GG、GC还是CC，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述GG基因型为GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1784位核苷酸为G的纯合体；所述CC基因型为GenBank Accession NumberNM_214049自5’末端第1784位核苷酸为C的纯合体；所述GC基因型为它们的杂合体；
6)检测待测猪的基因组中的GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1785位核苷酸为C还是为T，确定猪的基因型是CC、CT还是TT，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述CC基因型为GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1785位核苷酸为C的纯合体；所述TT基因型为GenBank Accession NumberNM_214049自5’末端第1785位核苷酸为T的纯合体；所述CT基因型为它们的杂合体；
7)检测待测猪的基因组中的GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1786位核苷酸为T还是为C，确定猪的基因型是TT、TC还是CC，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述TT基因型为GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1786位核苷酸为T的纯合体；所述CC基因型为GenBank Accession NumberNM_214049自5’末端第1786位核苷酸为C的纯合体；所述TC基因型为它们的杂合体；
8)检测待测猪的基因组中的GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1787位核苷酸为C还是为G，确定猪的基因型是CC、CG还是GG，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述CC基因型为GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1787位核苷酸为C的纯合体；所述GG基因型为GenBank Accession NumberNM_214049自5’末端第1787位核苷酸为G的纯合体；所述CG基因型为它们的杂合体；
9)检测待测猪的基因组中的GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1788位核苷酸为G还是为C，确定猪的基因型是GG、GC还是CC，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述GG基因型为GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1788位核苷酸为G的纯合体；所述CC基因型为GenBank Accession NumberNM_214049自5’末端第1788位核苷酸为C的纯合体；所述GC基因型为它们的杂合体；
所述确定待测猪的基因型的方法为以待测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后将酶切后的PCR产物进行电泳；
所述PCR扩增的引物对为序列表中的序列1所示的核苷酸序列和序列表中的序列2所示的核苷酸序列；所述酶切所用的酶为限制性内切酶AvaI；
所述方法还包括如下a)步骤和如下b)步骤：
a)检测待测猪的基因组中的GenBank Accession Number AY739704自5’末端第1406位核苷酸为G还是为A(G1406A)，确定猪的基因型是AA、AG还是GG，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述AA基因型为GenBank Accession Number AY739704自5’末端第1406位核苷酸为A的纯合体；所述GG基因型为GenBank Accession NumberNM_AY739704自5’末端第1406位核苷酸为G的纯合体；所述AG基因型为它们的杂合体；
b)检测待测猪的基因组中的GenBank Accession Number AY739704自5’末端第3602位核苷酸为T还是为C(T3602C)，确定猪的基因型是TT、TC还是CC，然后通过基因型确定猪6-7肋间膘厚；所述TT基因型为GenBank Accession Number AY739704自5’末端第3602位核苷酸为T的纯合体；所述CC基因型为GenBank Accession NumberAY739704自5’末端第3602位核苷酸为C的纯合体；所述TC基因型为它们的杂合体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述确定猪的基因型的方法为以待测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后将酶切后的PCR产物进行电泳；
所述步骤a)中，PCR扩增的引物对为序列表中的序列3所示的核苷酸序列和序列表中的序列4所示的核苷酸序列，酶切所用的酶为限制性内切酶SmalI；所述步骤b)中，PCR扩增的引物对为序列表中的序列5所示的核苷酸序列和序列表中的序列6所示的核苷酸序列，酶切所用的酶为限制性内切酶Tth111I。
3.检测猪6-7肋间膘厚性状的试剂盒，包括满足如下条件的引物对I：以猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物含有GenBank Accession Number NM_214049自5’末端第1779位核苷酸和第1781位至第1788位核苷酸；
所述试剂盒还包括满足如下条件1)的引物对II和满足如下条件2)的引物对III：
1)以猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物含有GenBank Accession NumberAY739704自5’末端第1406位核苷酸；
2)以猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物含有GenBank Accession NumberAY739704自5’末端第3602位核苷酸；
所述引物对I为序列表中的序列1所示的核苷酸序列和序列表中的序列2所示的核苷酸序列；所述引物对II为序列表中的序列3所示的核苷酸序列和序列表中的序列4所示的核苷酸序列；所述引物对III为序列表中的序列5所示的核苷酸序列和序列表中的序列6所示的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括限制性内切酶AvaI、限制性内切酶SmalI和限制性内切酶Tth111I。
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