CN104593363A - 一种肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记，是鸡plin1基因单核苷酸多态性序列上的多态性位点，该位点是在plin1基因序列第八外显子的第49位为A或T的碱基多态性位点，表现为AA、AT或TT三种基因型，其中TT型为肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记。本发明还公开了所述标记在辅助筛选或预测具备优良屠宰性状的肉食鸡品种中的应用。实验证实：特异型酶切位点的多态性与生产性能之间具备相关性，基因型为TT的个体各项测量指标均高于基因型为AA和AT的个体，提示基因型为TT的个体可以作为种鸡来培育具有优良屠宰性状的品种鸡。

Description

一种肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记及其应用

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，涉及一种肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记及其在辅助筛选或预测具备优良屠宰性状的肉食鸡品种中的应用。

背景技术

DNA标记，又称DNA多态性标记、DNA分子标记，是DNA水平上遗传多态性的直接反映，也是遗传标记的重要组成部分。DNA分子标记与形态标记、细胞学标记和蛋白质标记相比具有很多优点：不受环境条件的影响，不受发育阶段的限制，也不受个体和生物组织器官的限制；同时基因组DNA变异非常丰富，可供选择的分子标记数量大大超过形态标记、细胞学标记和蛋白质标记的数量。单核苷酸多态性标记(single nucleotide polymorphism,SNP)是DNA遗传标记中的一种类型，是同一物种不同个体基因组DNA的等位序列上单个核苷酸存在差别的现象，属于最为常见的一种遗传变异。SNPs在生物基因组中的分布是不均匀的，主要表现为在非编码区多于编码区，同义突变的概率低于其他方式突变的概率。SNPs在生物学诸多领域的研究中具有特殊的应用价值，如基因组结构与功能的阐明、遗传改良操作、生物遗传多样性分析、基因连锁图谱构建和关联分析等。随着相关检测技术的不断创新及完善，SNP作为一类新型的分子标记方法将拥有更广阔的发展空间。目前SNPs的检测和筛选方法大致可以分为两类：一类是直接查找法，即运用现代生物信息学手段，从已有的核苷酸数据库中寻找SNPs；另一种是实验法，又可分为四种类型，即直接测序法、DNA分子构象法、基因芯片技术以及限制性酶切法。其中使用限制性酶切检测SNPs具备了简便、快速、灵敏和经济的特点，非常适用于大批量样品的分析。其核心在于正确选择所使用合适的内切酶，使得基因中的单碱基改变通过琼脂糖凝胶电泳中的片段差异体现出来，就可以初步获悉基因的单核苷酸多态性特征。

在多种生物中，plin基因编码的脂滴包被蛋白(perilipin，PLIN)属于脂滴包被蛋白PAT家族中最具代表性的一员，是一种受激素调控的包被在脂滴表面含量最为丰富的可磷酸化蛋白。它参与了调节脂肪细胞内脂质代谢的过程，对于脂滴内甘油三酯的储存和动员具有关键性的调节作用。在基础状态下，PLIN蛋白可以保护脂滴内的脂质免于脂肪组织三酰甘油水解酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)和激素敏感脂酶(hormoral sensentive lipase，HSL)的降解；在儿茶酚胺等激素的刺激下PLIN蛋白发生磷酸化，从而使脂滴暴露于ATGL和HSL下，加快脂解；同时，PLIN蛋白还介导了HSL向脂滴内的转运过程，并与脂滴核心的酯类结合，从而增加了脂解程度。目前,对PLIN蛋白的研究证明该蛋白对多种生物的脂质代谢和脂肪性状形成有重要的调控作用。敲除了plin基因的小鼠脂肪组织明显减少，肌肉组织增加，并且高脂饮食导致的肥胖被明显抑制；plin被视为人类动脉粥样硬化噬斑稳定性的分子标志，其mRNA在严重肥胖者的皮下脂肪组织明显低于非肥胖组织；plin基因的突变在糖尿病发生过程中与男人体质量的降低有关，可能增加女人糖尿病的患病风险；人类plin基因的SNPs位点对白人的肥胖和动脉粥样硬化风险有重要的遗传决定性；同时，plin的SNPs对于牛和鸡等生物的脂肪沉积和脂肪形状形成具有重要影响，可以作为影响肉质的候选基因用于肉牛和肉鸡的评价与育种研究。

脂肪性状是评价鸡肉品质的重要指标，此类性状的发育会直接影响其商品性能。因此，调控脂肪性状发育基因的SNPs的表征对于通过肉鸡的分子育种和辅助选择提高其生产性能具有十分重要的作用。但经检索，目前plin1基因SNPs作为遗传标记，特别是作为肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记应用于筛选或预测具备优良屠宰性状的肉食鸡品种还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记及其在辅助筛选或预测具备优良屠宰性状的肉食鸡品种中的应用。

本发明所述的肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记是鸡plin1基因单核苷酸多态性序列上的多态性位点，其特征在于：所述鸡plin1基因单核苷酸多态性序列的多态性位点是在plin1基因序列第八外显子的第49位为A或T的碱基多态性位点，表现为AA、AT或TT三种基因型，其中TT型为肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记。

本发明所述肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记在辅助筛选或预测具备优良屠宰性状的肉食鸡品种中的应用。

上述应用的具体方法是：以待检测鸡plinl基因组DNA为模板，以引物对plin1E8F/E8R进行PCR扩增，扩增完成后进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用特定的限制性核酸内切酶对扩增出的目的片段进行酶切；之后对酶切产物再一次进行琼脂糖凝胶电泳，来检测酶切产物的片段大小，分析确定鸡plin1基因的碱基多态性位点，当plin1基因序列第八外显子的第49位为A或T，且基因型为TT型时，即可判定待检测鸡品种为具有优良屠宰性状的品种鸡；

其中：

所述引物对plin1E8F/E8R的核苷酸序列为：

plin1E8F：CATAAAGGCGAGGCAAAGGTTC；

plin1E8R：CACGGATGGACAGATGGACAA；

所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性4-5min；94℃变性30-35s，55-61℃退火30-35s，72℃延伸1min,28-35个循环，最后72℃延伸10min，并置于4℃保存；

所述特定的限制性核酸内切酶为：NspI、BstNSI、NspHI、PauAI或PunAII，其酶切作用位点为扩增出目的基因中的以下序列：5’…RCATG^↓Y…3’或3’…Y_↑GTACR…5’。

上述方法优选的实施方式是：对于plin1E8F/E8R引物对来说，PCR扩增程序为：95℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min,35个循环，最后72℃延伸10min，并置于4℃保存。所述特定的限制性核酸内切酶为：NspI、BstNSI或NspHI。

本发明利用限制性核酸内酶切的方法快速筛查鸡plin1基因第八外显子位点上的错义突变产生的单核苷酸多态性进行检测，通过对鸡品种的SNP进行基因分型和基因频率分析，同时对酶切多态位点与鸡生长性状之间进行关联分析，寻找与鸡生长性状相关的SNPs作为分子标记，并以该功能SNPs作为肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记，在辅助筛选或预测具备优良屠宰性状的肉食鸡品种中广泛应用，加快了良种鸡的选育速度和提高种群品质。

本发明通过以SNP位点为酶切位点，选择合适的特异性核酸内切酶，然后根据SNP突变后酶切出的DNA片段大小不同来确定鸡plin1基因单核苷酸多态性特征。

根据鸡plin1基因单核苷酸多态性特征，本发明确定鸡plin1基因单核苷酸多态性序列的多态性位点是在plin1基因序列第八外显子的第49位为A或T的碱基多态性位点，表现为AA、AT或TT三种基因型，其中TT型为肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记标的。实验发现：AA、AT或TT三种基因型的鸡在产肉率以及肉质优化等方面都有很大差别，TT型鸡屠宰性状(产肉率以及肉质)明显优于AA、AT两种类型，所以该基因型的雏鸡可以作为具备优良屠宰性状的种鸡来培育，这也肯定了基因型为TT的鸡可以作为种鸡来培育具有优良屠宰性状的品种鸡的可实施性。本发明应用方法简单、快速、低成本、便于推广应用，可广泛应用于鸡的辅助选择和分子育种中，将为培育出高产优质肉性状的优良品种提供支持。

附图说明

图1为本发明所述肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记的实际应用流程示意图。

图2为本发明扩增的鸡的plin1编码基因结构示意图与第八外显子序列。

其中，第八外显子的49位核苷酸用下划线及黑体放大字母示意。在野生基因中，第49位核苷酸为A，突变基因中为T。

图3为本发明中部分样品PCR产物经特异性酶切筛查到的鸡plin1基因序列琼脂糖凝胶电泳结果图。

其中，AA为未突变型，AT为杂合突变型，TT为纯合突变型。

具体实施方式

本发明首先根据鸡plin1基因的保守序列设计引物，以不同品种鸡基因组DNA为模板，进行PCR扩增，测序。然后，进行特异性酶切，并将酶切结果的琼脂糖凝胶电泳图和序列比对筛查出不同品种鸡plin1基因SNP位点。然后，根据在群体中检测到的基因型，进行群体遗传统计分析和生长性状的关联分析，筛选出与鸡生长性状密切相关的分子标记。最后，利用获得的分子遗传标记在辅助筛选或预测具备优良屠宰性状的肉食鸡品种中应用，将筛选到的拥有与鸡优异屠宰性状相关分子标记的鸡作为种鸡进行培养，以期繁殖更多的优质鸡。下面对本发明做详细说明，所述内容是对本发明的解释而不是限定。

实施例1：不同品种鸡plin1基因部分DNA序列的克隆

1、鸡血的采集及处理：随机抽取无病健康鸡，包括1478只鲁禽1号鸡、616只鲁禽3号鸡以及68只石歧杂鸡，由翅下静脉采血，EDTA做抗凝处理。

2、基因组DNA的提取：利用Tiangen血液DNA提取试剂盒提取DNA。使用200μL新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，加入20μL蛋白酶K溶液，混匀；然后加入200μL缓冲液GB，混匀后70℃放置10分钟；加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀，此时会出现絮状沉淀；将所得溶液和絮状沉淀全部转移到放入收集管中的吸附柱CB3中，12000rpm离心30秒并弃废液；加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30秒并弃废液；加入700μL漂洗液PW(使用前加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒并弃废液，并重复该步骤两次；彻底除尽吸附材料中的漂洗液之后，使用水或洗脱液TE将所得DNA产物尽可能的洗脱下来。

3、扩增引物设计：根据NCBI数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)鸡的GenBank登录号为：NM-001127439的plin1基因的外显子序列，以该基因序列保守区序列为参考设计PCR引物对，其引物对序列如下：

上游引物：CATAAAGGCGAGGCAAAGGTTC

下游引物：CACGGATGGACAGATGGACAA

该引物扩增了plin1基因第八外显子702bp序列。

4、PCR扩增鸡plin1基因外显子：以鸡的DNA为模版，用上述设计的引物对进行PCR扩增，PCR总反应体系为30μL，见表1；PCR总反应程序，见表2。

表1PCR反应体系

表2 在适用范围内最佳的PCR反应程序

实施例2：使用NspI、BstNSI和NspHI酶对实施例1中PCR产物进行特异性酶切

1.使用NspI、BstNSI和NspHI酶对目的基因进行特异性酶切。这类特异性酶的作用位点是：5’…RCATG^↓Y…3’或3’…Y_↑GTACR…5’。

2.酶切反应体系见表3。

表3NspI酶切反应体系

按照上述体系将反应体系各溶液混匀后，放置于37℃恒温水浴中反应3-5h，使酶切反应充分进行，之后进行后续试验。

3.对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。然后根据不同的酶切结果将所有的样品进行分类总结，归纳出不同的类型。

酶切结果有三种，分别是SNP位点完全突变、杂合突变以及完全没有突变的。在这三种情况下，第一种完全不能被NspI(BstNSI或NspHI)酶切，所对应的琼脂糖凝胶电泳图，每个泳道只有单一条带，其大小与PCR获得的目的基因大小一致；第二种则是部分能被酶切，琼脂糖凝胶电泳能够得到三条条带，其中最长的一条大小与目的基因一致，另外两条则稍短；第三种能够被完全酶切，得到两条条带，其大小与第二种类型中两条稍短的一致。即在下面序列中用方框标出的核苷酸位点是多态位点，该位点存在A/T两种基因型，当基因型为A时，内切酶不起作用，当基因型为T时，内切酶可以将PCR产物切成不同长度的两个片段。

CAGCAAGACAGCCCTGAG

实施例3：本发明制备的分子遗传标记在不同鸡群体多态性中的诊断应用

1、群体多态性中的诊断：利用上述SNP多态性检测方法对616份鲁禽3号鸡、1478份鲁禽1号鸡以及68份石歧杂鸡plin1基因进行特异性酶切检测。

2、SNP位点的频率统计分析：

基因型频率是指一个群体中某特定基因型个体的数目占个体总数目的比率。Paa＝Aaa/N，其中Paa代表某一位点的AA基因型频率，Aaa表示群体中具有AA基因型的个体数，N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：PA＝(2NM+NA_al+NA_a2+......+NA_an)/2N。式中，PA表示等位基因A频率，NM表示群体中具有AA基因型的个体数量，A_al-an为等位基因A的n个不同的复等位基因。统计结果见以下表格(见表6、表7和表8)。

表6 鲁禽3号鸡plin1基因多态位点的基因型和等位基因频率

表7 鲁禽1号鸡plin1基因多态位点的基因型和等位基因频率

表8 石歧杂鸡plin1基因多态位点的基因型和等位基因频率

3、基因效应的关联分析

采用PASW(18.0)统计软件，对鲁禽3号鸡及石歧杂鸡不同基因型个体与体尺数据进行了显著性检验。(见表9和表10)。

(1)测定的主要性状包括：宰前活重、屠体重、屠宰率、半净膛重、全净膛重、半净膛率、全净膛率、胸肌重、胸肌率、腿肌重、腿肌率、腹脂重、腹脂率、皮脂厚、肌脂宽等。

(2)测定的群体：随机抽取健康无病鲁禽3号鸡616只及石歧杂鸡68只分别进行分析。

表9 鲁禽3号鸡plin1E8多态性与屠宰性状的关联分析

表10 石歧杂鸡plin1E8多态性与屠宰性状的关联分析

注：基因型上标中的字母显示不同基因型之间的差异，具有相同字母表示两种基因型之间差异不显著(P>0.05)，字母不同表示两种基因型之间差异显著(P<0.05)，没有标记的表明该基因型与其他基因型之间没有显著差异。

分析显示，在鲁禽3号中基因型为TT的纯合型与基因型为AT的杂合型的宰前活重、屠体重、半净膛、全净膛重差异显著；在石歧杂鸡中基因型为TT的纯合型与基因型为AA的杂合型的宰前活重和屠体重差异显著，即在两种不同的鸡中，均为TT基因型的宰前活重、屠体重、半净膛、全净膛重数值最大。统计结果从数值上直观地体现出基因型为TT的鸡其屠宰性状明显优于其他两种类型，可以作为种鸡应用到优异品种鸡的筛选与育种中。

实施例5：本发明制备的分子遗传标记在鲁禽1号鸡实际育种中的应用

通过本发明分析的1478只鲁禽1号鸡中，基因型为TT型的鸡共262只，其中雄鸡63只，雌鸡199只。目前，这262只拥有与优质屠宰性状相关分子标记的鸡已经作为种鸡，投入到了实际生产之中，辅助优异品种鸡的筛选与育种。

Claims (5)

1.一种肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记，该标记是鸡plin1基因单核苷酸多态性序列上的多态性位点，其特征在于：所述鸡plin1基因单核苷酸多态性序列的多态性位点是在plin1基因序列第八外显子的第49位为A或T的碱基多态性位点，表现为AA、AT或TT三种基因型，其中TT型为肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记。

2.权利要求1所述肉食鸡的优良屠宰性状分子遗传标记在辅助筛选或预测具备优良屠宰性状的肉食鸡品种中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，方法是：以待检测鸡plinl基因组DNA为模板，以引物对plin1E8F/E8R进行PCR扩增，扩增完成后进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用特定的限制性核酸内切酶对扩增出的目的片段进行酶切；之后对酶切产物再一次进行琼脂糖凝胶电泳，来检测酶切产物的片段大小，分析确定鸡plin1基因的碱基多态性位点，当plin1基因序列第八外显子的第49位为A或T，且基因型为TT型时，即可判定待检测鸡品种为具有优良屠宰性状的品种鸡；

其特征在于：

所述引物对plin1E8F/E8R的核苷酸序列为：

plin1E8F：CATAAAGGCGAGGCAAAGGTTC；

plin1E8R：CACGGATGGACAGATGGACAA；

所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性4-5min；94℃变性30-35s，55-61℃退火30-35s，72℃延伸1min,28-35个循环，最后72℃延伸10min，并置于4℃保存；

所述特定的限制性核酸内切酶为：NspI、BstNSI、NspHI、PauAI或PunAII，其酶切作用位点为扩增出目的基因中的以下序列：5’…RCATG^↓Y…3’或3’…Y_↑GTACR…5’。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：对于plin1E8F/E8R引物对来说，PCR扩增程序为：95℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min,35个循环，最后72℃延伸10min，并置于4℃保存。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述特定的限制性核酸内切酶为：NspI、BstNSI或NspHI。