CN102559890B - 一种评价猪的脂肪沉积性能的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用CART基因单核苷酸多态性来预测猪脂肪沉积性能的方法，通过测定SEQ ID NO:1的5′端第425位核苷酸，以及SEQ ID NO:2的5′端第311位核苷酸，确定猪的基因型，来判断猪的脂肪沉积性能。本发明可用于检测猪的活体背膘厚、胴体背膘厚、板油重、眼肌面积、瘦肉率等反映猪脂肪沉积性能的性状，从而为通过标记辅助选择或分子育种减少背膘厚、板油重，增加眼肌面积从而提高猪的瘦肉率提供新的重要遗传标记，并将在猪的育种中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用基因的单核苷酸多态性来预测猪脂肪沉积性能的方法。
背景技术
在过去五十年，猪育种改良目标主要是瘦肉率、生长速度和饲料报酬，传统数量遗传学的运用取得了显著成绩，培育出了生长速度快、瘦肉率高的瘦肉型猪种。在当今的猪肉市场，瘦肉产量仍然是决定猪胴体商业价值最重要的因素。世界养猪发达国家的分级标准也是根据胴体瘦肉率的不同将猪胴体划分为不同的等级。因此减少背膘厚、板油重，增加眼肌面积从而提高瘦肉率一直是商品猪生产者、肉品经营者、育种学家们孜孜不倦的追求目标。
在实际工作中，人们试图寻找一种简便的活体评定胴体品质的方法，以减少屠宰带来的经济损失，因此大量研究致力于寻找胴体组成的最佳预测指标。遗传相关分析结果表明，活体背膘厚与胴体瘦肉率存在极强的负相关(rA＝-0.7～-0.86)，且活体背膘厚有较高的遗传力(h2＝0.4～0.6)(彭中镇等：《猪的遗传改良》，北京，农业出版社，1991)。等位基因与性状间的关联可以找出许多与该性状具有关联的分子标记，从而为标记辅助选择(marker assisted selection，MAS)乃至分子育种提供理论依据。因此当前各国动物育种学家包括人类疾病研究者都渴望通过这种简短而有效的方法寻找分子遗传标记。加之猪的胴体性状除背膘厚能够直接在活体上测量外，其它指标如：屠宰率、瘦肉率、眼肌面积等均需要在屠宰后测定，从而延迟了选育进展。而分子遗传标记则可能克服这一缺点而较早地对种猪进行选择，因此合适的遗传标记对于开展标记辅助选择，加快遗传进展，并最终实现分子育种是极其重要的。
目前已研究的与猪的脂肪沉积或是与背膘厚相关的基因有：类胰岛素生长因子2(Insulin like growth factor II，IGF-II)，黑素皮质激素受体4(Melanocortin-4receptor，MC4R)，瘦素基因(Leptin，LEP)等。尽管影响猪脂肪沉积性能的侯选基因的研究取得了一些重要进展，但猪的重要经济性状通常是数量性状，涉及到的生理生化过程相当复杂，即使同一个数量性状，尽管已揭示其1-2个受控基因，因此其它具有较大效应的新基因或QTL仍有待发现。
可卡因-安非他明调节转录肽(Cocaine-and Amphetamine RegulatedTranscript，CART)是一种神经调节肽(Michael，1999)。人的CART基因定位于5q132，由3个外显子和2个内含子组成。cDNA的核苷酸同源性为92％，编码区同源性更高达95％。这显示CART基因在哺乳动物里是很保守的(Douglass等，1996)。CART肽主要分布于中枢及周围神经系统如：下丘脑、垂体和肾上腺等(Koylu等，1997；傅茂等，2002)。
CART的生理功能
厌食动物的CARTmRNA在下丘脑的弓状核内表达量较高。而肥胖动物由于Leptin信号传递受阻，在下丘脑的弓状核内CARTmRNA几乎无表达。当给小鼠脑内注射重组的CART可抑制正常和饥饿状态下的摄食，说明CART在动物体内可能是一个内源性摄食抑制剂，可通过下丘脑-垂体-肾上腺轴抑制采食，调节体脂含量(Lambert等，1998；Boguslawa等，2006；Judit等，2007)。Elias等(1998)认为Leptin激活这些神经通路有助于产热、消耗能量、减少体脂含量。另外在瘦素缺乏和瘦素受体缺乏的小鼠下丘脑弓状核中，CART的mRNA水平明显降低。瘦素缺乏的小鼠，给予瘦素后下丘脑CART的mRNA水平明显增加，说明CART参与摄食及体内体脂含量的调节(Menyhert等，2007)。Wierup等(2005)研究发现，CART基因敲除小鼠的胰岛素分泌减少，在采食量没有变化的情况下，40周龄小鼠的体脂含量显著增加。认为CART可通过调控动物体内胰岛素的分泌来调控采食行为，减少体脂。
CART的SNP与肥胖的关系
国内外学者对CART基因的SNP与肥胖的关系做了大量的研究。但各种研究的结果差异较大。Guerardel等(2005)分析CART基因5′上游的3.7kb区域，筛查得到31个SNP，发现SNP-3608T＞C与高加索人的肥胖有极显著相关。DelGiudice等(2001)在研究一个遗传肥胖的意大利家族时发现，CART前体蛋白的一个Leu34Phe突变可引起儿童早期肥胖，但后期正常。Yanik等(2006)在此基础上，做了更深入的研究，发现在肥胖家族中CART前体蛋白的Leu34Phe突变，导致体内活性CART肽的显著降低。提示人类肥胖发生可能是由于Leu34Phe突变，导致活性CART肽的缺失引起。
但也有研究持相反观点。Echwald等(1999)筛选到CART3′UTR的多态，发现这种多态性与丹麦高加索人的肥胖不相关。Challis等(2000)筛查英国白人的CART基因的全部编码区，发现CART基因A1475G位的变异和Ser66Thr的变异与肥胖无关。傅茂等(2002)用PCR-SSCP法也得到CART的基因1457位碱基A的缺失与中国人肥胖的发生无显著关联。
发明内容
本发明的目的是提供一种方法简便的预测或评价猪脂肪沉积性能的方法。
发明通过以下技术方案实现上述目的：
发明提供了一种评价猪的脂肪沉积性能的方法，是利用CART基因单核苷酸多态性来预测猪脂肪沉积性能的方法。
本发明检测的是NCBI Genbank数据库中序列登录号为EF581838的序列(SEQ ID NO：1)5′端第425位核苷酸或SEQ ID NO：2的5′端第311位核苷酸C还是T，属于包嘧啶到胸腺嘧啶的碱基置换，以确定猪个体在此位点的基因型，然后通过基因型确定脂肪沉积性能。如果NCBI数据库中序列登录号为EF581838的序列5′端第425位核苷酸及SEQ ID NO：2的5′端第311位核苷酸为C时，其纯合体的基因型为CC；SEQ ID NO：1的5′端第425位核苷酸及SEQ ID NO：2的5′端第311位核苷酸为T时，其纯合体的基因型为TT；它们的杂合体基因型为CT。所述方法中，所述检测NCBI数据库中序列登录号为EF581838的序列5′端第425位核苷酸或SEQ ID NO：2的5′端第311位核苷酸为C还是T的方法包括先PCR扩增含有序列表中序列2的5′端第311位核苷酸的基因组片段，然后对扩增产物进行测序或者用HaeIII酶切扩增产物。
通过测定SEQ ID NO：1的5′端第425位核苷酸，以及SEQ ID NO：2的5′端第311位核苷酸，确定猪的基因型，来判断猪的脂肪沉积性能。
当SEQ ID NO：1的5′端第425位核苷酸及SEQ ID NO：2的5′端第311位核苷酸为C时，基因型为CC，判断猪的脂肪沉积性能低，瘦肉率高。
当SEQ ID NO：1的5′端第425位核苷酸及SEQ ID NO：2的5′端第311位核苷酸为T时，基因型为TT，判断猪的脂肪沉积性能较高，脂肪沉积多。
当SEQ ID NO：1的5′端第425位核苷酸及SEQ ID NO：2的5′端第311位核苷酸为一个为C，一个为T时，基因型为CT，判断猪的脂肪沉积性能较高，脂肪沉积多。
所述含有NCBI数据库中序列登录号为EF581838的序列5′端第425位核苷酸(C/T)的基因组片段PCR扩增产物可为SEQ ID NO：2的495bp的核苷酸片段；MspI酶切所述495bp PCR扩增产物，若得到495bp单一片段，其基因型为TT纯合体；若得到495bp，310bp及185bp三个酶切片段时，其基因型为CT杂合体；若得到310bp及185bp两个片段时，基因型为CC纯合体。
更具体地说，测定SEQ ID NO：1的5′端第425位核苷酸及SEQ ID NO：2的5′端第311位核苷酸，可以采用以下方法：先PCR扩增含有SEQ ID NO：2的5′端第311位核苷酸的基因组片段，然后对扩增产物进行测序或者用HaeIII酶切扩增产物；所述含有SEQ ID NO：1的5′端第425位核苷酸(C/T)的基因组片段PCR扩增产物为SEQ ID NO：2的495bp的核苷酸片段；HaeIII酶切所述495bpPCR扩增产物，若得到495bp单一片段，其基因型为TT纯合体；若得到495bp，310bp及185bp三个酶切片段时，其基因型为CT杂合体；若得到310bp及185bp两个片段时，基因型为CC纯合体。
通过长白-蓝塘F2资源群体各基因型个体的脂肪沉积性能进行评估：
a.CC型个体脂肪沉积相对较少；TT和CT型脂肪沉积相对较多，且两者对脂肪沉积的影响基本无显著差异；
b.在反映脂肪沉积性能高的性状如板油重、最后肋骨处活体背膘厚、平均活体背膘厚、最后肋骨处胴体背膘厚、腰荐结合处胴体背膘厚等性状，CC型的值都是最高，与CT型或TT型相比，CC型都呈现显著性差异(P＜0.05)，CT与TT型之间无差异。
c.在反映脂肪沉积性能低的性状如瘦肉率、眼肌面积等性状，CC型的值都是最低，TT型的值都较高，并且与CT型或TT型相比，CC型都呈现显著性差异(P＜0.05)，而CT与TT型之间无差异。
本发明的猪可卡因-安非他明调节转录肽及其编码基因CART可用于检测猪的活体背膘厚、胴体背膘厚、板油重、眼肌面积等反映猪脂肪沉积性能的性状。即当以猪的基因组为模版，利用表1中相应引物进行PCR扩增，其产物用相应限制性内切酶进行酶切，凝胶电泳后按照上述方法进行基因型及脂肪沉积性能断定。从而为猪的分子育种提供了一个新的遗传标记，并将在猪的育种中发挥重要作用。
附图说明
图1为预测方法流程图；
本发明利用CART基因单核苷酸多态性来检测猪脂肪沉积性能的方法流程图。
图2为HaeIII-RFLP三种基因型(CC，CT，TT)的电泳结果；
本发明中PCR扩增产物的HaeIII-RFLP的三种基因型(CC，CT，TT)电泳结果。M：DNA分子量标准DS2000(100-2000bp ladder)。
具体实施方式
下述实施例中提到的实验方法，如无特别说明均为常规方法。
本发明利用单核苷酸多态性来检测猪脂肪沉积性能的方法流程图如图1所示，PCR扩增反应体系、PCR扩增反应程序、酶切反应体系分别如表1、表2、表3所示。
具体方法如下述实施例所述。
实施例1用于检测猪脂肪沉积性能的SNP所在DNA序列的获得及多态性分析
用于该单核苷酸多态性检测的DNA样品来自猪的基因组，可通过采集猪的唾液或毛囊然后参照常规方法提取其基因组DNA后于-20℃保存备用。
根据序列表中序列1设计引物PCARTL/PCARTR，它们分别位于该基因的第一外显子(Exon 1)和第二外显子(Exon 2)区，其引物序列如下：
SEQ ID NO：3：
PCARTL：5’-CCGAGCCCTGGACATCTAC-3’
SEQ ID NO：4：
PCARTR：5’-TTCGGGATACGTTTACTCTTGA-3’
该引物扩增片段长度495bp，位于猪CART基因的第一内含子上，即SEQ ID NO：1中自序列的5’端第115-609bp处的核苷酸片段，也即SEQ ID NO：2。
序列分析结果表明在这495bp的DNA片段中，在SEQ ID NO：2的自5’端第311位(SEQ ID NO：1的第425位核苷酸)存在C-T的突变。当SEQ ID NO：2的5’端第311位核苷酸为C时，该基因假定为由C等位基因控制，当SEQ ID NO：2的5’端第311位核苷酸为T时，该基因假定为由T等位基因控制，这两个等位基因可组成三种基因型：纯合体CC、TT，杂合体CT。
即SEQ ID NO：2的5’端第311位核苷酸为C时，存在1个HaeIII酶切位点(GG↓CC)，因此将上述扩增片段用HaeIII酶切鉴定其基因型。当基因型为TT时，扩增片段经HaeIII酶切后只有495bp一个片段；当基因型为CC时，扩增片段经HaeIII酶切后为310bp、185bp两个片段；当基因型为CT时，扩增片段经HaeIII酶切后为495bp、310bp、185bp bp三个片段；三种基因型的酶切鉴定凝胶电泳图如图2所示。图2中M：DNA分子量标准(100-2000bp ladder)。
PCR扩增反应体系、反应程序以及酶切体系如表1、表2、表3所述。
表1PCR扩增反应体系
| 扩增体系 | 成份含量 |
| 2×PCR Reaction Mix | 5μl |
| 上游引物(10pM/μl) | 0.4μl |
| 下游引物(10pM/μl) | 0.4μl |
| 模板DNA(50ng/μl) | 0.5μl |
| Taq酶(5U/μl) | 0.2μl |
| 双蒸水 | 3.5μl |
| 总体积 | 10μl |
注：所使用的Taq酶为TaqMix Kit(广州东盛生物科技有限公司)
表2PCR扩增反应程序
酶切反应体系为：
表3酶切反应体系
| 酶切体系 | 成份含量 |
| 10×Buffer | 1μl |
| PCR产物 | 7μl |
| 限制性内切酶 | 0.5μl |
| 双蒸水 | 1.5μl |
| 总体积 | 10μl |
所用限制性内切酶为HaeIII，酶切温度为37℃，酶切4h。检测时用1～1.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。实施例2长白×蓝塘F2资源群体中标记基因型与性状关联分析
用于该单核苷酸多态性检测的DNA样品来自长白×蓝塘F2资源群体，共230个DNA样品。采用常规方法提取其基因组DNA后于-20℃保存备用。
首先建立如下的分析模型以消除性别、体重及批次对表型值的影响：
yijkl＝μ+si+bj+gk+riCovW+eijkl
其中，yijkl是性状观察值，μ为最小二乘均数，si为性别效应(i＝1为公猪，i＝2为母猪)，bj为批次效应(j＝1～4)，gk基因型效应(k＝AA，AB and BB)，ri为协变量的回归系数，CovW为宰前活体重协变量，eijkl为误差。假定服从N(0，σ2)分布。
应用该模型就可以直接分析基因型的效应，同时进行基因型间的两两比较。
试验猪群基因型与经济性状关联分析是应用8.2版本的SAS软件中一般线性模型中的最小二乘法来完成的。利用之前我们获得的HaeIII-RFLP基因型检测结果，对具有经济性状的长白×蓝塘F2资源群体(共计230头份)进行了基因型与脂肪沉积相关性状(板油重、眼肌面积、瘦肉率、活体背膘厚、胴体背膘厚)间的关联分析(HaeIII-RFLP突变位点，即序列表中序列2的第311位核苷酸)。在消除了性别、体重及批次等的影响后，基因型间脂肪沉积相关性状的简单均数和标准差分析结果总结于表4。
其中，检测并关联分析的性状及其缩写如下：
眼肌面积longissimus muscle area(LMA)，
板油重leaf fat weight(LFW)，
瘦肉率lean Percentage(LP)，
第6、7肋间活体背膘厚live backfat thickness between 6th and 7th ribs(BFA)，
最后肋骨处活体背膘厚live backfat thickness at last rib(BFB)，
腰荐结合处活体背膘厚rump fat depths measured at the intersection of the line fromthe high bone(third sacral vertebrae)with a line from the inside of the pin bone(BFC)，
平均活体背膘厚average live backfat thickness(BFAV)，
第6、7肋间胴体背膘厚carcass backfat thickness between 6th and 7th ribs(CBFA)，
最后肋骨处胴体背膘厚carcass backfat thickness at last rib(CBFB)，
腰荐结合处胴体背膘厚carcass rump fat depths(CBFC)，
平均胴体背膘厚mean of carcass backfat thickness(CBFM).
结果表明，在板油重、眼肌面积、瘦肉率、活体背膘厚、胴体背膘厚等方面，83个基因型为CC(序列表中序列2的第311位为C的纯合体)的个体分别与23个基因型为TT(序列表中序列2的第311位核苷酸均为T)的个体、124个基因型为CT(序列表中序列2第181位核苷酸均为T和C的杂合体)的个体间均存在显著性差异(P＜0.05)。而TT型与CT型个体间无差异。
表4猪CART基因HaeIII-RFLP基因型与脂肪沉积相关性状的关联分析
注：肩注*表述P＜0.05；肩注**表述P＜0.01。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 一种评价猪的脂肪沉积性能的方法
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2042
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tttcatcacc atggagagcc cccgcctgcg gctgctgccc ctgctaggtg ccgccctgct 60
gctgctgcta cctctgctgg gcgcccttgc ccaggaggat gccgagctcc agccgcgagc 120
cctggacatc tactctgccg tggaggatgc ctcccatgag aaggagctgg tcggtatccc 180
ccttgcctca gacttccctg ggctgccgcg aggtcccttg ttccccgcct ccctacccct 240
ttccccagag tcagggcgcg gggagactcc cgctgtcacc tgaagaatgt ctccagcccc 300
caggctcccg atagtctgta gagcggatcc tttatcccag ctcctcggag caacaggagt 360
cttcgcggtt cctggacctg cggtcagtac gcgggacagc gctaagtttc tatctcttaa 420
acggccctct ttgtggagtc ccctggagga atgtgtgtga ttcccgggct ccttacaaca 480
agggctggag gtgagcacct gggctgggct cacagccaag gtggcaactt ggggctccgt 540
gggtggtgtg ttgcagattg aagcgctgca ggaagtcctg aagaagctca agagtaaacg 600
tatcccgatt tatgagaaga agtatggcca agtccctatg gtaaggcttc gaggtcaccc 660
cgcttcatgt ttttccaaga tgaaacacac caacttgagt tttacacaca gccttctccc 720
caggatgtgg ctaataattc atacaatggg tttgcagaat tctgtgggct cccctttatt 780
tccatggttg acccttgccc cttggtctct aaggttaaag accaggttgg gctgttttgg 840
aggatgggac aggttgtgcc aggaatcagc tcttgggtct gtgtgaaaag gagtatttcc 900
tgagaatgtg cttttaattt ttttaacttc atgaagaatt ctctgagttg gaaggaccag 960
agaattaagt ctagtaagtt cctttccctc caattttctt cctgacttcc ggagcactgc 1020
cagtttttaa aaatctaagt tctaggatca aaaattccaa tgcatacaaa cacacgcgcg 1080
cacacacaca cacacacaca cacaccccac actgaactct ttcttcttgg gataaggagg 1140
ggggagcagg ggtgatgaaa atatatagtc tgttgttcat ttcttagtta acatgtctgc 1200
ttgatttttt atcttttgga tgagaaacta aatgagccag aaaatgtcac tttcccacaa 1260
aatgtagaag aaagtaggag gggctcaata atttaaatat ctgtcttttt atggtctctc 1320
actgggatta taaacacaag gctctgggca tttcaggcct gactatactt agacccattg 1380
tgatggtgac agggtccatc cagctcttcc ataaggcaaa aactgttgat ggagagatgt 1440
gcctgctggg agcatgggtt tcctcaagtg ggatggttac acattgtgtt gtttgcagtg 1500
tgacgcagga gagcagtgcg ccgtgcgaaa aggagctaga atcgggaagc tgtgtgactg 1560
tccccgagga acctcctgca attccttcct cctgaagtgc ttatgagacg tccacccttc 1620
tccttaagta ccccccccca acacacacac accccacttt cctcagacga ccatactttc 1680
atccctggct ttagcaacaa agtttgtatt ttcctttgag aaaaaggggc tcttttcctg 1740
gctgtttcca aataaaagaa cacattagac gtttctgtgt gaacagtaat gccttgtatg 1800
gtgttgatat gtgtgcaaag cattcttatt ttatctgcct gacaaacttt tgtgtatatt 1860
tgagtaaaga aggggaactt cacctcaaaa tttgtatttt tgtaggtggc atggcaggat 1920
gaaactagat ctagtgaatc ttggtagatg acatcacaac ctggaaacta aattacccca 1980
agcatcacaa attgaagcat gtaaaaacta tacataataa agtgtttttc ataattgccc 2040
ta 2042
<210> 2
<211> 495
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcgagccctg gacatctact ctgccgtgga ggatgcctcc catgagaagg agctggtcgg 60
tatccccctt gcctcagact tccctgggct gccgcgaggt cccttgttcc ccgcctccct 120
acccctttcc ccagagtcag ggcgcgggga gactcccgct gtcacctgaa gaatgtctcc 180
agcccccagg ctcccgatag tctgtagagc ggatccttta tcccagctcc tcggagcaac 240
aggagtcttc gcggttcctg gacctgcggt cagtacgcgg gacagcgcta agtttctatc 300
tcttaaacgg ccctctttgt ggagtcccct ggaggaatgt gtgtgattcc cgggctcctt 360
acaacaaggg ctggaggtga gcacctgggc tgggctcaca gccaaggtgg caacttgggg 420
ctccgtgggt ggtgtgttgc agattgaagc gctgcaggaa gtcctgaaga agctcaagag 480
taaacgtatc ccgat 495
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccgagccctg gacatctac 19
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttcgggatac gtttactctt ga 22
Claims (2)
1.一种评价猪的脂肪沉积性能的方法，其特征在于：通过测定SEQ ID NO: 1的5′端第425位核苷酸，以及SEQ ID NO:2的5′端第311位核苷酸，确定猪的基因型，来判断猪的脂肪沉积性能；所述的猪在所述的第425位核苷酸和第311位核苷酸上具有多态性；当SEQ ID NO: 1的5′端第425位核苷酸及SEQ ID NO:2的5′端第311位核苷酸为C时，基因型为CC，判断猪的脂肪沉积性能低，瘦肉率高；当SEQ ID NO: 1的5′端第425位核苷酸及SEQ ID NO:2的5′端第311位核苷酸为T时，基因型为TT，判断猪的脂肪沉积性能较高，脂肪沉积多；当SEQ ID NO: 1的5′端第425位核苷酸及SEQ ID NO:2的5′端第311位核苷酸为一个为C，一个为T时，基因型为CT，判断猪的脂肪沉积性能较高，脂肪沉积多。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于测定SEQ ID NO:1的5′端第425位核苷酸及SEQ ID NO:2的5′端第311位核苷酸的方法为：先PCR扩增含有SEQ ID NO:2的5′端第311位核苷酸的基因组片段，然后对扩增产物进行测序或者用HaeIII酶切扩增产物；所述含有SEQ ID NO:1的5′端第425位核苷酸(C/T)的基因组片段PCR扩增产物为SEQ ID NO:2的495bp的核苷酸片段；HaeIII酶切所述495bp PCR扩增产物，若得到495bp单一片段，其基因型为TT纯合体；若得到495bp ，310bp及185bp三个酶切片段时，其基因型为CT杂合体；若得到310bp及185bp两个片段时，基因型为CC纯合体。
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