CN102690890B - 用于湖羊母性行为分子标记辅助选择的引物及辅助选择方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了湖羊母性行为分子标记辅助选择方法及引物。该方法是检测湖羊PRLR基因外显子10的第284位和第339位核苷酸为C还是突变为T，确定湖羊的基因型，再通过基因型对湖羊母性行为进行选择；若第284位和339位均为C时，其纯合体的基因型为AA；若均为T时，其纯合体基因型为BB；它们的杂合体基因型为AB；对于舔舐、哺乳行为AA基因型的多于AB基因型，AB基因型的多于BB基因型；对于踩踏行为和拒绝哺乳则AA基因型的低于AB基因型，AB基因型的低于BB基因型。本发明的方法利用遗传标记多态性评价湖羊母性行为，可简便、迅速地检测湖羊母性，为评价湖羊母性行为提供了一个简便准确的方法。

Description

用于湖羊母性行为分子标记辅助选择的引物及辅助选择方法

技术领域

本发明为一种评价湖羊母性行为的方法及应用，具体涉及一种用于湖羊母性行为分子标记辅助选择的引物及辅助选择方法。

背景技术

母性行为(Maternal behavior)属于一种本能行为，是亲代抚育(parental care)的主要组成部分，指雌性动物在分娩前后所表现出来的一系列抚育后代的行为性状(赵晓莲,齐淑芳,贾秀月.母性行为的研究进展[J].黑龙江医药科学,2010,33(5):90-91)，如母羊对羔羊舔舐、哺乳、踩踏和拒绝哺乳等行为，其中舔舐和哺乳行为为优良母性行为，踩踏和拒绝哺乳为不良母性行为。母羊舔舐行为可使新生仔羊被毛干燥，起到保温作用；母仔接触可增强母羊识别仔羊的能力；此外，舔舐是很强的刺激，可起到按摩效果，令仔羊排出胎粪，促进生理机能的完善。分娩后的哺乳行为可使仔羊尽早吃到初乳可提高其对疾病的抵抗力以及促进消化道功能成熟。而踩踏和拒绝哺乳是导致羔羊死亡的重要原因，应避免其产生。在家畜的生产和繁殖过程中，良好的母性行为对子代的成活和生长，在现代集约化养殖过程中良好的母性行为能够提高仔畜的存活率，进而提高养殖业的经济收入。

湖羊繁殖能力强，四季均可配种繁殖，且湖羊适应性广，我国大部分地区均适宜养殖。湖羊生性温顺，好管理，适宜集约化饲养，其产肉性能理想，肉质鲜美多汁。其以母性好著称，故研究评价湖羊母性行为的方法可为评价其他羊品种母性行为提供一个借鉴的方法。

Alcock认为某些表型变异是由基因型变异导致的(Alcock,J.,2001.AnimalBehaviour.An Evolutionary Approach,7th ed.Sinauer Associates Inc.,Sunderland)。Per Jensen认为很多性状的巨大变化可能是由调节基因的突变导致的，并且现代基因组学搭配行为性状的分析方法，可为育种提供分析行为和生产性状等关联性的途径(Per Jensen.Animal Behaviour.Domestication-From behaviour to genes andback again,2006(97)3-15)。

催乳素受体(prolactin receptor，PRLR)基因总长度大于100kb，由10个外显子和9个内含子组成，其中外显子1是可变的(Hu Z Z，Zhuang L,Meng J,et al.Thehuman Prolactin receptor gene structure and altemative promoter utilization:thegeneric promoter HPIII and a novel human promoter hP(N)[J].J Clin Endocrinol.Metab,1999,84(3):1153-1156)。Boutin和Kelly等首次克隆大鼠的PRLRcDNA(Boutin JM，Jolicoeur C，Okamura H，et al.Cloning and expression of the ratprolactin receptor，a member of the growth hormone/prolactin receptor gene family[J].Cell.1988,53:69-77)。绵羊的催乳素受体基因位于16号染色体(Jenkins Z A,Henry H M,Sise J A,etal.Follist at in(FST),growth hormone receptor(GH R)andprolact in receptor(PRLR)genes map to the same region of sheep chromosome 16[J].Animal Genetics,2000,31.280)，其配体之一是催乳素。催乳素的主要作用是刺激乳腺发育和促进泌乳，增强雌性动物的母性行为，如禽类抱性、鸟类反哺行为等(Vincent AL,Wang L,Tuggle CK,Rothschild MF.Prolactin receptor maps to pigchromosome 16.Mamm.Genome,1997,8(10):793-794)。鉴于催乳素受体基因在母性行为表达中的重要作用，其深受国内外研究学者的重视。但对湖羊母性行为的研究很少，主要集中在对其他物种母性的研究：

在Lucas B K等(1998年)的研究中，通过对小鼠进行试验，抑制PRLR基因的表达，利用基因定位技术能够直接检测到PRLR基因对小鼠母性行为的影响。研究表明，PRLR基因的一个无义突变会导致小鼠母性行为的缺陷(Lucas BK,Ormandy CJ,Binart N,et al.Null mutation of the prolactin receptor gene produces adefect in maternal behavior[J].Endocrinology，1998,139(10):4012-4017)。

侯鑫等(2010年)对母猪催乳素受体基因与母性行为关系的研究中根据PRLR(prolactin receptor，PRLR)基因对雌性动物母性行为的影响，采用PCR－RFLP方法分析了PRLR基因不同基因型与母性行为的相关性。通过二项回归分析结果显示，PRLR基因外显子10的突变与5个母性行为之间无显著相关(侯鑫.4个群体母猪催乳素受体基因与母性行为关系的研究[J].黑龙江畜牧兽医,2011,53-55.)。

陈从英等(2010年)研究了PRL、PRLR基因的遗传变异及其与母猪杀婴行为的关联性。通过TDT分析发现，PRL和PRLR基因所有检测SNP位点，无论基因型还是单倍型均与母猪杀婴行为无显著相关。原因可能是PRLR基因附近区域内可能不存在影响母猪母性行为的主效基因，不同品种母猪的差异会对PRLR基因的表达有一定影响(陈从英，朱万成，李平华，等．白色杜洛克×二花脸F2资源群体中催乳素(PRL)和催乳素受体(PRLR)基因与母猪杀婴行为和产仔数关联性研究［J］.中国农业科学，2010，43(11):2347－2354．)。

崔世泉等(2007年)研究了民猪和长白猪的PRLR基因cDNA第1620位点单核苷酸的突变，分析了PRLR基因的cDNA第1620位点存在Nae Ⅰ多态性。研究表明，AB基因型母猪与其他2种基因型母猪相比，由较低的侧卧转为其他姿势的频率以及由母猪结束哺乳的频率差异显著(P＜0.05)，其他母性行为在基因型间差异不显著(P＞0.05)(崔世泉,李剑虹,崔卫国,等.母猪哺乳初期的母性行为与催乳素受体基因多态性关系的初探[J].HEREDITAS(Beijing).2007,29(1):47-51.)。

Chiang等(2002年)运用小鼠作为模型动物，研究对母猪母性行为选择的相关反应，结果表明小鼠花费在建窝、哺育幼仔、舔舐幼仔、找回幼仔、与幼仔一起休息的时间比率的遗传力均为0.20左右，并且它与断奶幼鼠数量的遗传相关达0.78，这说明行为指数也具有相对较高的遗传力(Chiang C H,Johnson R K,NielsenM K.Selection for maternal behaviour in mice-direct and correlated responses[J].Appl Anim Behav Sci,2002,79:311-323.)。

随分子生物学及遗传学研究手段、研究方法不断进步，筛选和定位与复杂行为相关的基因已成为可能，分子标记辅助选择是提高选择效率、加快育种进度的好方法。因此从分子水平开展遗传学研究工作将成为湖羊母性行为研究的一个新领域。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于湖羊母性行为分子标记辅助选择的引物及辅助选择方法。

本发明所提供的湖羊母性行为分子标记辅助选择方法，是检测湖羊PRLR基因外显子10的第284位和第339位核苷酸为C还是突变为T，确定湖羊的基因型，再通过基因型对湖羊母性行为进行辅助选择；所述PRLR基因外显子10的核苷酸序列为GENBANK ACCESSION NUMBER为FJ901298.1的第1至891位核苷酸；

所述确定湖羊的基因型的方法为：若湖羊PRLR基因第10外显子的第284位和339位核苷酸均为C时，其纯合体的基因型为AA；若第284位和第339位核苷酸均为T时，其纯合体基因型为BB；它们的杂合体基因型为AB；

通过基因型辅助选择湖羊母性行为的标准为：所述AA基因型湖羊的母性行为舔舐和哺乳行为(优良母性行为)观察值高于AB和BB基因型湖羊，而AA基因型湖羊的母性行为踩踏和拒绝哺乳行为(不良母性行为)观察值低于AB和BB基因型湖羊。

所述方法中，检测湖羊PRLR基因第10外显子的第284位和第339位核苷酸为C还是突变为T的方法是利用PCR方法扩增待测湖羊PRLR基因外显子10的核苷酸序列为GENBANK ACCESSION NUMBER为FJ901298.1的第224至456位的核苷酸片段。将该扩增产物进行单链构象多态法检测，若得到3条电泳条带，即为AB基因型，得到分别与所述AB基因型电泳方向第一条电泳带和第三条电泳带具有相同迁移距离的两条电泳条带的为BB；若与AB基因型的第二和第三条的迁移距离一致的为AA基因型。

本发明所述用于湖羊母性行为分子标记辅助选择的引物对，其序列如序列表中序列1和序列2所示。

所述方法中，所述母性行为观察值为运用监控设备记录湖羊分娩期间的一系列母性行为，再通过视频观察所记录的数据。

本发明方法，采用单链构象多态(single strand conformation polymorphism,SSCP)方法对在PRLR基因第10外显子部分进行单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism,SNP)检测，从而比较PRLR基因第10外显子在湖羊中的多态性，并对具有SSCP多态性的PCR扩增产物进行测序比较分析，需找到与母性行为相关的遗传标记，数据统计结果表明，该遗传标记可评价湖羊的母性行为。本发明的方法即利用该遗传标记，建立SSCP检测湖羊群体的基因型，并利用该基因型评价其母性行为的有效方法，实验证明，该方法结合了监控设备的使用，可迅速、简便的检测和评价湖羊的母性行为。本发明为湖羊的分子育种提供了一个准确简便的评价其母性的方法，并为其他羊品种的母性评价提供借鉴。

附图说明

图1为PRLR基因外显子10对应部分引物(P2、P3)扩增结果，其中M-PBR322marker。

图2为引物3扩增片断的SSCP分析，其中1、2、4为AB型；3为AA型；5、6、7为BB型。

图3为舔舐行为的标准正态分析图。

图4为哺乳行为的标准正态分析图。

图5为踩踏行为的标准正态分析图。

图6为拒绝哺乳的标准正态分析图。

具体实施方式

下述实施例中提到的试验方法，如无特别说明均为常规方法。

所述母性行为中，舔舐和哺乳行为为优良母性行为，踩踏和拒绝哺乳为不良母性行为。

实施例1评价湖羊母性行为的方法的建立及应用效果验证

1材料与方法

1.1实验材料

选用2011年12月2012年到1月份期间分娩的湖羊作为研究对象，共81头，其中63头参与母性行为的关联分析。全部来自苏州种羊场。

1.2行为观察及行为观察数据的设定

选择有试验记录的湖羊母羊63头，提前将其安排在固定羊舍，做好相应记录。在羊预产期来临前将监控设备安装调试好，在羊分娩前进行预实验，以确保视频可正常观察及储存。实验所用的汉邦高科16路录像机以及索尼芯片的摄像头均由汉邦高科公司提供。每个个体的录像资料进行连续观察。

表1产仔后观察时间表

观察行为性状包括：

①舔舐：母羊用唇部或舌尖对出生后的仔羊头部、耳朵、背部等身体进行舔舐。

②哺乳：母羊愿意给仔羊哺乳，并帮助仔羊寻找到乳头。

③拒绝哺乳：母羊拒绝给仔羊哺乳，或当仔羊靠近母羊欲吃奶时，母羊不是把后躯暴露给仔羊，而是采用“头对头”的姿势令仔羊无法接触到乳房。或者母羊强行中断仔羊的哺乳行为后不进行其他有意义的行为。

④踩踏(顶撞、踢蹴仔羊)：母羊因乳房肿胀疼痛或其他原因，当仔羊接近时，表现为顶撞或踢蹴仔羊。

注：舔舐和哺乳行为为优良母性行为，拒绝哺乳和踩踏(顶撞、踢蹴仔羊)为不良母性行为；

以上所有行为完成的计“1”，未完成的或者被中断的不记录。

1.3DNA提取

湖羊耳组织样：苏州种羊场分娩母羊81只。采用酚-氯仿法抽提绵羊的基因组DNA，灭菌TE溶解稀释后–20℃保存备用。在实际分析时采用有完整行为记录的个体。

1.4主要试剂

PCR10×buffer，dNTP，Taq DNA聚合酶，DNA Ladder Marker等均购自上海生物工程公司。

1.5引物的设计和产物的扩增

根据Bignon等(Bignon C,Binart N,Ormandy C,Etal.Long and short forms ofthe ovine prolactin receptor:cDNA cloning and genomic analysis reveal that the twoforms arise by different alternative splicing mechanisms inruminants and in rodents[J].J Mol Endocrinol,1997,19(2):109-120.)发表的绵羊PRLR mRNA序列(GNEBANK ACCESSION NUMBER为AF041257)和Terhi Iso-Touru等发表的绵羊PRLR外显子10序列(GNEBANK ACCESSION NUMBER为FJ901298.1)(Terhi,Iso-Touru,Juh,etal.Divergent evolution in the cytoplasmic domains of PRLR andGHR genes in Artiodactyla[J].BMC Evolutionary Biology，2009,9:172.)，设计4对引物。其中P1扩增片段为GNEBANK ACCESSION NUMBER为FJ901298.1的第366-561位核苷酸序列；P2扩增片段为GNEBANK ACCESSION NUMBER为AF041257的第1362-1630位核苷酸序列；P3扩增片段为GNEBANK ACCESSIONNUMBER为FJ901298.1的第224-456位核苷酸序列；P4扩增片段为GNEBANKACCESSION NUMBER为FJ901298.1的第486-805位核苷酸序列。

表2绵羊催乳素受体基因PCR-SSCP分析选用的引物

各引物反应体系为20ul，其中包括10×Buffer；2.5mmol/ldNTPs.2.5ul；上下游引物各1ul；5U/ul Taq DNA聚合酶0.3ul、DNA模板1ul，其余用ddH₂O补齐。

1.6PCR反应条件

94℃预变性10min；94℃变性30s；退火30s(4对引物的退火温度分别为61.7℃、56.7、57.8℃、59.1℃)；72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。各引物反应体系依照各自PCR反应条件反应结束后，PCR扩增产物用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离结合硝酸银染色法检测，染色后的凝胶利用Kodak凝胶成像系统复制保存，利用Kadak Digitial SienceID Image Analysis Software根据标准PBR322/Msp ⅠMarker计算扩增片段的大小。

1.7PCR-SSCP分析

取7μl PCR产物加3μl上样缓冲液(0.05%二甲苯兰；0.05%溴酚兰；0.02mol/LEDTA，加甲酰胺至10ml)，98℃变性15min，然后迅速插入碎冰中，使之保持变性状态。变性10分钟后PCR产物在10%非变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr∶Bis=29∶1)中电泳。室温下250V压8min后调至110V电泳10h，银染显色。

1.8测序

SSCP分析后，选取不同基因型的样品进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳验证后送公司测序。测序反应由生工生物工程(上海)有限公司完成。

1.9数据分析

1.9.14种母性行为的正态分布检验

鉴于母性行为未必符合正态分布，故首先通过SPSS软件，对4种母性行为进行正态分析。

1.9.23种基因型与4种母性行为之间的多个独立样本的非参数检验

通过SPSS软件进行3种基因型与4种母性行为之间进行多个独立样本的非参数检验。

2结果与分析

2.1PCR扩增

将所设计的4对引物用于PCR扩增，其扩增产物经非变性聚丙稀酰胺凝胶检测，与所设计引物大小相符(图1)，产物浓度较好，可以进行SSCP分析。

2.2SSCP电泳结果

对4对引物扩增的PCR产物分别进行SSCP分析，发现仅引物3的扩增片段具有多态性(P3扩增片段为GNEBANK ACCESSION NUMBER为FJ901298.1的第224-456位核苷酸序列)，其余引物的扩增片段不存在多态性。分别定义为AA、AB、BB基因型(图2)。

2.3序列分析

取AA、AB和BB3种基因型的PCR产物进行测序。结果显示与原序列相比AA型序列未发生突变，AB型在绵羊催乳素受体外显子10的GNEBANK ACCESSIONNUMBER为FJ901298.1第337和339位均发生核苷酸C→T突变，BB型除第339位发生C→T突变外，在284位也发生C→T突变。其中AB型是两个突变使得脯氨酸突变成丝氨酸；BB型中284位的C→T突变，使脯氨酸突变成亮氨酸，但339位的C→T突变未发生氨基酸突变，为沉默突变。

上述结果表明，引物P3具有多态性，共有AA、AB和BB三种基因型。其中AA基因型扩增得到的核苷酸序列如序列3所示，AB基因型的扩增的得到的核苷酸序列如序列4所示，BB基因型的扩增的得到的核苷酸序列如序列5所示。

2.4催乳素受体外显子10基因在湖羊中的遗传多态性

表3中可知引物3对应湖羊群体实际基因型频率以及理论基因型频率。通过χ²测验知其符合Hardy-Weinberg平衡。

表3湖羊PRLR基因等位基因频率和基因型频率

2.5湖羊四个母性行为的正态分析

由图3－6可知湖羊的四个母性行为均不服从正态分布（与直线完全重合的为标准正态分布，否则视为不符合标准正态分布）。

2.6PRLR基因与四种母性行的为多个独立样本的非参数检验

由于四种母性行为并不符合正态分布，所以采用多个独立样本的非参数检验。表4和表5分别为PRLR基因与四种母性行为的独立样本的平均值，PRLR基因与四种母性行为的独立样本的非参数检验的结果。

表4PRLR基因与四种母性行为的独立样本的平均值

表5PRLR基因与四种母性行为的独立样本的非参数检验的结果

由表4可知对于舔舐和哺乳行为(优良母性行为)的观察值AA基因型湖羊个体最高，AB型个体次之，BB型个体再次。而对于踩踏和拒绝哺乳行为(不良母性行为)的观察值BB基因型个体最高，AB型个体次之，AA型个体再次。表5可知基因型AA、AB和BB三种基因型与舔舐、哺乳和踩踏等母性行为之间均有极显著差异(P<0.01)，只有与拒绝哺乳行为之间无明显的相关关系(P>0.05)。故结果表明可利用P3扩增片段的基因型多态性评价湖羊母性行为，进行分子标记辅助选择。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  扬州大学

 

<120>  用于湖羊母性行为分子标记辅助选择的引物及辅助选择方法

 

<130> 

 

<160>  11   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

tgtctgaaaa gtgtgatgaa                                                 20

 

 

<210>  2

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

agcaatgttg tggtaagaat a                                               21

 

 

<210>  3

<211>  233

<212>  DNA

<213>  绵羊属(ovis hircus)

 

<400>  3

tgtctgaaaa gtgtgatgaa cctcaggcct atccctccaa gttccacatt ccggagggcc     60

 

ctgagaagct ggaggatccc aaaacaaatc atacatgtct ccaggcccct cagagcacaa    120

 

gtggggaagg caaaatcccc tattttctgg ccaacggacc caaatcttcc acatggcctt    180

 

tcccgcagcc ccccagcctg tacagcccca gatattctta ccacaacatt gct           233

 

 

<210>  4

<211>  233

<212>  DNA

<213>  绵羊属(ovis hircus)

 

<400>  4

tgtctgaaaa gtgtgatgaa cctcaggcct atccctccaa gttccacatt ccggagggcc     60

 

ctgagaagct ggaggatccc aaaacaaatc atacatgtct ccaggcccct cagtgtacaa    120

 

gtggggaagg caaaatcccc tattttctgg ccaacggacc caaatcttcc acatggcctt    180

 

tcccgcagcc ccccagcctg tacagcccca gatattctta ccacaacatt gct           233

 

 

<210>  5

<211>  233

<212>  DNA

<213>  绵羊属(ovis hircus)

 

<400>  5

tgtctgaaaa gtgtgatgaa cctcaggcct atccctccaa gttccacatt ccggagggcc     60

 

ttgagaagct ggaggatccc aaaacaaatc atacatgtct ccaggcccct cagtgcacaa    120

 

gtggggaagg caaaatcccc tattttctgg ccaacggacc caaatcttcc acatggcctt    180

 

tcccgcagcc ccccagcctg tacagcccca gatattctta ccacaacatt gct           233

 

 

<210>  6

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

ttttctggcc aacggaccca a                                               21

 

 

<210>  7

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

cccgccagtc tcaatggtt                                                  19

 

 

<210>  8

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

aggcaccaca gccactct                                                   18

 

 

<210>  9

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  9

gggcgtcaac cttctcat                                                   18

 

 

<210>  10

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  10

aggcaccaca gccactct                                                   18

 

 

<210>  11

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  11

tgttgctatc cgtcaccc                                                   18

 

 

Claims (2)

1.一种湖羊母性行为分子标记辅助选择方法，是检测湖羊PRLR基因外显子10的第284位和第339位核苷酸为C还是突变为T，确定湖羊的基因型，再通过基因型对湖羊母性行为进行辅助选择；所述PRLR基因外显子10的核苷酸序列为GENBANK ACCESSION NUMBER为 FJ901298.1的第1至891位核苷酸；

所述确定湖羊的基因型的方法为：若湖羊PRLR基因外显子10的第284位和339位核苷酸均为C时，其纯合体的基因型为AA；若第284位和第339位核苷酸均为T时，其纯合体基因型为BB；它们的杂合体基因型为AB；

通过基因型辅助选择湖羊母性行为的选择标准为：所述AA基因型湖羊的舔舐和哺乳行为高于AB和BB基因型湖羊，AA基因型湖羊的踩踏和拒绝哺乳行为低于AB和BB基因型湖羊。

2.一种用于权利要求1所述湖羊母性行为分子标记辅助选择的引物，其特征在于该引物的序列为序列表中序列1和序列2。

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